PCR技術(shù)及重組DNA技術(shù)

PCR技術(shù)及

重組DNA技術(shù)PCR技術(shù)一、PCR的基本原理PCR反應(yīng)體系PCR過程PCR的特點(diǎn)PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系模板DNA0.1～2ug4種dNTP混合物各200umol/L特異性引物各10～100pmolDNA聚合酶2.5uPCR緩沖液：Tris-Hcl10mmoL/LKcl50mmol/LMg2+1.5mmol/L乙酰BSA0.1mg/mlPCR的基本原理PCR反應(yīng)體系PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)體系PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍MOVIEPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

重復(fù)30輪后230=1,073,741,8241.8530=103,550,417實(shí)驗(yàn)步驟（1）在250ulPCR管內(nèi)配置25ul反應(yīng)體系：

CK(ul)1#(ul)模板02引物10.50.5引物20.50.510×PCRBuffer2.52.5Taq酶0.30.3dNTPs2.02.0ddH2O19.217.2Total2525（2）PCR反應(yīng)程序(1)95℃變性5min，(2)94℃變性30S，(3)52℃退火30s，(4)72℃延伸1min。

(5)72℃延伸10min。重復(fù)(2)-(4)30次PCR結(jié)果：1、對(duì)照(無模板)；2－6、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）PCR產(chǎn)物的電泳鑒定PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，1～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA（1）模板單、雙鏈DNA均可，多種來源。質(zhì)量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般人基因組100ngDNA模板（100L）。模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。PCR反應(yīng)的影響因素

1)反應(yīng)體系Lambda

DNA，模板量分別為100

pg,

10pg,

1pg,

100fg

,

10fg

（2）引物引物是與待擴(kuò)增DNA片斷兩翼互補(bǔ)的一段特異的寡核苷酸片斷。引物是PCR反應(yīng)中最關(guān)鍵的因素，因此引物序列的設(shè)計(jì)對(duì)于PCR是否成功是非常重要的。

引物設(shè)計(jì)的原則：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。序列的查找可在相關(guān)的網(wǎng)址，如/pubmed查找各種目的序列。同源性比較可以在www.ncbi.nih/blast.cgi進(jìn)行在線比較或通過OMIGA等軟件進(jìn)行兩兩或多序列的比較。引物序列同源性比對(duì)（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布，G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列（二聚體）。（6）3’端一定要與模板嚴(yán)格配對(duì)，5’端可引入突變，加酶切位點(diǎn)等。引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)常用軟件主要有：PrimerPremier5.0

Oligo6primer3ThePrimerGeneratorNetPrimer

1.將序列輸入軟件中（2）在表中粘貼序列（1）新序列兩個(gè)方法在對(duì)話框中輸入待擴(kuò)增序列點(diǎn)擊左上角的“Primer”按鈕2.設(shè)置相關(guān)參數(shù)3.得到的引物結(jié)果Hairpin:引物自身是否會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer:同一種引物是否會(huì)形成二聚體Falseprimiring:引物在待擴(kuò)增序列中其他位置是否有配對(duì)CrossDimer:正向與反向引物間是否會(huì)形成二聚體正向和反向引物的互換正向和反向引物的評(píng)價(jià)正向和反向引物的信息每點(diǎn)擊左邊紅色的按鈕，就出現(xiàn)相應(yīng)的內(nèi)容對(duì)正向和反向引物進(jìn)行編輯可對(duì)引物進(jìn)行增加或減少堿基用鍵盤輸入5個(gè)堿基引物的信息改動(dòng)后引物的信息重新回到雙引物的界面“Edit”－“Copy”－“SensePrimer”5'CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA3'4.輸出引物序列引物純度：公司合成引物常用的純化方式C18脫鹽、OPC純化、PAGE純化、HPLC純化。普通PCR：OPC純（>95%）較長引物（大于50個(gè)堿基）：PAGE純（>95%）經(jīng)過修飾或標(biāo)記的引物：HPLC純（>99%,但價(jià)格昂貴）引物濃度：0.1-0.5mol/L，濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配，反應(yīng)特異性下降。（3）耐熱DNA聚合酶1）TaqDNA聚合酶（Taqpolymerase）：95℃的半壽期為40min最適溫度（72℃）時(shí)每個(gè)酶分子每秒可催化合成150個(gè)核苷酸酶活性（受多種因素影響）：5’→3’方向的聚合酶活性，5’→3’方向的外切酶活性和逆轉(zhuǎn)錄酶活性，非模板依賴性活性，可在雙鏈PCR產(chǎn)物每一條鏈的3‘端加上單核苷酸尾，使PCR產(chǎn)物的3’端突出一個(gè)單A核苷酸尾PfuDNA聚合酶：具有3’→5’外切酶活性的校對(duì)功能，催化DNA合成的忠實(shí)性比Taq聚合酶高12倍，但不適于>2kb的片斷擴(kuò)增。VentDNA聚合酶：又稱TliDNA聚合酶，該酶耐高溫且具有3‘-5’外切酶活性的校對(duì)功能，其保真性較TaqDNA聚合酶高一倍。該酶擴(kuò)增長片斷（>12kb）的功能較強(qiáng)。2）其他的耐熱聚合酶（4）dNTPdNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。

0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。

Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。

Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2）循環(huán)參數(shù)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈

94oC20-30秒(2)退火溫度由引物長度和GC含量決定。

增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合，降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。（3）延伸70-75oC，延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低，錯(cuò)誤摻入率增加思考題：

1.一次特異性很好的PCR后，所得產(chǎn)物的長度都是一樣的嗎？2.影響PCR反應(yīng)成敗的因素有那些？重組DNA技術(shù)

重組DNA技術(shù)的概念重組DNA技術(shù)的基本條件工具酶目的基因運(yùn)載體用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞重組DNA技術(shù)的基本過程舉例說明主要內(nèi)容：是在體外將不同來源的特異基因或DNA片段插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)建重組DNA分子，然后將重組DNA導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖（稱之為“克隆”），篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆，因此DNA重組技術(shù)又稱為DNA克隆。DNA克隆一、重組DNA技術(shù)概念二、重組DNA技術(shù)的基本條件（一）工具酶（二）目的基因（三）運(yùn)載體（四）用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞（一）重要的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基1.限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是識(shí)別DNA的特異序列并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)

大部分Ⅱ型限制酶能夠識(shí)別由4個(gè)～8個(gè)核苷酸組成的特定序列。Ⅱ型酶識(shí)別具有回文結(jié)構(gòu)的核苷酸序列（如圖）。“回文”意為順讀和倒讀都一樣的。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口2.DNA連接酶(基因工程的“縫紉針”)

（1）T4噬菌體DNA連接酶：兩個(gè)不同片段雙鏈DNA存在互補(bǔ)粘性末端（Km=0.6μmol/L)或平末端(Km=50μmol/L)。DNA連接反應(yīng)都是由T4DNA連接酶介導(dǎo)。（2）大腸桿菌DNA連接酶:不能催化平末端DNA分子的連接。3.DNA聚合酶（1）TaqDNA聚合酶:耐熱（75-80℃），分子量65kD,也具5’和3’外切酶活性。（2）反轉(zhuǎn)錄酶(RDDP):多功能酶，無3’和5’DNA外切酶活性，具有3’和5’RNA外切酶活性。進(jìn)行DNA重組的目的主要有兩方面：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）這些使我們感興趣的基因或DNA序列就是目的基因。（二）目的基因（二）目的基因1.表達(dá)載體:為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。2.克隆載體:為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。（三）運(yùn)載體（三）運(yùn)載體運(yùn)載體應(yīng)具備的條件：具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制點(diǎn)或整合位點(diǎn)具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有合適的篩選標(biāo)記（四）用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞常用受體類型：

大腸桿菌：背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單等，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌。

酵母菌：具有真核生物特性，背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，遺傳穩(wěn)定，可用于基因的克隆，表達(dá)，基因文庫的構(gòu)建等，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的重要的真核性受體菌。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO）：與人的親緣關(guān)系近，分子表達(dá)系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)；細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長緩慢；適用于哺乳類動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要的哺乳動(dòng)物受體。三、重組DNA技術(shù)的基本過程基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線

以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程目的基因的獲取和體外重組化學(xué)合成法：較短的基因（60-80bp）要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列?；蚪MDNA文庫cDNA文庫聚合酶鏈反應(yīng)一.目的基因的獲取:PCR技術(shù)的基本過程模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀95oC5min94℃55℃72℃PCR技術(shù)獲取目的基因:外源基因與載體的連接:體外重組方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接粘性末端連接DNA體外重組本質(zhì)上是一個(gè)酶促反應(yīng)過程，在DNA連接酶的催化作用下，將外源DNA分子與載體DNA分子連接成一個(gè)重組分子的過程。連接方式:（一）黏性末端連接（二）平末端連接（三）同聚物加尾連接（四）人工接頭連接（五）T-A克隆BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶16oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶16oC重組體平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端適用于：目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶16oC重組體載體自連目的基因自連在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。同聚物加尾連接DNA連接酶同聚物尾巴同聚物加尾法連接重組DNA分子由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭(linker)連接利用人工合成的接頭連接重組DNA分子5.T-A克隆T-A克隆策略是一種直接將PCR產(chǎn)物插入到載體中的方法。(一)、重組DNA分子的導(dǎo)入重組DNA分子的導(dǎo)入和篩選與鑒定常用的導(dǎo)入方法:

（一）轉(zhuǎn)化（二）轉(zhuǎn)染一）轉(zhuǎn)化方法1.氯化鈣法：細(xì)菌處于低溫、低滲CaCl2溶液中，菌細(xì)胞壁通透性增加，菌體膨脹成球形，經(jīng)短暫熱休克后重組DNA易進(jìn)入2.電穿孔法：除特殊儀器外比氯化鈣法更簡單，使用時(shí)注意電場強(qiáng)度、電脈沖長度、DNA濃度等參數(shù)。特殊處理受體細(xì)胞細(xì)胞膜特性改變CaCl2處理受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細(xì)菌重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌二）轉(zhuǎn)染

——將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔:操作簡單且轉(zhuǎn)染效率高，幾乎可轉(zhuǎn)染任何細(xì)胞用于瞬時(shí)表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)。但是它需要專門儀器，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:脂質(zhì)體（liposomes）是一種人造類脂膜.用脂質(zhì)體包裹DNA，瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，操作簡單，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，且毒性低、包裝容量大，昂貴。顯微注射:轉(zhuǎn)染效率高，但需要一定的儀器和操作技巧。主要用于穩(wěn)定表達(dá)(一）根據(jù)重組載體的遺傳表型進(jìn)行篩選1．根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)記篩選2．根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)記插入失活選擇3．根據(jù)β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選4．根據(jù)插入的外源基因性狀進(jìn)行篩選（二）限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定（三）核酸分子雜交法（四）PCR法（五）免疫化學(xué)檢測法(六)DNA序列檢測(二)、重組體的篩選與鑒定AmprTetrBamHⅠ位點(diǎn)BamHⅠ酶切BamHⅠ酶切DNA連接酶目的DNA重組質(zhì)粒大腸桿菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板四、舉例說明(一)引物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)完成全基因序列測定的豹源FCV的ORF2序列設(shè)計(jì)引物，選擇的酶切位點(diǎn)為EocRI/XhoI，擴(kuò)增目的片段長度為1734bp。上游引物序列：CCGGAATTCCGGATGTGCTCAACCTGCGCTAA；下游引物序列：CCGCTCGAGGTTAATGACATAGCCCAATTTTAGTGTG；引物送往生工生物工程上海股份有限公司合成。（二）目的基因片段的擴(kuò)增以本實(shí)驗(yàn)室保存的含有豹源FCVORF2的質(zhì)粒為模版，用高保真ExTaqDNA聚合酶進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：模板2μL、dNTPs2μL，PCR緩沖液2.5μL，上、下游引物各0.5μL，ExTaqDN