酶聯(lián)免疫吸附和微 量凝集-ELISA-20121217

酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)

林英

生物技術(shù)學院

2012.12.17

免疫酶聯(lián)吸收試驗（ELISA）是以免疫學反應為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用結(jié)合起來的一種敏感性很高的新型免疫檢測技術(shù)。

ELISA原理1971年分別由瑞典學者Engrall

和Perlmann

、荷蘭學者VanWeeman

和Schuurs

報道。其基本原理是將已知抗原或抗體吸附在固相載體微孔聚苯乙烯塑料板上，通過抗原抗體特異性結(jié)合吸附待測樣品中的抗體或抗原后，加酶標抗體和底物后，在相應酶底物的作用下生成有色物質(zhì)，其顏色深淺與標記物中相應的抗體或抗原的含量呈正比，由此可測定抗原或抗體的含量。ELISA的類型間接法雙抗夾心法競爭法捕獲包被法ABS-ELISA間接法ELISA測定抗體間接免疫酶聯(lián)吸收是測定抗體最常用的方法，其原理是將抗原聯(lián)接到固相載體上，樣品中待檢抗體與之結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復合物，再用酶標二抗與固相免疫復合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標二抗復合物，測定加底物后的顯色程度，對待檢抗體進行定性或定量測定

ELISA試劑抗原:家蠶蛹血液酶標抗體:goatantirabbitIgG-HRP陽性標準品:免疫家蠶蛹蛋白兔血清陰性對照:未免疫兔血清包被液:1.50gNa2CO3+2.93gNaHCO3加水至1000ml，pH9.6PBS-tween液(洗滌液)：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KCl0.2g,Tween-200.5mL，加水至1000mLELISA試劑封閉液：1％脫脂奶粉/BSA，1g脫脂奶粉/BSA＋100mlPBS-Tween磷酸鹽-檸檬酸緩沖液（pH5.0）：0.2mol/LNa2HPO4·12H2O25.7mL，0.1mol/L檸檬酸24.3mL，蒸餾水50mL底物溶液：100mL磷酸鹽-檸檬酸緩沖液＋40mg鄰苯二胺+100ul30%H2O2終止液:98%H2SO422.2mL+H2O177.80mL實驗方法1.包被抗原:先取家蠶蛹血液蛋白100倍PBS稀釋液1uL,分別加入到1-4孔中，再取1uL家蠶蛹血蛋白原液分別加入到5-8孔中，最后用包被液99uL加入到各孔中，4℃放置過夜。2.洗板：將包被液倒出，用洗液洗滌3次，每次2分鐘，用紙巾包住酶標板，在桌面拍打，甩干孔內(nèi)液體。3.封閉：每孔加入350ul封閉液，靜置1-2小時。4.洗板：同步驟2。5.加一抗：免疫血清分別按1:100,1:500，1:1000封閉液稀釋，稀釋液分別加到1\5,2\6,3/7孔,4/8孔加自制的兔血1:100封閉液稀釋液，每孔100ul，37℃溫育60分鐘。實驗方法6.洗板：同步驟2。7.加二抗：加入用封閉液1:2000稀釋的羊抗兔IgG-HRP，每孔100ul，37℃溫育60分鐘。8.洗板：同步驟2。9.顯色：加入現(xiàn)配的底物溶液，每孔100ul，避光顯色5-10分鐘。10.終止:每孔加入100ul硫酸終止液。11.檢測OD值：將酶標板置入酶標儀，讀出在492nm波長的光密度值。結(jié)果與分析

在酶聯(lián)板上，0.2≤OD

≤0.5，為蛹血液蛋白抗體弱陽性；OD≥0.5，為蛹血液蛋白抗體強陽性；OD＜0.2，為抗體強陰性。注意事項1.正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。2.在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

(1)固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。（2)包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。

(3)酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。

(4)酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護