基因組編輯技術(shù)及其應(yīng)用

基因組編輯(genomeediting)技術(shù)及其應(yīng)用基因組編輯(genomeediting)技術(shù)是針對目標基因組，通過插入、缺失或替換的手段對基因組中的靶基因進行定點改造：1、突變基因代替正?；颉蚬δ艿难芯?。2、正?；虼嫱蛔兓颉蛑委?。

應(yīng)用前景廣闊基因編輯技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點上，在這位點上剪斷靶標DNA片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變，又修改并編輯了原有的基因組，真正達成了“編輯基因”。與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細胞(embryonicstemcell，ES)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)保留了可定點修飾的特點，可應(yīng)用到更多的物種上，效率更高，構(gòu)建時間更短，成本更低。傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)主要包括：Cre-LoxP（細菌噬菌體）重組酶技術(shù)：Flp-Frt（酵母）重組酶技術(shù)：是條件性基因打靶、誘導(dǎo)性基因打靶、時空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心。該類技術(shù)雖然重組效率高，但實驗周期長，因此其應(yīng)用具有很大的局限性。Cre-LoxP定位重組系統(tǒng)來源于噬菌體P1，由Cre重組酶和LoxP位點兩部分組成。在Cre重組酶的介導(dǎo)下，設(shè)定的DNA片段可以被切除，可以發(fā)生倒位，亦可造成定點的整合。由于其作用方式高效簡單，Cre-LoxP定位重組系統(tǒng)已在特定基因的刪除、基因功能的鑒定、外源基因的整合、基因捕獲及染色體工程等方面得到了有效的利用，在轉(zhuǎn)基因的酵母、植物、昆蟲、哺乳動物的體內(nèi)外DNA重組方面成為一個有力的工具。RNA干擾

(RNAinterference，RNAi)RNAi技術(shù)的出現(xiàn)曾給基因治療的應(yīng)用帶來了很大的希望，但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，RNAi對靶基因的失活不完全，存在脫靶效應(yīng)，對細胞有一定的毒害作用，因此暫無法應(yīng)用于臨床治療之中。人工內(nèi)切核酸酶(engineeredendonuclease，EEN)技術(shù)人工內(nèi)切核酸酶技術(shù)的優(yōu)勢在于其擺脫了傳統(tǒng)基因組操作技術(shù)對于胚胎干細胞的依賴，并且能夠應(yīng)用于更多的物種，使基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用進入一個新的階段，因此有很大的潛力能夠在臨床上應(yīng)用。人工內(nèi)切核酸酶技術(shù)兩個關(guān)鍵步驟：1、利用構(gòu)建好的人工內(nèi)切核酸酶與靶DNA片段相結(jié)合并且特異性地切割基因組DNA，形成雙鏈斷裂結(jié)構(gòu)(double—strandbreak，DSB)。2、利用目的細胞內(nèi)的非同源末端連接(non—homologousandjoining，NHEJ)或同源重組(homologousrecombination，HR)系統(tǒng)來對形成雙鏈斷裂結(jié)構(gòu)進行修復(fù)，從而實現(xiàn)對目標基因組編輯。人工內(nèi)切核酸酶技術(shù)主要包括3種：1、鋅指核酸酶(Zinc．fingernucleases，ZFNs)技術(shù)2、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)技術(shù)3、CRISPR／Cas(ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsandCRISPRassociated)技術(shù)ZFNs技術(shù)ZFNs技術(shù)是最早發(fā)現(xiàn)的人工內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)基因組編輯技術(shù)，與傳統(tǒng)的方法相比其優(yōu)點是定點整合效率高，但由于其構(gòu)建難度大、費用高的缺點，使其應(yīng)用受到很大的限制。ZFNs技術(shù)1985年，Miller等首次在非洲爪蟾(Xenopulaevis)的轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactorIIIA，TFIIIA)中發(fā)現(xiàn)了具有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白(Zinc—fingerprotein，ZFP)。鋅指結(jié)構(gòu)是由多個Cys~His殘基通過Zn2+螯合而成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，根據(jù)其含有保守結(jié)構(gòu)域的不同，可以分為C2H2、C4和C6三種類型。鋅指結(jié)構(gòu)的特點在于能夠與相應(yīng)的DNA序列發(fā)生特異性的結(jié)合，ZFNs技術(shù)就是利用鋅指結(jié)構(gòu)的這一特點，通過人工合成的方法，將鋅指DNA結(jié)合域(Zinc—fingerDNA—bindingdomain)與相應(yīng)限制性內(nèi)切酶的DNA切割域(DNAcleavagedomain)融合在一起，使其能夠識別特定的結(jié)合位點并對靶DNA進行切割。典型的ZFNs一般包含有3-6個獨立的鋅指結(jié)構(gòu)，每個鋅指結(jié)構(gòu)能夠識別3bp長度的堿基，因此，一個ZFNs能夠識別9—18bp長度的堿基。最常用的ZFNs一般包含有3個鋅指結(jié)構(gòu)，以DNA鏈上3'-5'的順序分別命名為F1(Finger1)、F2(Finger2)和F3(Finger3)，而鋅指DNA結(jié)合域與DNA切割域則通過連接區(qū)(Linker)相結(jié)合。ZFNs技術(shù)中使用得最多的限制性內(nèi)切酶為Fokl，該酶是一種IIS型限制性內(nèi)切酶，其能夠特異性地識別DNA分子上的靶位點(CCGG)并在下游對其進行切割。當(dāng)2個ZFNs分子同時與DNA結(jié)合時，其能在2個結(jié)合位點的間隔區(qū)發(fā)生切割作用，從而形成DNA雙鏈斷裂區(qū)。雙鏈DNA斷裂后，受體細胞會啟動兩種不同的DNA損傷修復(fù)機制：1、在沒有外源同源序列的情況下，細胞啟動NHEJ修復(fù)機制將斷開的DNA末端重新連接起來；2、在存在外源同源序列的情況下，細胞就可以啟動HR修復(fù)機制。利用這些機制，可以實現(xiàn)基因敲進和基因修復(fù)，同時如果外源的同源序列是不完整的，便可以達到基因組編輯的效果。TALENs技術(shù)TALENs技術(shù)與ZFNs技術(shù)相比其優(yōu)點在于構(gòu)建更為簡單，細胞毒性較低，但構(gòu)建成本仍然偏高，并且有其應(yīng)用的局限性。TALENs技術(shù)是近年發(fā)展起來一種對基因組進行定點編輯的新技術(shù)，由于其具有高效的特點，20l2年Science選為年度十大科學(xué)突破。TALENs核酸酶由兩個部分組成：1、TALE蛋白2、核酸內(nèi)切酶TALE蛋白家族是一類來源于植物病原菌黃單胞桿菌(Xanthomonas)的分泌蛋白，1989年，Bonas等第一次發(fā)現(xiàn)了該蛋白家族的成員AvrBs3。TALE蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)相類似它可以通過調(diào)控宿主植物中相關(guān)內(nèi)源基因的表達量，從而使病原菌更容易侵染植物。TALE蛋白是由N端序列(N-terminalsequence，NTS)、中心重復(fù)區(qū)和C端序列(C—terminalsequence，CTS)這3部分組成，其中蛋白質(zhì)的N端一般含有轉(zhuǎn)運信號(translocationsignal)，C端含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)和核定位信號(nuclearlocalizationsignal，NLS)，其中核定位信號主要為一個異位結(jié)構(gòu)域。TALE蛋白結(jié)構(gòu)圖中心重復(fù)區(qū)由12～30個重復(fù)單元組成，每個單元含有34個氨基酸殘基，該單元除了12和13位重復(fù)可變雙氨基酸殘基(repeatvariantdiresidues，RVD)序列外，其他序列完全相同。RVD序列決定了TALE蛋白的識別堿基的特異性。不同的RVD能夠分別對應(yīng)識別A、T、G、C堿基中的一種或多種。在應(yīng)用過程中最常見的4種RVD分別為HD(His-Asp)、NG(Asn-Gly)、NI(Asn-Ile)、NN(Asn-Asn)。HD識別C，NG識別T，NI識別A，NN識別G或A。CTS序列含有核定位信號及轉(zhuǎn)錄激活因子，其功能是幫助TALE蛋白從細胞質(zhì)進入細胞核并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。核酸內(nèi)切酶Fok1只有形成二聚體時才具有酶切活性。與ZFNs技術(shù)相似，當(dāng)Fok1二聚體對DNA雙鏈進行切割時，會引發(fā)NHEJ或HR修復(fù)機制，利用該機制可以達到基因組編輯的效果。CRISPR／Cas技術(shù)CRISPR／Cas：成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列與Cas蛋白(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR／Cas）CRISPR／Cas技術(shù)作為一種構(gòu)建簡單、成本低的人工內(nèi)切核酸酶技術(shù)，因其具有較高切割效率并在多種生物中都有廣泛的應(yīng)用前景，被Science雜志評為2013年十大科學(xué)突破之一。CRISPR／Cas技術(shù)在自然環(huán)境中由于噬菌體的存在，細菌在長期的選擇壓力下進化出了CRISPR／Cas免疫防御機制，CRISPR／Cas系統(tǒng)是由RNA介導(dǎo)的，可遺傳的有效的獲得性免疫機制，存在于約40％的細菌和90％的古細菌中，該系統(tǒng)主要是細菌為抵抗噬菌體或質(zhì)粒所帶來外源DNA片段入侵的免疫系統(tǒng)。CRISPR重復(fù)序列家族的結(jié)構(gòu)通常由一個前導(dǎo)區(qū)(Leader、重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和間隔區(qū)(Spacer)所組成，Leader區(qū)是一段長約300～500bp左右富含AT堿基的DNA序列，其位于CRISPR基因簇上游，該區(qū)段序列在同一物種內(nèi)相對保守，但在不同物種之間差距很大。Repeat區(qū)是一段長約24-48bp的序列相對保守的回文序列-同向重復(fù)序列(directrepeat，DR)，該序列打開后能形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。Repeat區(qū)序列并不連續(xù)，中間被長度約為26～72bp的Spacer區(qū)所分隔。

Spacer區(qū)序列與一些噬菌體和質(zhì)粒的序列存在一定程度的同源性，使該系統(tǒng)能夠特異性地識別一些噬菌體和質(zhì)粒從而抵抗外源基因的侵染。當(dāng)噬菌體入侵細菌的起始階段，Cas蛋白復(fù)合物與噬菌體中相應(yīng)的原型間隔序列(proto-spacer)相結(jié)合并裂解相關(guān)序列，裂解后的proto-spacer序列整合到CRISPR位點的重復(fù)序列之間，隨即被轉(zhuǎn)錄成為crRNA(CRISPRRNA)，并且crRNA的兩側(cè)還保留有部分Repeat序列.當(dāng)宿主再次被噬菌體侵染時，crRNA能夠靶向噬菌體的proto-spacer序列并將其降解，而Cas是與CRISPR序列相關(guān)的(CRISPR-associated)核酸內(nèi)切酶(如Cas9)，這個CRISPR/Cas能和一段與靶DNA片段匹配的20個核苷酸長度的單導(dǎo)向RNA(single-guideRNA，sgRNA)一道，構(gòu)成RNA引導(dǎo)性核酸酶(CRISPR-CasRNA-guidednucleases，CRISPR/CasRGNs)免疫系統(tǒng)。同一個物種CRISPR位點的DR區(qū)域絕大多數(shù)非常保守，部分間區(qū)序列與噬菌體、大質(zhì)粒等外源基因組具有高度同源性，這些同源部分被稱作原型間區(qū)序列(proto-spacer)。sgRNA由crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)兩種非編碼RNA通過堿基配對結(jié)合而成。Cas9與sgRNA協(xié)同作用，在原型間區(qū)序列鄰近基序(proto-spaceradjacentmotif，PAM)限定的位點上剪切雙鏈DNA(PAM區(qū)的序列要求為NGG，即Cas9靶點的通式為(5’-GN19NGG-3’)。由于Cas9含有1個RuvC-like核酸酶功能域和1個McrA-likeHNH核酸酶功能域，因此在識別的靶位點處，McrA-likeHNH核酸酶結(jié)構(gòu)域剪切互補鏈，而RuvC-like結(jié)構(gòu)域剪切非互補鏈。CRISPR／Cas系統(tǒng)分型I型CRISPR／Cas系統(tǒng)：使用Cas3蛋白II型CRISPR／Cas系統(tǒng)：使用Cas9蛋白III型CRISPR／Cas系統(tǒng)：使用Cas6蛋白CRISPR／Cas9系統(tǒng)CRISPR／Cas系統(tǒng)在基因組編輯方面具有優(yōu)勢，就II型系統(tǒng)來說僅需要一段20bp的DNA序列和Cas9蛋白。目前，已有商品化的質(zhì)粒供研究者選擇，僅需將20bp的sgRNA克隆到CRISPR／Cas9質(zhì)粒即可?；蚓庉嬓录夹g(shù)的異同點比較ZFN與TALEN共同點：(1)兩者都是人工改造的核酸內(nèi)切酶:有1個DNA識別域特異性地識別靶位點，有1個核酸內(nèi)切酶特異性剪切DNA雙鏈，兩者配合著行使功能。(2)同時使用FokⅠ家族的核酸內(nèi)切酶:FokⅠ是來自海床黃桿菌的一種限制性內(nèi)切酶，只有形成二聚體時才能發(fā)揮酶切活性。(3)切割后的DNA修復(fù)機制相同:在2個靶位點之間剪切DNA，在DSB處誘發(fā)DNA的NHEJ或HR損傷修復(fù)機制。ZFN與TALEN不同點：(1)開發(fā)時間:相對于2007年才起步的TALEN技術(shù)，ZFN技術(shù)的研發(fā)和商業(yè)化已相當(dāng)成熟。(2)目標序列的識別:鋅指結(jié)構(gòu)域識別的是三聯(lián)堿基，而TALEN結(jié)構(gòu)域識別的是單一的核苷酸。如果一個蛋白質(zhì)包括3個鋅指結(jié)構(gòu)的話，它可以識別9個堿基對的片段，而TALEN則需要9個重復(fù)單元的可變雙氨基酸殘基位點。但TALE的核酸識別單元與任一堿基(A、G、C、T)有恒定的對應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建時不受基因序列、細胞、物種等的限制，并且設(shè)計簡單、實驗周期短、成本低，具有與ZFN相等或更好的活性。(3)上下文依賴效應(yīng):ZFN在識別DNA位點時，存在著上下文依賴效應(yīng)。即識別DNA的重復(fù)氨基酸之間會產(chǎn)生相互作用，使得識別特異性發(fā)生改變，從而影響基因打靶的效果。但目前尚未見TALEN具有上下文依賴效應(yīng)的報道。(4)脫靶效應(yīng):鋅指酶切割時會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，從而產(chǎn)生毒副作用。TALEN的脫靶情況少，毒性低。(5)靶向基因序列的長度:TALEN可以靶向較長的基因序列，而ZFN的靶向基因序列較短。CRISPR-Cas與ZFN和TALENCRISPR-Cas系統(tǒng)通過對目標序列的識別及核酸酶的剪切來造成靶位點的雙鏈斷裂。因此理論上，只要將DNA功能識別域和核酸內(nèi)切酶換成sgRNA和Cas9，就能對任意基因組進行編輯。但CRISPR-CasRGNs相對于ZFNs和TALENs來說，具有優(yōu)勢:CRISPR-Cas優(yōu)勢

(1)ZFN和TALEN需要針對不同靶點合成和組裝不同的識別序列，耗時耗力且成本高，而CRISPR-Cas系統(tǒng)只需要改變一段短的RNA序列即可識別不同的位點，更加方便經(jīng)濟。構(gòu)建動物模型時，ZFN和TALEN需要每次都轉(zhuǎn)錄為mRNA，而CRISPR-Cas系統(tǒng)只需要一次Cas核酸酶轉(zhuǎn)錄就可完成多次試驗，難度大為降低。(2)CRISPR-Cas系統(tǒng)可同時剪切靶基因上多個位點，而ZFN和TALEN只能單次單個。(3)crRNA和tracrRNA還可以重新裝配成sgRNA，其包含的序列足以編程Cas9，介導(dǎo)靶DNA雙鏈斷裂及隨后的修復(fù)或者靶向性基因置換。Cas9/sgRNA的主要缺點5'-GN19NGG-3'的結(jié)構(gòu)有時會出現(xiàn)限制性，會在預(yù)期靶點以外的位點上生成多余的DNA突變，脫靶位點的突變率有可能和靶位點一樣甚至更高。在脫靶率降下來或精確度提上去之前，這種混雜效應(yīng)可能使得現(xiàn)有的RGN平臺還無法鑒別人類細胞中任何給定RGN的所有潛在脫靶位點，因而現(xiàn)在還不適合治療應(yīng)用。人們正在尋求利用計算機模型計算出最佳編輯位點，或者增加sgRNA的數(shù)量與長度，或者優(yōu)化RNA片段讓其包含穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，總之就是力求在高目標效應(yīng)和低脫靶效應(yīng)間找到一個最優(yōu)平衡點。同源重組：腺相關(guān)病毒(AAV)腺相關(guān)病毒(AAV)是一個常見的人細小病毒，自然缺陷、無包被和無致病原性。AAV復(fù)制周期由兩個明顯的階段構(gòu)成：潛伏期和增殖期。在缺少輔助病毒諸如腺病毒(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)、皰疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒條件下(Yakobson等,1989),AAV能復(fù)制產(chǎn)生子代病毒顆粒。在缺少輔助病毒的情況下，腺相關(guān)病毒整合其基因組到19號染色體的一個特別位點并保持整合直到隨后的輔助病毒將其從潛伏狀態(tài)下拯救出來(Kotin等，1990)。AAV的位點特異性的整合能力、其自然缺陷以及其無致病原性使其成為基因治療載體成為可能。慢病毒CAS9細胞基因敲除全套解決方案人工改造過的CRISPR/CAS9系統(tǒng)通過gRNA（shortguideRNA）引導(dǎo)Cas9蛋白識別并剪切帶有g(shù)RNA靶點的雙鏈DNA，用于基因敲除和精確編輯DNA等操作。要在難轉(zhuǎn)染的細胞上做基因編輯等操作，需要CRISPR/CAS9技術(shù)配合一個高效率的轉(zhuǎn)基因方式——慢病毒CAS9系統(tǒng)。全套解決方案一、gRNA靶點的選擇CAS9/gRNA剪切活性與gRNA靶點的識別序列有關(guān)，每個gRNA靶點的剪切活性都會不同，但存在大概1/4的靶點本身沒有切割活性。為了避免因為靶點自身沒有切割活性而導(dǎo)致基因編輯失敗，白白浪費轉(zhuǎn)基因成本和漫長等待的時間，必須先對設(shè)計好的gRNA靶點做切割活性驗證。對于難轉(zhuǎn)染的細胞和不方便做內(nèi)源活性驗證的情況可以用CAS9體外酶切法檢測gRNA靶點切割效率。此方法不需要構(gòu)建打靶質(zhì)粒就可以針對設(shè)計好的靶點，用CAS9酶在EP管里酶切帶有靶點的DNA片段后跑電泳顯示，而且僅需兩天的操作。體外Cas9酶切DNA效果與DNA濃度、Cas9酶量、反應(yīng)時間、gRNA的量、靶點活性有關(guān)，為了科學(xué)地評價gRNA靶點效率，將固定DNA濃度和Cas9酶量，在一定單位時間內(nèi)，測量Cas9酶切靶點DNA的效率，并通過與已知有活性的gRNA靶點進行比較，評價目標gRNA靶點的活性。選擇切割效率高的gRNA靶點包裝慢病毒，既降低了多余無效靶點的包裝成本，又減輕了后續(xù)病毒侵染及突變體克隆篩選的工作量。二、慢病毒載體的選擇三、慢病毒包裝慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究。在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，提供基因編輯功能。多個靶點（2-3個為宜）的慢病毒CAS9毒液侵染目的細胞后，通過流式或者藥物篩選出侵染成功的混合克隆細胞，取大概1/10的混合克隆細胞提取基因組DNA，使用T7E1非配對內(nèi)切酶法進行內(nèi)源活性檢測，對T7E1酶切陽性的PCR產(chǎn)物連T載體測序進一步確定。五、單克隆篩選選擇T7E1酶切陽性率高且經(jīng)過測序確認的混合克隆細胞鋪單克隆，等長滿后一個個使用T7E1非配對內(nèi)切酶法初篩，再結(jié)合T載體克隆測序進一步鑒定，并跟野生型對比，確定具體突變?；蚯贸?/p>

基因敲除是將細胞基因組中某基因去除或使基因失去活性的技術(shù)。去除原核生物細胞、真核生物的生殖細胞、體細胞或干細胞基因組中的基因等。廣義的基因敲除包括某個或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因調(diào)控序列的敲除以及成段基因組序列的敲除。常用同源重組的方法。敲除的基因用以觀察生物或細胞的表型變化，是研究基因功能的重要手段?；蚯贸?發(fā)明者此技術(shù)是由馬里奧·卡佩奇、馬丁·埃文斯與奧利弗·史密斯所開發(fā)，最初是以基因敲除小鼠（knockout

mouse，昵稱：KO

mouse）完成實驗，三人并因此獲得2007諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。基因敲除-常用技術(shù)一、利用同源重組進行基因敲除二、利用隨機插入突變進行基因敲除三、RNA干擾引起的基因敲除四、單克隆抗體—抑制與其相對應(yīng)的蛋白功能五、小分子化合物—能與基因或蛋白相互作用一、利用同源重組進行基因敲除利用DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)，將含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體導(dǎo)入靶細胞，通過載體與靶細胞染色體上同源序列間的重組，將外源基因整合入內(nèi)源基因組內(nèi)，使外源基因得以表達。二、利用隨機插入突變進行基因敲除大規(guī)模的隨機插入突變，它為在基因組范圍內(nèi)敲除掉任何一個基因提供了可能。這項技術(shù)具有效率高、基因完全失活、容易分離鑒定被插入引起失活的目的基因等優(yōu)點。隨機插入突變可以分為T-DNA插入突變和轉(zhuǎn)座子插入突變。

三、RNA干擾引起的基因敲除RNA干擾（RNA

interference,RNi）是一種普遍的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機制，由siRNA（small

intereferenceRNA）引起，siRNA是外源基因產(chǎn)生的dsRNA在Dicer酶的作用下所產(chǎn)生的長度為21-22nt的一系列片段的總稱，具有很強的關(guān)閉基因的功能，能夠介導(dǎo)RNA干涉現(xiàn)象，誘導(dǎo)出一種由siRNA核酸酶以及螺旋酶等結(jié)合在一起的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced

silencingcomp

lex,RISC）。RISC能夠解開siRNA并精確的指導(dǎo)特異mRNA降解。通過將dsRNA分子導(dǎo)入細胞內(nèi)，特異性地降解細胞內(nèi)與其同源的mRNA，封閉內(nèi)源性基因的表達來失活該基因同樣可以實現(xiàn)基因的敲除?；蚯贸?基本步驟利用基因打靶技術(shù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的程序一般為：1、獲得ES細胞2、構(gòu)建基因載體3、將基因打靶載體導(dǎo)入同源的胚胎干細胞（EScell）中4、用選擇性培養(yǎng)基篩選打靶成功細胞5、觀察基因變化小鼠的生物學(xué)形狀的改變1、獲得ES細胞現(xiàn)在基因敲除一般應(yīng)用于鼠，而最常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。

2、構(gòu)建基因載體把目的基因和與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標記基因（如neo基因，TK基因等）的載體上，此重組載體即為打靶載體。3、將基因打靶載體導(dǎo)入同源的胚胎干細胞（EScell）中將基因打靶載體通過一定的方式（常用電穿孔法）導(dǎo)入同源的胚胎干細胞（EScell）中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將打靶載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中從而得以表達。4、用選擇性培養(yǎng)基篩選打靶成功細胞

一般地，篩選使用正、負選擇法，比如用G418篩選所有能表達neo基因的細胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表達的細胞，剩下的細胞為命中的細胞。將篩選出來的靶細胞導(dǎo)入鼠的囊胚中，再將此囊胚植人假孕母鼠體內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合體小鼠。

5、觀察基因變化小鼠的生物學(xué)形狀的改變通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的。

缺陷隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不足和缺陷都已經(jīng)解決，但基因敲除技術(shù)始終存在著一個難以克服的缺點，即敲掉一個基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：一方面，許多基因在功能上是冗余的，

敲掉一個在功能上冗余的基因，并不能造成容易識別的表型，因為基因家族的其他成員可以提供同樣的功能；另一方面對于某些必需基因，敲除后會造成細胞的致死性，也就無法對這些必需基因進行相應(yīng)的研究了?；蚯贸?應(yīng)用1、

建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料

2、

改造動物基因型，鑒定新基因和/或其新功能，研究發(fā)育生物學(xué)

3、

治療遺傳病，這包括去除多余基因或修飾改造原有異?；蛞赃_到治療的目的。

4、

改造生物、培育新的生物品種。

基因打靶技術(shù)的新進展

ａ．條件性打靶

條件性基因打靶(conditionalgenetargeting)可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因打靶方法。它實際上是在常規(guī)的基因打靶的基礎(chǔ)上，利用重組酶介導(dǎo)的位點特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設(shè)置一個可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。利用Cre／LoxP和來自酵母的FLP—frt系統(tǒng)可以研究特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導(dǎo)致的表型。通過常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點上裝上兩個同向排列的loxP，并以此兩側(cè)裝接上loxP的(“l(fā)oxPfloxed”)ES細胞產(chǎn)生“l(fā)oxPfloxed”小鼠,然后，通過將“l(fā)oxPfloxed”小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因鼠雜交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre重組酶)，產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠。在“l(fā)oxP

floxed”小鼠，雖然靶基因的兩側(cè)已各裝上了一個loxP，但靶基因并沒有發(fā)生其他的變化，故“l(fā)oxPfloxed”小鼠表型仍同野生型的一樣。

但當(dāng)它與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交時，產(chǎn)生的子代中將同時帶有“l(fā)oxP

floxed”靶基因和Cre基因。Cre基因表達產(chǎn)生的Cre重組酶就會介導(dǎo)靶基因兩側(cè)的1oxP間發(fā)生切除反應(yīng)，結(jié)果將一個loxP和靶基因切除。這樣，靶基因的修飾(切除)是以Cre的表達為前提的。Cre的表達特性決定了靶基因的修飾(切除)持性：即Cre在哪一種組織細胞中表達，靶基因的修飾(切除)就發(fā)生在哪種組織細胞；而Cre的表達水平將影響靶基因在此種組織細胞中進行修飾的效率。所以只要控制Cre的表達特異性和表達水平就可實現(xiàn)對小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。ｂ．誘導(dǎo)性打靶

誘導(dǎo)性基因打靶就是以Cre/loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)、利用控制Cre表達的啟動子的活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)的特點，通過對誘導(dǎo)劑給予時間的控制或利用Cre基因定位表達系統(tǒng)中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)的過程在時間上的可控性、從而在loxP動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因打靶技術(shù)。

人們可以通過對誘導(dǎo)劑給予時間的預(yù)先設(shè)計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見的幾種誘導(dǎo)性打靶類型如下：四環(huán)素誘導(dǎo)型；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。其優(yōu)點有：1、誘導(dǎo)基因突變的時間可人為控制；2、可避免因基因突變而致死胎的問題;3、在2個loxP位點之間的重組率較高；4、如用病毒或配體／DNA復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來介導(dǎo)Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉(zhuǎn)基因動物的過程。如果在Cre—ERT和Ad—Cre表達系統(tǒng)中采用組織細胞特異的啟動子來控制Cre的表達，其誘導(dǎo)的基因重組的組織細胞特異性還可進一步提高。c.基因捕獲技術(shù)典型的基因捕獲載體包括一個無啟動子的報道基因，通常是neo基因，neo基因插入到ES細胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實現(xiàn)表達的ES克隆可以很容易地在含G418的選擇培養(yǎng)基中篩選出來，從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活的克隆應(yīng)該100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過篩選標記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來獲得。用基因捕獲法在單次實驗中可以獲得數(shù)以百計的帶有單基因剔除的ES克隆。這些克隆可以在96孔培養(yǎng)板中生長、復(fù)制并用于基因型分析，大規(guī)模地保存和分析中靶ES細胞在小型的實驗室中也是可行的。此方法的缺點是只能剔除在Es細胞中表達的基因．單種的細胞類型中表達的基因數(shù)目約為I04，現(xiàn)在的基因捕獲載體從理論上來講應(yīng)能剔除所有在ES細胞表達的基因，因此，在ES細胞中進行基因捕獲還是大有可為的。

在體細胞中應(yīng)用基因捕獲可以剔除更多在發(fā)育晚期才表達的基因，其后通過核移植技術(shù)獲得帶有突變基因的動物個體、這不失為一種可以彌補以上缺陷的辦法。用基因捕獲法進行基因剔除的另一個缺點是無法對基因進行精細的遺傳修飾，基因編輯新技術(shù)的應(yīng)用基因功能研究基因敲除是在活體動物上驗證基因功能必不可少的邏輯環(huán)節(jié)，但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、ES細胞篩選、嵌合體動物模型選育等一系列步驟，成功率受到多方面因素的限制。即使對于技術(shù)比較成熟的實驗室，利用傳統(tǒng)技術(shù)敲除大鼠或小鼠身上的某個基因一般也需要1年以上。基因編輯新技術(shù)則不然，敲除基因高效快速，是研究基因功能的有力工具。ZFN技術(shù)已在大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥、玉米、煙草等模式生物或經(jīng)濟物種的細胞或胚胎中以及包括誘導(dǎo)多能干細胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)在內(nèi)的人體外培養(yǎng)細胞系中成功地實現(xiàn)了內(nèi)源基因的定點突變，其中在果蠅、斑馬魚、大鼠等物種中還獲得了可以穩(wěn)定遺傳的突變體。2009年，威斯康辛醫(yī)學(xué)院、SangamoBiosciences、Sigma-Aldrich等多家機構(gòu)使用ZFN技術(shù)，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且?guī)в性撏蛔兊拇笫笏暮蟠瑯訋в性摶蛲蛔?。GEURTSAM，COSTGJ，F(xiàn)REYVEＲTY，etal．Knockoutratsviaembryomicroinjectionofzinc-fingernucleases［J］．Science，2009，325(5939):433．CUIX，JID，F(xiàn)ISHEＲDA，etal．Targetedintegrationinratandmouseembryoswithzinc-fingernucleases［J］．NatBiotechnol，2010，29(1):64－67．MENGX，NOYESMB，ZHULJ，etal．Targetedgeneinactivationinzebrafishusingengineeredzinc-fingernucleases［J］．NatBiotechnol，2008，26(6):695－701．BEUMEＲKJ，TＲAUTMANJK，BOZASA，etal．EfficientgenetargetinginDrosophilabydirectembryoinjectionwithzinc-fingernucleases［J］．PNAS，2008，105(50):19821－19826ZHANGF，MAEDEＲML，UNGEＲ-WALLACEE，etal．HighfrequencytargetedmutagenesisinArabidopsisthalianausingzincfingernucleases［J］．PNAS，2010，107(26):12028－12033．TwosmallheartswereformedinaCas9/gRNA-inducedmutant(right),whichphenocopiedthatinthefautm236ageneticmutant,GenomeeditinginhumancellsusinganengineeredtypeIICRISPRsystem基因治療傳統(tǒng)的基因治療是將正常的基因片段引入細胞中替代有缺陷的基因，但這種方法難以精準控制，可能產(chǎn)生很大的毒副作用?；蚓庉嬓录夹g(shù)可以精確定位，在靶位點進行修正或進行基因切除，達到基因治療的目的。Lietal利用ZFN技術(shù)能在染色體上精確定位的優(yōu)勢，通過“剪切”和“粘貼”基因，在實驗小鼠體內(nèi)實現(xiàn)了血友病治療，避免了傳統(tǒng)基因療法帶來的插入誘變風(fēng)險，首次取得了基因組編輯在基因療法上的突破。Yusaetal利用ZFN技術(shù)矯正了iPSC中的1個胰島素缺陷突變基因。Bacmanetal利用FokⅠ核酸結(jié)構(gòu)域開發(fā)出了一種切口酶(nickase)，修飾后的切口酶只引起單鏈斷裂，不想要的切口可通過細胞的單鏈斷裂修復(fù)機制得到修復(fù)。雖然這種切口酶在靶位點上的效率低于核酸酶，但由于其不會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，對受到脫靶效應(yīng)限制的基因治療將更加實用。Bacmanetal利用TALEN技術(shù)清除了來自于病人線粒體內(nèi)的有病DNA。這是TALEN首次應(yīng)用于線粒體基因的編輯，這項研究有望用于治療母系遺傳的線粒體病。在