核酸提取與鑒定

核酸的提取與鑒定研究對(duì)象：基因組DNA、質(zhì)粒DNA、總RNA、mRNA等過(guò)程：

核酸提取裂解：破碎細(xì)胞，使細(xì)胞中的核酸游離在裂解體系中

純化：使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離

核酸提取的主要步驟：破碎細(xì)胞提取純化I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜——內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中

總原則：

①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。鑒定：濃度、純度、完整性鑒定技術(shù)：分光光度技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)

第一節(jié)預(yù)處理

一、樣品預(yù)處理

1、組織

組織有新鮮組織、甲醛固定或石蠟包埋組織。

新鮮組織先用生理鹽水洗，然后將其搗碎或剪碎，加液氮研磨成粉狀，加細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；

甲醛固定組織要先去掉甲醛；

石蠟包埋組織要經(jīng)過(guò)組織切片和二甲苯脫蠟等處理。2、培養(yǎng)細(xì)胞

培養(yǎng)細(xì)胞需棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用緩沖液進(jìn)行多次漂洗，方可用于提取核酸。

3、血液血液可以是新鮮血液或者凍貯血液；注意抗凝劑的選擇，一般用EDTA-Na2或枸櫞酸鈉，不可使用肝素；全血離心棄血清（或血漿）、加適量的紅細(xì)胞裂解液（破膜液），裂解紅細(xì)胞，再加適量的細(xì)胞核裂液（破核液），裂解白細(xì)胞中的細(xì)胞核，使核內(nèi)DNA釋放出來(lái)。二、提取用具預(yù)處理（一）DNA提取用具的處理試劑、器材高壓干燥等進(jìn)行無(wú)DNA酶處理。（二）RNA提取用具的處理1、提取RNA所用器皿的處理及溶液的準(zhǔn)備塑料制品：使用滅菌的一次性用品?；蛴?.1％DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用氯仿處理)。玻璃用品：使用前于180℃的高溫下干烤6h以上，或在220℃下干烤3h以上。有機(jī)玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再用3％H2O2室溫浸泡10min，然后用0.1％DEPC水沖洗，晾干。

所需溶液的配制：必須用高壓滅菌的水和RNA提取專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過(guò)的藥匙稱取試劑，把溶液裝入無(wú)RNase的玻璃器皿。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，所有溶液均應(yīng)用0.1％DEPC于37℃處理12小時(shí)以上，然后于100℃加熱15分鐘或高壓滅菌15分鐘，去除殘余DEPC。

在涉及RNA的一切操作過(guò)程中，都應(yīng)戴一次性手套和口罩，應(yīng)勤換手套。2．RNA提取中RNase污染的控制

第二節(jié)DNA的提取

一、DNA的常規(guī)提取真核生物DNA主要以核蛋白形式(DNP)存在于細(xì)胞核中，因此要從細(xì)胞中提取DNA時(shí)，必須先粉碎組織，裂解細(xì)胞膜和核膜，使核蛋白釋放，再把蛋白質(zhì)除去，再除去細(xì)胞中的糖類，脂類、RNA等物質(zhì)，沉淀DNA,去除鹽類，有機(jī)劑等雜質(zhì),得到純化的DNA。1、酚-氯仿提取法

2、濃鹽法

核糖蛋白（RNP）與脫氧核糖蛋白（DNP）在不同濃度的NaCl溶液中溶解度顯著不同。DNP在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最小，僅為水中的1％。當(dāng)NaCl濃度增至1mol/L時(shí)，DNP的溶解度比在水中大2倍。利用這一性質(zhì)可將DNP從破碎后的細(xì)胞勻漿中分離出來(lái)，也可以使DNP和RNP分離，DNP的蛋白部分可用苯酚、SDS等其他方法將其除去。

3、玻璃棒纏繞法用鹽酸胍裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解物小心鋪在離心管中的乙醇上，用一個(gè)代溝的或前端為U型的玻璃棒在這兩層溶液的交界面慢慢攪動(dòng)，沉淀出的膠狀DNA纏繞在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA經(jīng)多次乙醇浸泡并與室溫下蒸發(fā)乙醇，由膠狀逐漸回縮，然后浸入TE緩沖液中，使其重新吸水膨脹而和玻璃棒分離。4、玻璃顆粒吸附法

首先利用含異硫氰酸胍的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，然后加入能夠與DNA結(jié)合的玻璃顆粒的緩沖液，經(jīng)沉淀收集結(jié)合DNA的玻璃顆粒，利用洗脫液進(jìn)行洗脫獲得DNA。不僅玻璃顆粒可以和DNA結(jié)合，一定大小的硅膠顆粒也可以和DNA結(jié)合。二、質(zhì)粒DNA的提取（1）是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。（2）小的1-3kb，大的可達(dá)數(shù)百kb。（3）進(jìn)入細(xì)菌，可自我復(fù)制或表達(dá)。質(zhì)粒DNA的提取有效方法方法：堿裂解法；氯化銫密度梯度分離法；煮沸裂解法等。所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需)選擇哪一種方法主要取決于以下幾個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求。1、培養(yǎng)細(xì)菌和擴(kuò)增質(zhì)粒

用氯霉素抑制宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，從而抑制染色體的復(fù)制和分裂；質(zhì)粒的復(fù)制系統(tǒng)成分的半衰期較長(zhǎng)，使質(zhì)粒得以擴(kuò)增。2、收獲細(xì)菌和溶菌細(xì)菌裂解三種方法：機(jī)械法（如超聲波等）化學(xué)試劑法（如SDS等）溶菌酶－化學(xué)試劑聯(lián)合法（最常用）3、提取質(zhì)粒主要使染色體DNA與質(zhì)粒DNA分離

分離主要依據(jù)染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，而且染色體DNA被斷裂成線狀分子，但質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱或用酸、堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻和回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象。

當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來(lái)（1）堿裂解法（2）氯化銫密度梯度分離法

EB分子可嵌入堿基對(duì)之間，使DNA解旋開環(huán)DNA或線性DNA存在游離末端易于解旋，可結(jié)合大量EB，DNA-EB復(fù)合物含EB越多，密度越小。閉環(huán)質(zhì)粒DNA沒有游離末端，不易解旋，結(jié)合少量EB，密度較大。在飽和EB條件下，質(zhì)粒DNA密度比斷裂染色體DNA密度大，經(jīng)氯化銫密度梯度離心，可分離提取質(zhì)粒DNA。（3）煮沸裂解法通過(guò)加熱，使細(xì)菌裂解、蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。降低溫度，閉環(huán)質(zhì)粒DNA復(fù)性留于上清液，染色體DNA不能復(fù)性與變性蛋白質(zhì)形成沉淀，可通過(guò)離心出去而分離。第三節(jié)RNA的提取一、總RNA的提取所有RNA的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即：①樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；②有效地使核蛋白復(fù)合體變性；③對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；⑤對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。但其中最關(guān)鍵的是抑制RNA酶的活性。常用的RNA酶抑制劑

①焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。②異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑。③氧釩核糖核苷復(fù)合物④RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin)⑤其他：SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。RNA的提取方法

1、異硫氰酸胍-氯化銫超速離心法

使用蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍裂解組織和有效抑制RNA酶的活性，再進(jìn)行CsCl密度梯度超速離心，RNA沉淀于管底，而DNA與蛋白質(zhì)在上清液中。使用這種方法，不但能得到高質(zhì)量的RNA，而且能同時(shí)分離出細(xì)胞染色體DNA。本法已成為提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA的常規(guī)方法。

2、鹽酸胍-有機(jī)溶劑法鹽酸胍變性蛋白質(zhì)，抑制RNA酶，有機(jī)溶劑抽提去除蛋白質(zhì)，通過(guò)選擇性沉淀RNA分子而去除DNA。此法適用于沒有超速離心設(shè)施的情況下提取細(xì)胞總RNA，提取的RNA質(zhì)量較好，但整個(gè)操作過(guò)程繁雜費(fèi)時(shí)。3、氯化鋰-尿素法利用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時(shí)抑制RNA酶，氯化鋰選擇性沉淀RNA。其缺點(diǎn)是有時(shí)會(huì)存在DNA污染，氯化鋰沉淀RNA會(huì)丟失一些小分子RNA，如5sRNA等。優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便、產(chǎn)量高，尤其適用于大量樣品少量組織細(xì)胞的RNA提取。4、一步快速熱酚抽提法將異硫氰酸胍、巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉（SLS）等聯(lián)合使用，抑制RNA的降解，裂解細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離；然后用苯酚、氯仿等抽提去除蛋白質(zhì)和DNA，乙醇或異丙醇沉淀純化RNA。此法操作簡(jiǎn)便快速，可在3小時(shí)以內(nèi)處理大批樣品，對(duì)大量或少量組織的細(xì)胞RNA提取均甚合適。

二、mRNA的提取

從提取的總RNA中分離mRNA，用Oligo（dT）-柱層析法分離：mRNA含polyA，在高鹽濃度條件下與Oligo（dT）結(jié)合，其他成分被洗掉，再通過(guò)低鹽濃度洗脫mRNA而分離。第四節(jié)核酸的鑒定一、核酸濃度檢測(cè)1、定磷法DNA和RNA中都含有磷酸，根據(jù)元素分析獲知RNA的平均含磷量為9.4%，DNA的平均含磷量為9.9%，因此可從樣品中測(cè)得的含磷量來(lái)計(jì)算DNA或RNA的含量。

2、定糖法RNA含核糖，DNA含有脫氧核糖，根據(jù)這兩種糖的顏色反應(yīng)可對(duì)DNA和RNA進(jìn)行定量測(cè)定。3、紫外吸收法DNA和RNA在波長(zhǎng)260nm處有很高的吸收峰值，用標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得在波長(zhǎng)260nm處，A260＝1時(shí)，樣品中雙鏈DNA濃度為50μg/ml，單鏈DNA或RNA濃度為40μg/ml。DNA(μg/μl)=A260×50×稀釋倍數(shù)/1000RNA（μg/μl）=A260×40×稀釋倍數(shù)/1000二、核酸純度檢測(cè)

核酸的純度用A260/A280比值表示。OD260/OD280

＝1.8——為DNA純品OD260/OD280

＝1.8~2.0——為RNA純品三、核酸完整性檢測(cè)核酸樣本的完整性和分子量可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定（RNA常采用甲醛瓊脂糖變性凝膠電泳），溴化乙錠染色，紫外燈觀察。凝膠上DNA存在處可觀察到清晰的條帶。完整性良好的總RNA應(yīng)該清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三條帶，其中28srRNA的亮度應(yīng)為18srRNA的兩倍，5srRNA較弱。

基因組DNA抽提結(jié)果電泳圖總RNA抽提結(jié)果電泳圖mRNA第五節(jié)電泳根據(jù)電泳支持介質(zhì)分：瓊脂糖凝膠電泳：多用于鑒定較大核酸片段（0.1～60kb），特別是分子量測(cè)定聚丙烯酰胺凝膠電泳：用于鑒定較小的核酸片段，特別是DNA測(cè)序電泳的基本原理電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物分子，如蛋白質(zhì)、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。

一、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便、快速、最常用的分離、純化和鑒定核酸的方法。瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將適量的瓊脂糖粉末懸浮于緩沖液中，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻澹⑷肽０搴笫覝叵吕鋮s凝聚即成瓊脂糖凝膠。凝膠具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍

瓊脂糖濃度(％)線型DNA分子的分離范圍(kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2瓊脂糖凝膠電泳裝置DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。RNA可以使用非變