第十三章-維生素類藥物分析

第一節(jié)維生素A的分析第二節(jié)維生素B1的分析第三節(jié)維生素C的分析第四節(jié)維生素D的分析

第五節(jié)維生素E的分析第六節(jié)復(fù)方制劑中多種維生素的分析第十三章維生素類藥物的分析

基本要求

一、掌握維生素A、維生素B1、維生素C、維生素E的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及分析方法間的關(guān)系，專屬反應(yīng)、主要的含量測(cè)定方法與原理。二、熟悉維生素A、維生素B1、維生素C、維生素E的有關(guān)物質(zhì)、檢查方法與原理。

三、了解維生素D的性質(zhì)和分析特點(diǎn)。概述維生素：是維持人體正常代謝機(jī)能所必需的一類活性物質(zhì)。人體不能合成維生素。VitA、D2、D3、

E、K1

等脂溶性水溶性VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、葉酸、煙酸、泛酸等。分類按溶解度分

公元前3500年-古埃及人發(fā)現(xiàn)能防治夜盲癥的物質(zhì)，也就是后來(lái)的維A。

1600年-醫(yī)生鼓勵(lì)以多吃動(dòng)物肝臟來(lái)治夜盲癥。

1747年-蘇格蘭醫(yī)生林德發(fā)現(xiàn)檸檬能治壞血病，也就是后來(lái)的維C。

1831年-胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)。

1905年-甲狀腺腫大被碘治愈。

1911年-波蘭化學(xué)家豐克為維生素命名。

1915年-科學(xué)家認(rèn)為糙皮病是由于缺乏某種維生素而造成的1916年-維生素B被分離出來(lái)。

1917年-英國(guó)醫(yī)生發(fā)現(xiàn)魚肝油可治愈佝僂病，隨后斷定這種病是缺乏維D引起的。

維生素發(fā)展史1920年-發(fā)現(xiàn)人體可將胡蘿卜轉(zhuǎn)化為維生素A。

1922年-維E被發(fā)現(xiàn)。

1928年-科學(xué)家發(fā)現(xiàn)維B至少有兩種類型。

1933年-維E首次用于治療。

1948年-大劑量維C用于治療炎癥。

1949年-維B3與維C用于治療精神分裂癥。

1954年-自由基與人體老化的關(guān)系被揭開(kāi)。

1957年-Q10多酶被發(fā)現(xiàn)。

1969年-體內(nèi)超級(jí)抗氧化酶被發(fā)現(xiàn)。

1970年-維C被用于治療感冒。

1993年-哈佛大學(xué)發(fā)表維生素E與心臟病關(guān)系的研究結(jié)果。主要的藥理作用：干眼病、角膜軟化癥、皮膚干燥、夜盲等主要來(lái)源：自然界：鮫類無(wú)海魚肝臟中提取的脂肪油目前主要采用人工合成。第一節(jié)維生素A結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、123456789-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:具有共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯

易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應(yīng)為一個(gè)具有共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯（二）

具有UV吸收

存在多種立體異構(gòu)化合物（一）與CHCl3、乙醚、環(huán)己烷等互溶，乙醇中微溶。水中不溶。鯨醇VitA2VitA3△或有金屬離子存在時(shí)氧化↑共軛多烯側(cè)鏈易被氧化（二）環(huán)氧化物VitA醛VitA酸三氯化銻反應(yīng)（一）條件無(wú)水無(wú)醇CHCl3鑒別試驗(yàn)二、藍(lán)色紫紅λmax為326nm一個(gè)吸收峰UV法（二）λmax為350～390nm三個(gè)吸收峰去水VitA（VitA3）↓VitAUSP顯色劑磷鉬酸規(guī)定斑點(diǎn)顏色和Rf值BP

對(duì)照品法顯色劑三氯化銻TLC法（三）立體異構(gòu)體氧化降解產(chǎn)物合成中間體UV法（一）維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸含量測(cè)定三、三點(diǎn)校正法（法定方法）1.原理：（1）雜質(zhì)的吸收在310~340nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長(zhǎng)的增大吸收度減?。唬?）物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性。2.波長(zhǎng)的選擇：（1）1

VitA的max（328nm）（2）23

分別在1的兩側(cè)各選一點(diǎn)測(cè)定對(duì)象VitA醋酸酯第一法等波長(zhǎng)差法=12nm第二法等吸收比法測(cè)定對(duì)象VitA醇1=325nm,2=310nm,3=334nm測(cè)定法（1）基本步驟:第一步A的選擇選擇依據(jù)：所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除注意：

C為混合樣品的濃度第二步求第三步求效價(jià)換算因數(shù)由純品計(jì)算而得：第四步：求標(biāo)示量％

方法：（2）

第一法維生素A醋酸酯

判斷是否在326～329nm之間在326～329nm之間改用第二法是否

求算并與規(guī)定值比較

規(guī)定值差值

判斷差值是否超過(guò)規(guī)定值的有一個(gè)以上超過(guò)無(wú)超過(guò)

計(jì)算A328（校正）

用A328計(jì)算03%－15%－3%第二法第二法討論VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直線方程式法（即代數(shù)法）推導(dǎo)而來(lái)；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（幾何法或稱6/7定位法）推導(dǎo)而來(lái)。在應(yīng)用三點(diǎn)校正法時(shí)，除其中一點(diǎn)在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定外，其余兩點(diǎn)均在最大吸收峰的兩側(cè)進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)定前務(wù)必要校正波長(zhǎng)。測(cè)定的樣品應(yīng)不得少于兩份。VitAD膠丸中VitA的含量測(cè)定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項(xiàng)下（平均裝量0.07985g/丸）的內(nèi)容物0.1287g至10ml燒杯中，加環(huán)己烷溶解并定量轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為328nm，并在下列波長(zhǎng)處測(cè)得吸收度為A300：0.374A316

：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344求本品中維生素A占標(biāo)示量的百分含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637A328(校正)–A328(實(shí)測(cè))A328(實(shí)測(cè))×100=0.637–0.6630.663×100=-3.92E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.87供試品中維生素A效價(jià)=E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）標(biāo)示量%=VA效價(jià)(IU/g)×每丸內(nèi)容物平均裝量(g/丸)標(biāo)示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%適用于維生素A醇（等吸收比法）

第一法無(wú)法消除雜質(zhì)干擾時(shí)用此法[皂化法、6/7A法]（3）第二法水溶性脂溶性

判斷max是否在323～327nm之間取未皂化樣品采用色譜法純化后再測(cè)定

計(jì)算是否

判斷A300/A325是否大于0.73是否取未皂化樣品采用色譜法純化后再測(cè)定

計(jì)算A325(校正)03%－3%三氯化銻比色法優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便快速λmax618nm～620nm標(biāo)準(zhǔn)曲線法缺點(diǎn)呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性（二）藍(lán)色+3SbClVitACh.P.（2010）新增HPLC法作為維生素A的法定含量測(cè)定方法。本法適用于維生素A醋酸酯原料及其制劑中維生素A的含量測(cè)定。Ch.P.（2010）規(guī)定維生素AD軟膠囊、維生素AD滴劑用該法測(cè)定含量。（三）HPLCRP-HPLC同時(shí)測(cè)定人血清中VitA和VitE含量色譜條件

色譜柱：C18

流動(dòng)相：甲醇-水流速：1.2ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)與AUFS：

0～8min(330nm,0.25AUFS);8min后(292nm,0.05AUFS)

內(nèi)標(biāo)：VitA酯VitAVitE氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨堿)HClCl-第二節(jié)維生素B1主要的藥理作用：維持糖代謝及神經(jīng)傳導(dǎo)，治療多發(fā)性神經(jīng)炎、腸道疾病等主要來(lái)源：種子外皮及胚芽中，米糠、麥麩、黃豆、酵母、瘦肉等（一）溶解性1、易溶于水2、水溶液呈酸性（二）UV共軛雙鍵λmax=246nm結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、與生物堿↓→↓（三）硫色素反應(yīng)（四）嘧啶環(huán)——噻唑環(huán)——（五）氯化物特性呈氯化物的反應(yīng)，用于鑒別。ChP2010鑒別試驗(yàn)二、（一）硫色素反應(yīng)硫色素＋2HVitB1H+H+H+H+（二）沉淀反應(yīng)S元素反應(yīng)Cl-反應(yīng)（三）其他反應(yīng)()21PbSNaSVitBNO3PbNaOH三、含量測(cè)定電位滴定指示終點(diǎn)（一）非水溶液滴定法反應(yīng)摩爾比為1：2UV法（二）片劑、注射劑=421（每片）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=A=ECL規(guī)格g/片g/100mlgChPWEA%cmD10011×%100標(biāo)示量平均片重×××（每ml）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=規(guī)格g/mlml%VEA%cm100110011×標(biāo)示量稀釋倍數(shù)××（三）硫色素?zé)晒夥ㄔ?、熒光硫色素異丁醇鐵氰化鉀1VitBNaOH+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇Sd（空白）對(duì)照液供試液+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇b（空白）AC樣A-bC對(duì)=S-dC樣

=C對(duì)×

A-bS-d方法2、特點(diǎn)3、（1）靈敏度高，線性范圍寬（2）代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析L－抗壞血酸第三節(jié)維生素C主要的藥理作用：防治壞血病、慢性鐵中毒的治療、用于治療肝硬化、急性肝炎和砷、汞、鉛、苯等慢性中毒時(shí)肝臟的損害。主要來(lái)源：各種新鮮蔬菜和水果1、易溶于水2、水溶液呈酸性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、（一）溶解性烯二醇結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)烯二醇結(jié)構(gòu)（二）還原性有活性有活性無(wú)活性△糖類的顯色反應(yīng)50℃結(jié)構(gòu)與糖類相似（三）具糖的性質(zhì)C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.57酸性（四）一元酸L(+)－抗壞血酸活性最強(qiáng)手性C（C4、C5）（五）光學(xué)活性**與堿反應(yīng)（六）水解性與氧化劑的反應(yīng)（一）鑒別試驗(yàn)二、去氫抗壞血酸]O[VitC1、與AgNO3反應(yīng)2、與2，6-二氯靛酚反應(yīng)(ChP2010)氧化型玫瑰紅色還原型藍(lán)色OH-(ChP2010)（玫瑰色）（無(wú)色）3.其他氧化劑的反應(yīng)：亞甲藍(lán)或高錳酸鉀試劑褪色

堿性酒石酸銅磚紅色沉淀

磷鉬酸鉬藍(lán)

糖類的反應(yīng)（二）或鹽酸50℃吡咯USP（藍(lán)色）(糠醛)（戊糖）50℃(吡咯)UV（三）BP20100.01mol/LHCl1.片劑、注射液溶液的澄清度與顏色：

有色雜質(zhì)分光光度法2.原料藥中鐵、銅離子：原子吸收分光光度法雜質(zhì)檢查三、指示劑淀粉指示液原理1、碘量法（一）含量測(cè)定四、H+

取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過(guò)的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6方法2、（1）酸性環(huán)境HAC（2）新沸冷H2O減慢VitC被O2氧化速度討論3、（3）立即滴定趕走水中O2減少O2的干擾（4）附加劑干擾的排除片劑——滑石粉——過(guò)濾注射劑——抗氧劑——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5CHHOOaS3aSO+H2NHON2252HONHCOS3a2，6-二氯靛酚鈉滴定法法（二）USPJP原理1、酚亞胺二氯靛酚，-62VitC自身指示終點(diǎn)法方法2、（2）快速滴定2min內(nèi)

（1）酸性環(huán)境HPO3-HAc

穩(wěn)定VitC防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）剩余比色測(cè)定

（定量過(guò)量）（測(cè)剩余染料）討論3、（4）缺點(diǎn)

需經(jīng)常標(biāo)定貯存≤一周不穩(wěn)定干擾多氧化力較強(qiáng)（三）HPLC法分離VitC常用方法及測(cè)定對(duì)象方法離子交換色譜法離子對(duì)色譜法分配色譜法（正、反相）對(duì)象制劑、生物樣品、果汁血、尿、組織、細(xì)胞等HPLC法第四節(jié)維生素D維生素D是一類抗佝僂病維生素的總稱，目前已知的維生素D類物質(zhì)有10多種。中國(guó)藥典主要收載了維生素D2,D3原料藥；維生素D2膠丸和注射液；維生素D3注射劑。結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、開(kāi)環(huán)的甾體：具有甾類化合物的顯色反應(yīng)，可用于鑒別。手性碳原子：具有旋光性，可用于鑒別。

多烯：可進(jìn)行紫外檢測(cè)。

維生素D2維生素D31.顯色反應(yīng)醋酐--硫酸反應(yīng)D2

黃紅紫綠

D3

黃紅紫、藍(lán)綠綠三氯化銻反應(yīng)橙紅色漸變粉紅三氯化鐵反應(yīng)橙黃色二氯丙醇和乙酰氯反應(yīng)綠色鑒別試驗(yàn)二、2.比旋度鑒別維生素D2維生素D3溶劑

濃度比旋度值無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°+105°～+112°注意事項(xiàng)：應(yīng)于容器開(kāi)啟30分鐘內(nèi)取樣，在溶液配制后30分鐘內(nèi)測(cè)定。

3.區(qū)別反應(yīng)：以96%乙醇為溶劑，加乙醇和85%硫酸，D2顯紅色，在570nm處有最大吸收，D3顯黃色，在495nm處有最大吸收。

4.其他方法：

TLC、HPLC、制備衍生物測(cè)熔點(diǎn)

維生素D2中麥角甾醇的檢查：加洋地黃皂苷溶液，混合，放置18h不得發(fā)生渾濁或沉淀。前維生素D的光照產(chǎn)物雜質(zhì)檢查三、

中國(guó)藥典采用正相高效液相色譜法測(cè)定維生素D的含量，定量方法為內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為鄰苯二甲酸二甲酯，該法分為三個(gè)方法。

固定相：硅膠

流動(dòng)相：正己烷-正戊醇（997：3）檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm含量測(cè)定四、第一法：用于無(wú)維生素A醇及其它雜質(zhì)的干擾的情況，步驟如下：

1．系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：測(cè)定重復(fù)性和分離度。

2．測(cè)定校正因子：

AS/mS

f1=--------

Ar/mr

f2=（ASmr-f1mSAr1）/（Ar1mS）

3．含量測(cè)定：

mi=（f1Ai1+f2Ai2）mS/AS第二法：用于有雜質(zhì)的干擾的情況，步驟如下：

1．皂化處理：皂化、乙醚提取、洗滌提取液、蒸除乙醚、制備供試液A。

2．凈化：供試液A經(jīng)液相色譜分離，準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，制備成供試液B。

固定相：ODS

流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（50：50：2）

3．含量測(cè)定：取供試液B按第一法測(cè)定。

第三法：用于經(jīng)第二法處理后仍有雜質(zhì)的干擾的情況。步驟如下：1．制備供試液：取供試液A，凈化，水浴加熱，得供試液C。

制備對(duì)照液：對(duì)照品儲(chǔ)備液：稀釋、加熱。

2．含量測(cè)定：在第一法的色譜條件下，交替精密進(jìn)樣對(duì)照液和供試液，按外標(biāo)法定量。苯并－二氫吡喃醇第五節(jié)維生素E主要的藥理作用：抗氧化劑、血管擴(kuò)張劑、抗凝血?jiǎng)⒏纳浦x等。主要來(lái)源：麥芽、大豆、植物油、堅(jiān)果類、芽甘藍(lán)、綠葉蔬菜、菠菜名稱R1R2相對(duì)活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***dl－α－生育酚醋酸酯結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、苯環(huán)+二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈1、UV2、乙?；姆恿u基易水解]O[醌型化合物△生育酚-+orOHHVitE雜質(zhì)，需檢查]O[生育紅（一）硝酸反應(yīng)橙紅色鑒別二、75℃15′HNO3VitE生育酚（橙紅色）生育紅生育酚HNO3強(qiáng)氧化劑三氯化鐵－聯(lián)吡啶反應(yīng)（二）生育酚對(duì)-生育醌[O]弱氧化劑血紅色=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%無(wú)水乙醇中UV法（三）ViE的紫外吸收光譜薄層板硅膠G展開(kāi)劑環(huán)己烷-乙醚（4：1）顯色劑硫酸（105℃5′）VitERf

=0.7-生育酚Rf

=0.5-生育醌Rf

=0.9TLC法（四）2.游離生育酚

雜質(zhì)檢查

三、原理酸度

以NaOH滴定液（0.1mol/L）體積不得超過(guò)0.5mL。（M生育酚=430.8）例

取本品0.10g，加無(wú)水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過(guò)1.0ml。≤2.15％限量四、含量測(cè)定GC法（法定方法）（一）GC特點(diǎn)1、選擇性好靈敏度高速度快分離效能好揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強(qiáng)→衍生化易受樣品蒸氣壓限制載氣→