k第十一章抗生素類藥物分析

第十一章抗生素類藥物分析

Chapter11TheAnalysisof

Antibiotics

藥物分析課件系列INDEXContentsFundamentalRequirementSection1introductionSection2β-lactamantibioticsSection3AminoglycosidesantibioticsSection4TetracyclineantibioticsSection5QualityresearchofAntibioticsSummaryThestructures,properties,identificationandassayofβ-lactamAntibiotics;

β-內(nèi)酰胺抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、鑒別試驗(yàn)與含量測定；ContentThestructures,chemicalproperties,andassayofaminoglycosidesandimpuritytestsofstreptomycinBandgentamycincomponentC;

氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)化學(xué)性質(zhì)、鑒別試驗(yàn)、含量測定及鏈霉素B雜質(zhì)檢查慶大霉素Ｃ組分測定；Thestructures,identification,specialimpuritytestsandassayoftetracyclines;

四環(huán)素類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)、鑒別試驗(yàn)、含量測定及鹽酸四環(huán)素中特殊雜質(zhì)檢查;

Thequalityresearchreviewofantibiotics抗生素類藥物質(zhì)量考察研究。.FundamentalRequirements掌握本類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)理化性質(zhì)，主要鑒別試驗(yàn)及主要含量測定方法；

Masteringthestructures,physicalandchemicalproperties,primaryidentificationtestsandassaymethodsofantibiotics.了解典型抗生素有關(guān)雜質(zhì)的分離研究進(jìn)展。

Understandingthedevelopmentofrelevantsubstanceresearchfortypicaldrugs.

Section1Introduction

Definition

抗生素(antibiotics)是指某些微生物代謝產(chǎn)生的，在很低的濃度即可對某些生物的生命活動有特異抑制或殺滅作用的化學(xué)物質(zhì)。

Classification

抗生素β-內(nèi)酰胺類抗生素四環(huán)素類抗生素氨基糖苷類抗生素大環(huán)內(nèi)酯類抗生素氯霉素類抗生素青霉素及半合成青霉素類頭孢菌素及半合成頭孢菌素類其他抗生素青霉素、氨芐西林、阿莫西林、青霉素V頭孢噻吩鈉、頭孢氨芐、頭孢哌酮鈉金霉素、土霉素、四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素、鹽酸美他環(huán)素鏈霉素、卡那霉素、慶大酶素、新酶素鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素紅霉素、麥迪霉素、螺旋霉素氯霉素、甲砜霉素鹽酸林可霉素、磷霉素

抗生素在質(zhì)量控制上的特殊性.

生產(chǎn)的特殊性性質(zhì)的特殊性(穩(wěn)定性差)

質(zhì)量問題

化學(xué)純度低,三多:同系物多(G),異構(gòu)體多(P),降解物多(T)

抗生素理化測定法與微生物測定法的關(guān)系.

微生物測定法:用抗生素對微生物的殺傷和抑制程度為指標(biāo)來衡量抗生素的效價(jià)(potency).

原理:對數(shù)劑量和反應(yīng)成直線,用管碟瓊脂擴(kuò)散法.

特點(diǎn)

理化測定法:根據(jù)抗生素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),利用其特有的化學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)而建立的方法.

特點(diǎn)

Section2β-LactamAntibiotics

StructureandCharacteristics

β-內(nèi)酰胺類抗生素是指分子中含有四個(gè)原子組成的β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素。β-內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素發(fā)揮生物活性的必須基團(tuán),由四個(gè)原子組成的，其分子張力比較大，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易發(fā)生開環(huán)導(dǎo)致失活。Identificationtest

鉀鈉鹽的火焰反應(yīng)Flamereactionβ-內(nèi)酰胺類藥品中許多為鉀鹽和鈉鹽，可用此反應(yīng)進(jìn)行鑒別呈色反應(yīng)Colorreaction

羥肟酸鐵反應(yīng)堿性環(huán)境中與羥胺作用β-內(nèi)酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸在稀酸中與高鐵離子呈色.2.硫酸硝酸呈色反應(yīng)頭孢菌素類可與之反應(yīng)呈色，機(jī)理多不明.茚三酮反應(yīng)

α-氨基酸的反應(yīng),如氨芐西林與斐林試劑反應(yīng)分子中具有(-CONH-)結(jié)構(gòu)，可使堿性酒石酸銅還原顯紫色,如阿莫西林5.其他呈色反應(yīng):如重氮苯磺酸呈色反應(yīng)Orangeyellow

沉淀反應(yīng)Precipitationreaction

1.在稀鹽酸中生成白色沉淀：青霉素鉀(鈉)白色游離基沉淀2.有機(jī)胺鹽的特殊反應(yīng)：

A. 重氮化偶合反應(yīng)：如普魯卡因青霉素

B. 與三硝基苯酚的反應(yīng)：如芐星青霉素加水溶解加稀鹽酸

＋

光譜法Spectroscopy1. 紫外分光光度法(UV)a. 最大吸收波長鑒定法

b. 水解產(chǎn)物的最大吸收波長鑒定法2. 紅外吸收光譜法(IR)3. 核磁共振光譜(HMR)

色譜法Chromatography1. 薄層色譜法(TLC)2. 高效液相色譜法(HPLC)IRspectrumofphenoxymethylpenicillinpotassium.ObtainedasaKBrdisc.

Assay

IodometrictitrationPrinciple：青霉素或頭孢菌素分子不消耗碘，其降解產(chǎn)物消耗碘，例如青霉素族經(jīng)水解后產(chǎn)生青霉噻唑酸可與碘作用，根據(jù)消耗的碘量計(jì)算青霉素的含量。Reactionprocess:Note：

一般認(rèn)為碘與青霉素噻唑酸的作用以pH4.5溫度24~26℃為最好；

青霉素的降解產(chǎn)物等雜質(zhì)亦可消耗碘而影響測定結(jié)果，可以用未經(jīng)水解的樣品液作；

在滴定近終點(diǎn)時(shí)放慢滴定速度，并強(qiáng)力振搖；如果滴定至終點(diǎn)時(shí)又反現(xiàn)藍(lán)色，說明真正的終點(diǎn)尚未到達(dá)；由于每摩爾青霉素能吸收較多摩爾的碘（1摩爾青霉素能消耗8摩爾碘），故本法的靈敏度較高。需作標(biāo)準(zhǔn)品對照試驗(yàn)；嚴(yán)格按規(guī)定操作。本試驗(yàn)含量計(jì)算公式：

含量%=××100%VTo－VT

CS×DVSo－VS

W式中：VTo、VSo：滴定供試品空白液和對照品空白液消耗的硫代硫酸鈉液(0.02mol/L),ml;VT、VS：滴定供試品和對照品消耗的硫代硫酸鈉液(0.02mol/L),ml;CS：對照品濃度，g/ml；W：供試品取樣量，g；D：供試品稀釋倍數(shù)。Thefirststep:(penicillin青霉素)

青霉噻唑二鈉

第2步反應(yīng)thesecondstepreaction：

Thesecondstep:+4I2+5H2O+2HCl

＋NaCl＋8HI＋汞量法(Mercurimetry)Principle：青霉素分子不與汞鹽反應(yīng)，而其堿性水解產(chǎn)物青霉噻唑酸及繼續(xù)水解生成的青霉胺都能與汞鹽定量反應(yīng)，根據(jù)消耗的汞鹽量可以計(jì)算青霉素的含量。

Hg2++2R-SH

(RS)2Hg+2H+

2.Method(potentiometrictitration)Indicatorelectrode:Pt;referenceelectrode：Hg-mercuroussulfateelectrode；Standardsolution：mercuricnitratesolution(0.02mol/L)3.討論：

a.

本次滴定只有一次突躍。但滴定曲線上出現(xiàn)兩個(gè)指示點(diǎn)，即兩次突躍。青霉素含量的計(jì)算系以第二次滴定終點(diǎn)為依據(jù)，此時(shí)青霉素與巰基汞化物的摩爾比為1︰1。

b.

水解必須完全。溶液的pH值和反應(yīng)時(shí)間直接影響水解的完全程度，水解如不完全，將使測定結(jié)果偏低。

c.

本法的空白試驗(yàn)的做法與碘量法類似，空白試驗(yàn)的目的也是為了消除供試品中可能存在的降解產(chǎn)物的干擾。

d.本法與碘量法比較主要優(yōu)點(diǎn)是不需要青霉素標(biāo)準(zhǔn)品作對照，汞鹽滴定液用EDTA標(biāo)定即可。

酸堿滴定法(Acid/basetitration)

Principle：青霉素或頭孢菌素的β-內(nèi)酰胺環(huán)可被堿水解，此水解系定量完成，可用于含量測定。如苯唑西林鈉在水溶液中加過量的氫氧化鈉滴滴定液水解后，產(chǎn)生的青霉噻唑酸被中和，再以鹽酸滴定液滴定剩余的氫氧化鈉液，以氫氧化鈉滴定液的消耗量求得苯唑西林鈉的含量。

UV

銅鹽法:青霉素族抗生素在弱酸性下的降解產(chǎn)物青霉烯酸具有紫外吸收特征。青霉烯酸在320~360nm處有最大吸收,但此水解產(chǎn)物不穩(wěn)定，可加Cu2+，與青霉烯酸形成較穩(wěn)定的螯合物，在320nm處有最大吸收。2. 汞鹽法:青霉素族抗生素在咪唑的催化下與氯化高汞能定量的反應(yīng)轉(zhuǎn)化呈相應(yīng)的青霉烯酸硫醇汞鹽，在324~325nm波長范圍內(nèi)有最大吸收。羥肟酸比色法青霉素族和頭孢菌素族抗生素能與羥胺作用生成羥肟酸衍生物，在烯酸中與高鐵離子生成紅色絡(luò)合物，在一定波長下測定吸收度而進(jìn)行定量。高效液相色譜法HPLC

填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相：磷酸氫二鈉、枸櫞酸溶液檢測波長：254nm保留時(shí)間：7.5min分離度：>4內(nèi)標(biāo)溶液：乙酰苯胺測定法：內(nèi)標(biāo)法計(jì)算：按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算中國藥典測定頭孢唑林鈉

第三節(jié)氨基糖甙類抗生素

Section3Aminoglycosidesantibiotics

本類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)都是以堿性環(huán)己多元醇為甙元，與氨基縮合而成的甙，故稱為氨基糖甙類抗生素(aminoglycosidesantibiotics)。

鏈霉素(Streptomycin)Structureandproperties

streptidinestreptoseN-methyl-L-glucosamine

streptobiosamineCharacteristics

鏈霉素的構(gòu)成為一分子鏈霉胍和一分子鏈霉雙糖胺結(jié)合而成的堿性甙。鏈霉素分子中有三個(gè)堿性中心，可與無機(jī)酸或有機(jī)酸形成可溶于水的鹽，臨床上多用其硫酸鹽。Properties

酸性條件下，鏈霉素水解為鏈霉胍與鏈霉雙糖胺，進(jìn)一步水解則得到N-甲基-L-葡萄糖胺。弱堿性條件下能使之水解為鏈霉胍及鏈霉雙糖胺，但繼之即將鏈霉糖部分分子重排為麥芽酚(maltol),這一性質(zhì)為鏈霉素所特有，可用于鑒別。IdentificationTests

NinhydrinreactionElson-Morganreaction

鏈霉素經(jīng)水解，產(chǎn)生N-甲基葡萄糖胺，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮和成吡咯衍生物，與對二甲氨基苯甲醛的酸性溶液反應(yīng)即生成紅色縮合物。

Maltolreaction

鏈霉素在堿性溶液中，鏈霉糖經(jīng)分子重排使環(huán)擴(kuò)大形成六元環(huán)，然后消除N-甲基葡萄糖胺，再消除鏈霉胍生成麥芽酚(α-甲基-β-羥基-γ-吡喃酮)。麥芽酚可與鐵離子在微酸性環(huán)境中形成紫紅色配位化合物。Sakaguchi

reactoin

本品水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍。鏈霉素B雜質(zhì)檢查

BP（1993）規(guī)定了鏈霉素B的檢查項(xiàng)目。甘露糖鏈霉素稱作鏈霉素B，它是鏈霉素分子中N-甲基葡萄糖胺的C4〞位上的羥基連接一個(gè)D-甘露糖組成的。含量測定Assay

目前各國藥典仍采用微生物檢測法。茚三酮反應(yīng)Ninhydrinreaction

＋2＋＋3H2OH+

Fe3+

H2ONaOHMaltolreactionMaltol慶大霉素(Gentamycin)

StructureandCharacteristicsStructureCharacteristics

慶大霉素是由絳紅糖胺、脫氧鏈霉胺和加洛糖胺縮和而成的甙。慶大霉素有五個(gè)堿性中心，其堿性相似。能與無機(jī)酸或有機(jī)酸形成可溶于水的鹽，多用硫酸鹽。Property

硫酸慶大霉素水中易溶，在乙醇、丙酮、氯仿或乙醚中不溶。對光、熱、空氣均較穩(wěn)定，水溶液穩(wěn)定，pH2~12時(shí)，100℃加熱30min活性無明顯變化。慶大霉素在紫外無吸收。purpurosamine

deoxystreptosaminegarosamineStructure鑒別反應(yīng)Identification

茚三酮反應(yīng)Ninhydrinreaction

本品與鏈霉素一樣具有氨基糖甙類結(jié)構(gòu)，羥基胺類和α-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮生成藍(lán)紫色縮和物。Elson-Morganreaction

與鏈霉素一樣，經(jīng)水解后也產(chǎn)生N-甲基葡萄糖胺(加洛糖胺)在堿性溶液中與乙酰丙酮縮和成吡咯衍生物，與對二甲基苯甲醛的酸性醇溶液反應(yīng)，生成紅色縮和物。紫外分光光度法Ultravioletspectroscopy

慶大霉素分子中無共軛雙鍵系統(tǒng)，故在紫外區(qū)無吸收。薄層色譜法TLC高效液相色譜法HPLC紅外光譜法IR硫酸鹽反應(yīng)Sulfatereaction檢查－慶大霉素C組分測定

慶大霉素C1、C2、C1a對微生物的活性無明顯差異，但其毒副作用和耐藥性有差異，導(dǎo)致各組分的多少影響產(chǎn)品的效價(jià)和臨床研究。中國藥典(2000)、USP(24)和BP(1993)均采用高效液相色譜法，JP(13)采用薄層色譜法和薄層微生物顯像法測定各組分的含量。含量測定Assay

目前各國藥典仍用微生物檢定法。

第四節(jié)四環(huán)素類抗生素

Section4

Tetracyclines

本類抗生素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，都具有氫化四駢苯環(huán)，故統(tǒng)稱為四環(huán)素族或四環(huán)素類(tetrac-yclines)抗生素?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

結(jié)構(gòu)Structure

性質(zhì)Character

NameRR′R〞R’’’

tetracyclineHOHCH3

HchlortetracycineClOHCH3

HoxytetracyclineHOHCH3

OHdoxycyclineHHCH3

OHmetacyclineH=CH2

OHStructure兩性化合物Amphotericcompound；其鹽酸鹽易溶于水，并溶于堿或酸性溶液中；結(jié)晶性物質(zhì)，在水中結(jié)晶者，均含有結(jié)晶水；旋光性O(shè)pticalrotation；差向異構(gòu)化性質(zhì)Epimerization——差向四環(huán)素；酸性降解Aciddegradation——脫水四環(huán)素；堿性降解Basedegradation——異四環(huán)素；中性降解Neutraldegradation——紫紅色縮和物；與金屬離子形成配位化合物。

鑒別試驗(yàn)Identification

i. 濃硫酸反應(yīng)Con.Sulfuricacidii. 三氯化鐵反應(yīng)Ferricchloridereaction名稱鹽酸四環(huán)素鹽酸金霉素鹽酸土霉素鹽酸多西環(huán)素鹽酸美他環(huán)素濃硫酸反應(yīng)深紫色藍(lán)色變?yōu)殚蠙炀G色朱紅色

黃色橙紅色三綠化鐵反應(yīng)紅棕色深褐色橙褐色褐色-氯化物反應(yīng)Chloridereaction本類抗生素多用鹽酸鹽，可與硝酸銀在酸性條件下生成氯化銀白色沉淀。iv. 紫外分光光度法UV本類抗生素分子內(nèi)含有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光區(qū)有吸收。熒光法Fluorescence本類抗生素分子內(nèi)含有共軛雙鍵系統(tǒng)，在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光，它們的降解產(chǎn)物也具有熒光。vi. 薄層色譜法TLC四環(huán)素類抗生素的薄層色譜多采用硅藻土作載體，為獲得較好得分離，在粘合劑中加有聚二乙醇400、甘油以及中性的EDTA緩沖液。EDTA可以克服因痕量的金屬離子存在而引起的脫尾現(xiàn)象。本類抗生素及其降解產(chǎn)物在紫外光(365nm)下產(chǎn)生熒光的性質(zhì)，可用與檢出斑點(diǎn)并以標(biāo)準(zhǔn)品對照進(jìn)行鑒別。其他方法Othermethod紅外光譜法及高效液相色譜法

鹽酸四環(huán)素中特殊雜質(zhì)檢查(Impuritytestintetracycline)含量測定Assay

比色法Colorimetricmethod

高效液相色譜法HPLC

第五節(jié)

抗生素類藥物的質(zhì)量考察研究

Section5QualityResearchReviewofAntibiotics青霉素中致敏雜質(zhì)的分離制備凝膠過濾法Gelfiltrationmethod

GDX104柱色譜GDX104columnchromatography雜質(zhì)的研究Researchofimpurity

光譜法Spectroscopy

Penamaldate法測定青霉噻唑基團(tuán)――青霉素過敏反應(yīng)主要抗原決定簇紫外光譜分析UV

紅外光譜分析IR

色譜法Chromatography

薄層色譜法TLC

高效液相色譜法HPLC

氣相色譜法GC

凝膠過濾色譜法Gelfiltrationmethodchromatography

生物法Biologicalmethod

電泳法Electrophoreticmethod－圓盤電泳分析免疫法Immunizingmethod－豚鼠被動皮膚過敏試驗(yàn)(PCA試驗(yàn))T