實(shí)驗(yàn)二大腸菌群的檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)二大腸菌群的檢驗(yàn)第一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37℃培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5℃培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌（依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)）第二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群和大腸桿菌是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過(guò)污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國(guó)際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌。近年來(lái)，有些國(guó)家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測(cè)作為微生物污染狀況的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評(píng)估指標(biāo)。第三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)：

此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過(guò)10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。第四頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日大腸桿菌的生物學(xué)特性培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。最適生長(zhǎng)溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍15-46℃。

在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有3種菌落形態(tài)：

1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤(rùn)、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；

2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；

3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。第五頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日大腸菌群及大腸桿菌測(cè)定

——MPN法檢驗(yàn)流程（FDABAM）

檢樣50g+450ml稀釋液適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯（每管9mlLST肉湯并加有導(dǎo)管），每管接種1mL35℃，24±2h~48±2h

沒(méi)有產(chǎn)氣管有產(chǎn)氣管報(bào)告陰性接種BGLB肉湯管接種EC肉湯

35±℃，48±2h44.5±0.5℃（水浴培養(yǎng)）

24±2h~48±2h

查MPN表報(bào)告結(jié)果產(chǎn)氣管接種EMB平板（35℃、18~24h）

（大腸菌群）從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜面，進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接種LST復(fù)檢產(chǎn)氣查MPN表報(bào)告結(jié)果（大腸桿菌）

第六頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日大腸菌群測(cè)定——MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說(shuō)明MPN檢索表：

MPN為最大可能數(shù)(MostProbableNumber)的簡(jiǎn)稱。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：

1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長(zhǎng)，這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slowlactosefermentations）”來(lái)促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。

2）初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。產(chǎn)氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。

第七頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日大腸桿菌測(cè)定——EMB選擇性分離鑒別EMB平板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無(wú)綠色金屬光澤第八頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日大腸桿菌測(cè)定——EMB選擇性分離鑒別EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；高壓滅菌可使得美藍(lán)還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲(chǔ)存及培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)都應(yīng)在避光條件。菌名菌落形態(tài)大腸埃希氏菌紫黑色，有綠色金屬光澤肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深陰溝腸桿菌粉色，中心色深弗氏志賀氏菌無(wú)色鼠傷寒沙門氏菌無(wú)色糞鏈球菌無(wú)色第九頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色基本原理：革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細(xì)菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌兩大類。革蘭氏染色的機(jī)理主要是利用兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí)，類脂質(zhì)被溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏色。第十頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色基本步驟：將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗；滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。第十一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日大腸桿菌測(cè)定——生化鑒定Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole紅色環(huán)不變色+-Kovacs’MR紅色不變色++甲基紅V-P玫瑰紅色環(huán)不變色--V-P甲、乙液Citrate生長(zhǎng)不生長(zhǎng)---第十二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)二大腸菌群的檢驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)食品中大腸菌群檢測(cè)程序、方法；2、掌握食品中大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告方式。二、實(shí)驗(yàn)材料1、設(shè)備和材料溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計(jì)、平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針2、培養(yǎng)基及試劑乳糖—膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、革蘭氏染色液第十三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日GB4789.3-2010大腸菌群計(jì)數(shù)第十四頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日GB4789.3-2010大腸菌群計(jì)數(shù)第十五頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日第十六頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日（一）最先準(zhǔn)備的器材規(guī)格名稱 數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個(gè) 稀釋樣品2、250ml三角瓶 1個(gè) 制EMB瓊脂3、18×180mm試管9支單料乳糖膽鹽發(fā)酵管4、18×180mm試管 3支 稀釋樣品（9ml）5、1ml移液管 5支6、10ml移液管 3支7、直徑為90mm平皿 2套 制EMB平板8、250ml量筒 1支9、玻璃珠：直徑約5mm（二）應(yīng)滅菌消毒的器材剪刀1把不銹鋼藥匙1把滴管膠頭5只稱量紙適量第十七頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基總量所用容器蒸餾水225ml500ml三角瓶蒸餾水9ml/3支27ml18×180mm試管（稀釋樣品）乳糖膽鹽發(fā)酵管（單料）：10ml/9支

100ml 18×180mm試管(裝杜氏小管)EMB瓊脂：1瓶150ml250ml三角瓶（每組配一瓶） 第十八頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日蛋白胨20g、膽鹽5g、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、蒸餾水1000ml（將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正PH值至7.4，加入指示劑）；或購(gòu)買制好的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、按說(shuō)明配置。分裝試管，每管10ml，并放入一個(gè)到氣管（杜氏小管），高壓滅菌115℃、15分鐘。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基除蒸餾水外，其它成分加倍。乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基：P99第十九頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日A.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯A.1.1成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸餾水1000mLpH6.8±0.2A.1.2制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。第二十頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日A.2煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯A.2.1成分蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液200mL0.1%煌綠水溶液13.3mL蒸餾水800mLpH7.2±0.1A.2.2制法將蛋白胨、乳糖溶于約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5），用蒸餾水稀釋到975mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL，用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL，用棉花過(guò)濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。第二十一頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日A.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）A.3.1成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化鈉5.0g膽鹽或3號(hào)膽鹽1.5g中性紅0.03g結(jié)晶紫0.002g瓊脂15g～18g蒸餾水1000mLpH7.4±0.1A.3.2制法將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢?，調(diào)節(jié)pH。煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至45℃～50℃傾注平板。使用前臨時(shí)制備，不得超過(guò)3h。第二十二頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日

蛋白胨10.0g

乳糖10.0g

磷酸氫二鉀2.0g

瓊脂15.0g

伊紅γ0.4g

美藍(lán)0.065g

或20ml伊紅γ(20g/L)和10ml美藍(lán)(6.5g/L)

蒸餾水1000.0mL

最終pH7.1±0.2(25℃)

先將蒸餾水中加入磷酸氫二鉀及蛋白胨、乳糖使之溶解，后加瓊脂加熱溶解，再調(diào)pH=7.2-7.4,再加入伊紅,美藍(lán)水溶液,

高壓滅菌115℃、15分鐘。

蛋白胨提供細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育所需的氮源、維生素和氨基酸，乳糖提供發(fā)酵所需的碳源，磷酸氫二鉀維持緩沖體系，伊紅Y和美藍(lán)抑制絕大部分革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)。瓊脂是凝固劑。大腸桿菌在EMB上發(fā)酵乳糖，形成黑色菌落，大部分有金屬光澤。沙門氏菌形成無(wú)色菌落。金黃色葡萄球菌基本上不生長(zhǎng)。

EMB（伊紅美藍(lán)瓊脂）第二十三頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日質(zhì)控：此培養(yǎng)基呈紫色，可有細(xì)微沉淀。質(zhì)控菌株接種后，35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，觀察結(jié)果應(yīng)如下表所示：菌株菌號(hào)生長(zhǎng)情況菌落產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048好粉紅，無(wú)光澤大腸埃希氏菌ATCC25922好，極好有紫綠金屬光澤中心肺炎克雷伯氏菌ATCC13883好綠金屬光澤，有黑心奇異變形桿菌ATCC25933好，極好無(wú)色鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028好，極好無(wú)色金黃色葡萄球菌ATCC25923被抑制－第二十四頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日說(shuō)明：（1）伊紅又稱署紅或四溴熒光素，為酸性染料。美藍(lán)又稱亞甲藍(lán)，為堿性染料。當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí)，細(xì)菌帶正電荷，染上紅色，再與美藍(lán)結(jié)合而形成紫黑色菌落，并有綠色金屬光澤。二者除了作為指示劑外，還有抑制格蘭氏陽(yáng)性菌的作用。（2）在堿性環(huán)境中，不分解乳糖產(chǎn)酸的細(xì)菌不著色。伊紅、美藍(lán)不能結(jié)合，故沙門氏菌和志賀氏菌等為無(wú)色或琥珀色半透明菌落。（3）此培養(yǎng)基用于鑒別大腸桿菌及產(chǎn)氣桿菌，并可快速鑒定白色念珠菌及鑒定凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌。美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)和美國(guó)細(xì)菌協(xié)會(huì)推薦，用于增殖或鑒別大腸桿菌的檢查。但某些沙門氏菌、志賀氏菌可被抑制。培養(yǎng)基保存應(yīng)注意避光防止氧化。

第二十五頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日樣品1.酸奶12.鮮奶3.水樣14.水樣25.水樣36.水樣47.水樣58.酸奶2第二十六頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日A1組酸奶1

A2組

水樣1

A3組水樣2

A4組水樣3

第二十七頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日B1組鮮奶

B2組水樣4

B3組水樣5

B4組酸奶2

第二十八頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1、采樣及稀釋①以無(wú)菌操作將檢樣25g（或25ml）放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無(wú)菌均質(zhì)器，以800r/min～1000r/min的速度處理1min，做成1：10的稀釋液。②用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1：100的稀釋液，換用1支1ml滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液第二十九頁(yè)，共三十七頁(yè)，2022年，8月28日2.乳糖初發(fā)酵試驗(yàn)即通常所說(shuō)的假定試驗(yàn)。其目的在于檢查樣品中有無(wú)發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml及1ml以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種3管，置（36±1）0C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)（24±2）h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進(jìn)行③根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣品污染情況估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。10，100,1000倍稀釋（-1，-2，-3）第三十頁(yè)，共三十七頁(yè)，202