膠體金常用的生物材料

膠體金常用的生物材料種類及檢測(cè)反應(yīng)模式，結(jié)果判讀模式的介紹內(nèi)容膠體金常用的生物材料種類檢測(cè)反應(yīng)模式結(jié)果判讀模式膠體金常用的生物材料種類膠體金檢測(cè)是一種免疫測(cè)定，免疫測(cè)定（immunoassay，IA）是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測(cè)定標(biāo)本的方法。在臨床檢驗(yàn)中主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。膠體金常用的生物材料主要是指抗原和抗體?？乖乖悄茉跈C(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。在免疫測(cè)定中，抗原是指能與抗體結(jié)合的物質(zhì)。能在機(jī)體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質(zhì)?？乖姆磻?yīng)性取決于抗原決定簇（antigenicdeterminant），或稱為表位（epitope）。一個(gè)抗原分子可帶有不同的決定簇。用于膠體金檢測(cè)的抗原抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提?。Ｖ亟M抗原重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無傳染性，但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌為質(zhì)粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于膠體金，在反應(yīng)中可出現(xiàn)假陽(yáng)性，因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培養(yǎng)成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測(cè)抗HCV膠體金中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達(dá)而制備的重組抗原。合成抗原合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。應(yīng)用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為他僅能檢測(cè)與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個(gè)不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。另外，某些微生物發(fā)生變異時(shí)往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種情況下，用個(gè)別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。

是指無性繁殖細(xì)胞系，是由單一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的一簇細(xì)胞純系。在這個(gè)家族的所有成員中，如無突變發(fā)生，其基因是完全相同的?？寺?clone)

1、多克隆抗體（polyclonalantibody,pAb）：用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物，可刺激機(jī)體多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物～。2、單克隆抗體（monoclonalantibodies,mAb）：由一個(gè)識(shí)別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無交叉反應(yīng)性。

抗體的制備技術(shù)經(jīng)歷了三代：第一代抗體是傳統(tǒng)的抗體制備方法即利用抗原免疫動(dòng)物后獲得抗體，稱為多克隆抗體（polyclonalantibody）；第二代抗體是通過雜交瘤技術(shù)制備出針對(duì)抗原中某一抗原決定簇的抗體稱為單克隆抗體(monoclonalantibody,McAb)；第三代抗體是利用基因工程技術(shù)制備而來，稱為基因工程抗體(geneticengineeringantibody)。Ab1Ab3Ab4單克隆抗體抗原Ab1抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗體）脾B細(xì)胞骨髓瘤小鼠取腹水骨髓瘤細(xì)胞HAT培養(yǎng)，稀釋單克隆抗體和多克隆抗體產(chǎn)生區(qū)別示意圖雜交瘤細(xì)胞+PEG,融合Ab2

一、雜交瘤技術(shù)的原理及流程抗體抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測(cè)定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。IGgIGMIgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時(shí)間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長(zhǎng)期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。IgM抗體一般為保護(hù)性抗體，具有免疫性。因此IgM抗體的測(cè)定，對(duì)某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價(jià)值?？贵w按制備過程和抗體性質(zhì)可分為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體是通過單組細(xì)胞分泌出來的抗體，最終以小鼠腹水形式出現(xiàn)，經(jīng)純化，成為可使用的IGg類型的生物材料。多克隆抗體是指有多組細(xì)胞分泌的抗體，一般為二抗，如羊抗鼠等。還有一種多抗，在免疫動(dòng)物時(shí)當(dāng)成免疫抗原來使用，即鼠IGg，羊IGg等通過取動(dòng)物血，再經(jīng)純化得到的材料，此類生物材料和二抗配套使用。單抗的優(yōu)點(diǎn)是特異性好，但靈敏度可能較差，而多抗的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度度好，結(jié)合能力強(qiáng)，但特異性較差。我們可根據(jù)具體情況選擇使用的材料。公司目前使用的材料介紹重組抗原類：HIV包被、標(biāo)記，HCV包被、標(biāo)記，TP包被、標(biāo)記等天然抗原類：Sb包被等合成抗原類：毒品類包被抗原單抗類：Sg，eAg，HCG等品種的包被標(biāo)記的材料多抗類：C線材料，A線材料，抗紅細(xì)胞抗體（鎖血用），抗人IGg有時(shí)公司為了節(jié)省成本，將部分單抗的腹水先購(gòu)回，再自行進(jìn)行純化，這類材料多了一個(gè)純化步驟，拉長(zhǎng)了生產(chǎn)周期。如PF，流感。多抗類的材料也可以通過購(gòu)買血清進(jìn)行純化使用。二、檢測(cè)反應(yīng)模式

檢測(cè)目標(biāo)物為抗原抗原檢測(cè)是最快捷，最直接的得到結(jié)果的方式，但每一種目標(biāo)物抗原存在的位置各異，在現(xiàn)在的體液檢測(cè)標(biāo)本中不易分離出來（如病原微生物寄生于細(xì)胞內(nèi)，HIV,HCV等），故只是部分項(xiàng)目采用了抗原檢測(cè)。如Sg等。檢測(cè)目標(biāo)物為抗體一些抗體檢測(cè)是為了監(jiān)控抗體水平而進(jìn)行的直接檢測(cè)，如Sb；但是相當(dāng)多的抗體檢測(cè)是為了看到病毒抗原的水平而進(jìn)行的。當(dāng)病毒侵入人體一段時(shí)間后，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，而抗體在血液中極易得到，故很多無法提取到抗原的項(xiàng)目，可以通過抗體的水平來反映病毒抗原的狀況。如HIV/HCV/TP等。但是抗體檢測(cè)最大的問題是窗口期較長(zhǎng)，診斷的時(shí)間較晚，容易耽誤病情。在抗體檢測(cè)中，還有IgM的檢測(cè)。由于機(jī)體被病毒感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體；經(jīng)過一段時(shí)間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長(zhǎng)期存在。所以通IgM的檢測(cè)對(duì)于一些急性和需要早期診斷的疾病具有重要意義。如甲肝。而人IgG的檢測(cè)主要用于流行病學(xué)調(diào)查抗感染性疾病的恢復(fù)期診斷或疫苗接種后的免疫效果的觀察。基本的反應(yīng)模式夾心法：雙抗原夾心，雙抗體夾心間接法：間接法（測(cè)總抗體或IgG抗體），捕獲法（測(cè)IgM）競(jìng)爭(zhēng)法：競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原，競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體夾心法雙抗原夾心法用特異性抗原進(jìn)行包被和標(biāo)記，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高，特異性也較強(qiáng)。同時(shí)雙抗原夾心法能檢測(cè)總的抗體量，即IgM,IgG,IgA等的量；既可檢測(cè)人血清抗體，亦可檢測(cè)動(dòng)物血清抗體，對(duì)人獸患病的檢測(cè)更有價(jià)值，實(shí)現(xiàn)了同一種試劑測(cè)不同種屬抗體。但需要注意HOOK效應(yīng)。HOOK效應(yīng)此現(xiàn)象在標(biāo)本受檢抗原/抗體的含量很高時(shí)出現(xiàn)。具體原因是：抗原/抗體在和標(biāo)記抗體/抗原結(jié)合的同時(shí)，過量的抗原/抗體也和包被抗體/抗原結(jié)合，從而將一部分的結(jié)合位點(diǎn)占住，導(dǎo)致前段形成的復(fù)合物一部分不能結(jié)合到包被膜上，出現(xiàn)了顯色變淺的情況。用高親和力的單克隆抗體或抗原制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。雙抗體夾心法用特異性抗體進(jìn)行包被和標(biāo)記，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。標(biāo)記抗體由于起到了捕抓的功能，加上標(biāo)記工藝的影響，要求的純度也較高，一般使用的是單克隆抗體，而包被端既有單抗又有多抗。在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。如抗體的來源為抗血清，包被和標(biāo)記用的抗體最好分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被和標(biāo)記。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性。雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和標(biāo)記抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng)。采用F（ab'）或Fab片段作標(biāo)記結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。間接法間接法間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體等）與標(biāo)本中的目標(biāo)抗體結(jié)合，形成復(fù)合物，再層析到檢測(cè)區(qū)和相應(yīng)的抗原結(jié)合，從而顯色反應(yīng)。本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一標(biāo)記抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。標(biāo)記抗體也可使用ProteinA,因其能與各種動(dòng)物血清的IgG反應(yīng)，所以可用在間接法中進(jìn)行檢測(cè)。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)。

抗原中也不能含有與標(biāo)記抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?/p>

捕獲法第一種說法：膠體金檢測(cè)中，一般是通過捕獲法檢測(cè)IgM，其原理是膜上包被特異性抗原，金墊上標(biāo)記有抗人IgM抗體，通過抗人IgM抗體捕獲標(biāo)本中的IgM抗體，再在膜上結(jié)合反應(yīng)顯色。第二種說法：包被抗人IgM抗體，標(biāo)記抗抗原抗體，抗原為白金，檢測(cè)標(biāo)本中的IgM抗體。此法常用于病毒性感染的早期診斷。如甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測(cè)間接法一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。

競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的標(biāo)記抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的標(biāo)記抗體愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等測(cè)定多用此法。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的標(biāo)記抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的標(biāo)記抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式，可將標(biāo)本和標(biāo)記抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抗HBc一般采用此法。另一種模式為使用中和抗原，標(biāo)本中的抗體和標(biāo)記抗體競(jìng)爭(zhēng)和中和抗原結(jié)合，形成復(fù)合物后，再與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be的檢測(cè)一般采用此法。三、結(jié)果判讀模式根據(jù)上面提到的幾種反應(yīng)原理，膠體金診斷試劑產(chǎn)生了一些常見的結(jié)果判讀模式。具體如下：1）CT線對(duì)比進(jìn)行結(jié)果判讀，品種有LH,FSH,TSH,PSA。判讀方式為：T線比C線深或同等深度，判為陽(yáng)性；T線比C線淺或不出，