核酸提取與鑒定

核酸的提取與鑒定研究對象：基因組DNA、質粒DNA、總RNA、mRNA等過程：

核酸提取裂解：破碎細胞，使細胞中的核酸游離在裂解體系中

純化：使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質、鹽及其它雜質徹底分離

核酸提取的主要步驟：破碎細胞提取純化I.材料準備II.破碎細胞或包膜——內容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中

總原則：

①應保證核酸一級結構的完整性；②排除其它分子的污染。鑒定：濃度、純度、完整性鑒定技術：分光光度技術、凝膠電泳技術

第一節(jié)預處理

一、樣品預處理

1、組織

組織有新鮮組織、甲醛固定或石蠟包埋組織。

新鮮組織先用生理鹽水洗，然后將其搗碎或剪碎，加液氮研磨成粉狀，加細胞裂解液裂解細胞；

甲醛固定組織要先去掉甲醛；

石蠟包埋組織要經過組織切片和二甲苯脫蠟等處理。2、培養(yǎng)細胞

培養(yǎng)細胞需棄細胞培養(yǎng)液，用緩沖液進行多次漂洗，方可用于提取核酸。

3、血液血液可以是新鮮血液或者凍貯血液；注意抗凝劑的選擇，一般用EDTA-Na2或枸櫞酸鈉，不可使用肝素；全血離心棄血清（或血漿）、加適量的紅細胞裂解液（破膜液），裂解紅細胞，再加適量的細胞核裂液（破核液），裂解白細胞中的細胞核，使核內DNA釋放出來。二、提取用具預處理（一）DNA提取用具的處理試劑、器材高壓干燥等進行無DNA酶處理。（二）RNA提取用具的處理1、提取RNA所用器皿的處理及溶液的準備塑料制品：使用滅菌的一次性用品。或用0.1％DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用氯仿處理)。玻璃用品：使用前于180℃的高溫下干烤6h以上，或在220℃下干烤3h以上。有機玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再用3％H2O2室溫浸泡10min，然后用0.1％DEPC水沖洗，晾干。

所需溶液的配制：必須用高壓滅菌的水和RNA提取專用的化學試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，把溶液裝入無RNase的玻璃器皿。嚴格來說，所有溶液均應用0.1％DEPC于37℃處理12小時以上，然后于100℃加熱15分鐘或高壓滅菌15分鐘，去除殘余DEPC。

在涉及RNA的一切操作過程中，都應戴一次性手套和口罩，應勤換手套。2．RNA提取中RNase污染的控制

第二節(jié)DNA的提取

一、DNA的常規(guī)提取真核生物DNA主要以核蛋白形式(DNP)存在于細胞核中，因此要從細胞中提取DNA時，必須先粉碎組織，裂解細胞膜和核膜，使核蛋白釋放，再把蛋白質除去，再除去細胞中的糖類，脂類、RNA等物質，沉淀DNA,去除鹽類，有機劑等雜質,得到純化的DNA。1、酚-氯仿提取法

2、濃鹽法

核糖蛋白（RNP）與脫氧核糖蛋白（DNP）在不同濃度的NaCl溶液中溶解度顯著不同。DNP在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最小，僅為水中的1％。當NaCl濃度增至1mol/L時，DNP的溶解度比在水中大2倍。利用這一性質可將DNP從破碎后的細胞勻漿中分離出來，也可以使DNP和RNP分離，DNP的蛋白部分可用苯酚、SDS等其他方法將其除去。

3、玻璃棒纏繞法用鹽酸胍裂解細胞，然后將細胞裂解物小心鋪在離心管中的乙醇上，用一個代溝的或前端為U型的玻璃棒在這兩層溶液的交界面慢慢攪動，沉淀出的膠狀DNA纏繞在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA經多次乙醇浸泡并與室溫下蒸發(fā)乙醇，由膠狀逐漸回縮，然后浸入TE緩沖液中，使其重新吸水膨脹而和玻璃棒分離。4、玻璃顆粒吸附法

首先利用含異硫氰酸胍的細胞裂解液裂解細胞，然后加入能夠與DNA結合的玻璃顆粒的緩沖液，經沉淀收集結合DNA的玻璃顆粒，利用洗脫液進行洗脫獲得DNA。不僅玻璃顆?？梢院虳NA結合，一定大小的硅膠顆粒也可以和DNA結合。二、質粒DNA的提?。?）是存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。（2）小的1-3kb，大的可達數百kb。（3）進入細菌，可自我復制或表達。質粒DNA的提取有效方法方法：堿裂解法；氯化銫密度梯度分離法；煮沸裂解法等。所有分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；分離質粒DNA(有時還要求純化質粒DNA，根據實驗所需)選擇哪一種方法主要取決于以下幾個因素：質粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術和實驗要求。1、培養(yǎng)細菌和擴增質粒

用氯霉素抑制宿主細胞的蛋白質合成，從而抑制染色體的復制和分裂；質粒的復制系統(tǒng)成分的半衰期較長，使質粒得以擴增。2、收獲細菌和溶菌細菌裂解三種方法：機械法（如超聲波等）化學試劑法（如SDS等）溶菌酶－化學試劑聯合法（最常用）3、提取質粒主要使染色體DNA與質粒DNA分離

分離主要依據染色體DNA比質粒DNA分子大得多，而且染色體DNA被斷裂成線狀分子，但質粒DNA為共價閉環(huán)結構，當加熱或用酸、堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在冷卻和回到中性pH時即恢復其天然構象。

當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發(fā)生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA不復性而呈絮狀，離心時可沉淀下來（1）堿裂解法（2）氯化銫密度梯度分離法

EB分子可嵌入堿基對之間，使DNA解旋開環(huán)DNA或線性DNA存在游離末端易于解旋，可結合大量EB，DNA-EB復合物含EB越多，密度越小。閉環(huán)質粒DNA沒有游離末端，不易解旋，結合少量EB，密度較大。在飽和EB條件下，質粒DNA密度比斷裂染色體DNA密度大，經氯化銫密度梯度離心，可分離提取質粒DNA。（3）煮沸裂解法通過加熱，使細菌裂解、蛋白質和染色體DNA變性。降低溫度，閉環(huán)質粒DNA復性留于上清液，染色體DNA不能復性與變性蛋白質形成沉淀，可通過離心出去而分離。第三節(jié)RNA的提取一、總RNA的提取所有RNA的提取過程中都有五個關鍵點，即：①樣品細胞或組織的有效破碎；②有效地使核蛋白復合體變性；③對內源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；⑤對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中最關鍵的是抑制RNA酶的活性。常用的RNA酶抑制劑

①焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。②異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑。③氧釩核糖核苷復合物④RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin)⑤其他：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。RNA的提取方法

1、異硫氰酸胍-氯化銫超速離心法

使用蛋白質強變性劑異硫氰酸胍裂解組織和有效抑制RNA酶的活性，再進行CsCl密度梯度超速離心，RNA沉淀于管底，而DNA與蛋白質在上清液中。使用這種方法，不但能得到高質量的RNA，而且能同時分離出細胞染色體DNA。本法已成為提取哺乳動物細胞RNA的常規(guī)方法。

2、鹽酸胍-有機溶劑法鹽酸胍變性蛋白質，抑制RNA酶，有機溶劑抽提去除蛋白質，通過選擇性沉淀RNA分子而去除DNA。此法適用于沒有超速離心設施的情況下提取細胞總RNA，提取的RNA質量較好，但整個操作過程繁雜費時。3、氯化鋰-尿素法利用高濃度尿素變性蛋白質同時抑制RNA酶，氯化鋰選擇性沉淀RNA。其缺點是有時會存在DNA污染，氯化鋰沉淀RNA會丟失一些小分子RNA，如5sRNA等。優(yōu)點是快速、簡便、產量高，尤其適用于大量樣品少量組織細胞的RNA提取。4、一步快速熱酚抽提法將異硫氰酸胍、巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉（SLS）等聯合使用，抑制RNA的降解，裂解細胞，增強對核蛋白復合物的解離，使RNA與蛋白質分離；然后用苯酚、氯仿等抽提去除蛋白質和DNA，乙醇或異丙醇沉淀純化RNA。此法操作簡便快速，可在3小時以內處理大批樣品，對大量或少量組織的細胞RNA提取均甚合適。

二、mRNA的提取

從提取的總RNA中分離mRNA，用Oligo（dT）-柱層析法分離：mRNA含polyA，在高鹽濃度條件下與Oligo（dT）結合，其他成分被洗掉，再通過低鹽濃度洗脫mRNA而分離。第四節(jié)核酸的鑒定一、核酸濃度檢測1、定磷法DNA和RNA中都含有磷酸，根據元素分析獲知RNA的平均含磷量為9.4%，DNA的平均含磷量為9.9%，因此可從樣品中測得的含磷量來計算DNA或RNA的含量。

2、定糖法RNA含核糖，DNA含有脫氧核糖，根據這兩種糖的顏色反應可對DNA和RNA進行定量測定。3、紫外吸收法DNA和RNA在波長260nm處有很高的吸收峰值，用標準樣品測得在波長260nm處，A260＝1時，樣品中雙鏈DNA濃度為50μg/ml，單鏈DNA或RNA濃度為40μg/ml。DNA(μg/μl)=A260×50×稀釋倍數/1000RNA（μg/μl）=A260×40×稀釋倍數/1000二、核酸純度檢測

核酸的純度用A260/A280比值表示。OD260/OD280

＝1.8——為DNA純品OD260/OD280

＝1.8~2.0——為RNA純品三、核酸完整性檢測核酸樣本的完整性和分子量可通過瓊脂糖凝膠電泳測定（RNA常采用甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳），溴化乙錠染色，紫外燈觀察。凝膠上DNA存在處可觀察到清晰的條帶。完整性良好的總RNA應該清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三條帶，其中28srRNA的亮度應為18srRNA的兩倍，5srRNA較弱。

基因組DNA抽提結果電泳圖總RNA抽提結果電泳圖mRNA第五節(jié)電泳根據電泳支持介質分：瓊脂糖凝膠電泳：多用于鑒定較大核酸片段（0.1～60kb），特別是分子量測定聚丙烯酰胺凝膠電泳：用于鑒定較小的核酸片段，特別是DNA測序電泳的基本原理電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如蛋白質、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷性質相反的電極方向移動。電泳技術就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。

一、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離、純化和鑒定核酸的方法。瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將適量的瓊脂糖粉末懸浮于緩沖液中，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻澹⑷肽０搴笫覝叵吕鋮s凝聚即成瓊脂糖凝膠。凝膠具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍

瓊脂糖濃度(％)線型DNA分子的分離范圍(kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2瓊脂糖凝膠電泳裝置DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數值成反比關系。因而就可依據DNA分子的大小使其分離。RNA可以使用非變