生物技術(shù)代謝工程

代謝工程導(dǎo)讀2023/2/31張星元：發(fā)酵原理（講座）

研究代謝工程的就是為了能精確地處理好微生物細(xì)胞自身的利益與人類對(duì)微生物細(xì)胞提出的要求之間的對(duì)立與統(tǒng)一的關(guān)系。2023/2/32張星元：發(fā)酵原理（講座）代謝工程的導(dǎo)讀1.代謝工程的醞釀2.代謝流及其控制的的概念3.代謝工程的兩個(gè)組成部分4.代謝工程的含義5.代謝工程的應(yīng)用2023/2/33張星元：發(fā)酵原理（講座）1.1半個(gè)多世紀(jì)生理與育種知識(shí)的累積1.2基因工程理論和技術(shù)的成熟1.3代謝流定量分析技術(shù)的發(fā)展1.4生化工程在線檢測(cè)和建模方法的發(fā)展1.代謝工程的醞釀2023/2/34張星元：發(fā)酵原理（講座）用代謝途徑操作的手段來改造微生物以獲得期望的性質(zhì)，這確實(shí)并不是新的觀念。在氨基酸、抗生素、溶劑和維生素的發(fā)酵法生產(chǎn)中，都可以找到采用這個(gè)路子實(shí)現(xiàn)人類理想的一些突出的例子。這些方法主要依賴于用化學(xué)誘變劑處理微生物，并用進(jìn)行設(shè)計(jì)的篩選技術(shù)來檢出已獲得優(yōu)良性狀的突變株。盡管這種方法已被廣泛地接受并已取得好的效果，但人們對(duì)突變株的遺傳和代謝性狀的精確變化，知之甚少。1.1半個(gè)多世紀(jì)生理與育種知識(shí)的累積2023/2/35張星元：發(fā)酵原理（講座）

盡管在所有的菌種改良方案中都有某種定向的含義，但傳統(tǒng)的誘變是隨機(jī)的。“定向”與隨機(jī)誘變沒有直接關(guān)系。

事實(shí)上，我們?cè)缇透鶕?jù)隨機(jī)誘變后從突變株中篩得的高產(chǎn)突變株遺傳標(biāo)記，及這些突變株的優(yōu)良性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，來推測(cè)途徑及其控制的機(jī)制。

2023/2/36張星元：發(fā)酵原理（講座）

有人把這樣的做法叫做“逆行的代謝工程”（reversemetabolicengineering）,“逆行的代謝工程”

為代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和完善，以及代謝工程的進(jìn)展提供了大量的生理學(xué)和遺傳學(xué)信息。2023/2/37張星元：發(fā)酵原理（講座）二十多年來，基因工程的理論和DNA重組的分子生物學(xué)技術(shù)已成熟。DNA重組的分子生物學(xué)技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，把代謝操作引進(jìn)了一個(gè)新的層面，人們已能對(duì)代謝途徑的指定酶反應(yīng)進(jìn)行精確的修飾，因此，有可能構(gòu)建精心設(shè)計(jì)的遺傳背景。1.2基因工程理論和技術(shù)的成熟2023/2/38張星元：發(fā)酵原理（講座）1.3代謝流定量分析技術(shù)的發(fā)展

代謝流量分析（metabolicfluxanalysis）是一種研究胞內(nèi)代謝的方法，根據(jù)已有的代謝網(wǎng)絡(luò)的信息建立胞內(nèi)主要反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量模型和胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的質(zhì)量平衡，以實(shí)際測(cè)得的分泌到胞外的代謝中間產(chǎn)物的濃度，來推算代謝代謝流量。2023/2/39張星元：發(fā)酵原理（講座）這種分析方法的基礎(chǔ)是擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)，即假設(shè)在產(chǎn)物形成速率最大的階段各種代謝中間物的胞內(nèi)濃度變化速率為零。根據(jù)質(zhì)量平衡，由n個(gè)中間代謝物即可得到n個(gè)關(guān)于速率的方程，通過測(cè)定胞外代謝產(chǎn)物的濃度，計(jì)算未知途徑的流量。2023/2/310張星元：發(fā)酵原理（講座）1.4生化工程在線檢測(cè)和建模方法的發(fā)展

色譜、質(zhì)譜、紅外等等在線檢測(cè)手段，以及生物傳感技術(shù)的發(fā)展，可為發(fā)酵在線檢測(cè)和反饋提供可靠的原始數(shù)據(jù)。建模方法也有發(fā)展。2023/2/311張星元：發(fā)酵原理（講座）

代謝流的概念本身實(shí)際上并不是新的概念。代謝流及其控制引起生化研究人員中的少數(shù)先知的注意，大約已有30多年歷史了。作為他們工作的結(jié)果，代謝控制的觀念成熟了，并且被嚴(yán)格的定義了，盡管這些觀念并不是始終被傳統(tǒng)的生物學(xué)家廣泛地接受。2代謝流及其控制的的概念2023/2/312張星元：發(fā)酵原理（講座）

代謝工程最初僅僅被設(shè)想為特定的途徑操作（在生物化學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)的領(lǐng)域）。后來，發(fā)酵工程師們驚喜地發(fā)現(xiàn)利用代謝流控制分析這個(gè)有效的平臺(tái)，可以向工業(yè)發(fā)酵過程導(dǎo)入嚴(yán)密性；并把它變成了發(fā)酵工程的領(lǐng)域工程數(shù)據(jù)分析的輸出端。2023/2/313張星元：發(fā)酵原理（講座）

盡管代謝和細(xì)胞生理學(xué)可為反應(yīng)途徑的分析提供主要的背景知識(shí)；還應(yīng)該指出，代謝流量測(cè)定和控制的結(jié)果具有廣闊的適用范圍和實(shí)際應(yīng)用前景。因而，除了要分析代謝途徑上的物質(zhì)流和能量流，代謝工程的概念同樣可以應(yīng)用于將來信號(hào)傳感途徑的信息流的分析（目前對(duì)于信息流尚未很好地定義）。2023/2/314張星元：發(fā)酵原理（講座）

3代謝工程的兩個(gè)組成部分3.1

“分析”部分3.2“綜合”部分2023/2/315張星元：發(fā)酵原理（講座）因?yàn)榇x工程借助于DNA重組技術(shù)而作為一種啟用技術(shù)而出現(xiàn)，所以一開始人們就把注意力放在這個(gè)領(lǐng)域的綜合方面：新的基因在不同寄主中的表達(dá)，內(nèi)酶的擴(kuò)增，基因的刪除，酶活力修飾，轉(zhuǎn)錄的解調(diào)或酶的解調(diào)等。2023/2/316張星元：發(fā)酵原理（講座）

這樣所謂的代謝工程，在相當(dāng)程度上僅僅是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)表現(xiàn)形式，幾乎沒有工程的內(nèi)容，因此從生物過程的角度來衡量，并不是夠格的代謝工程。

2023/2/317張星元：發(fā)酵原理（講座）

與所有傳統(tǒng)的工程領(lǐng)域一樣，代謝工程也包含“分析”和“綜合”兩個(gè)規(guī)定的步驟。

2023/2/318張星元：發(fā)酵原理（講座）

重要的工程內(nèi)容存在于代謝工程的分析方面，例如：3.1

“分析”部分2023/2/319張星元：發(fā)酵原理（講座）①怎樣推算特定代謝流量等生理狀態(tài)參數(shù)？②怎樣用這些信息解釋代謝網(wǎng)絡(luò)的控制結(jié)構(gòu)（體系），進(jìn)而提出達(dá)到某個(gè)目標(biāo)的合乎道理的修飾位點(diǎn)？

③怎樣進(jìn)一步估計(jì)測(cè)定這些遺傳修飾和酶的修飾的真實(shí)的生化效果，以便進(jìn)行下一輪的途徑修飾，直到達(dá)到目的？

④能不能提出一個(gè)合理的方法以確定代謝修飾的最有希望的靶位？

⑤？……2023/2/320張星元：發(fā)酵原理（講座）

綜合部分包括以分子生物學(xué)方法進(jìn)行的綜合實(shí)驗(yàn)：設(shè)計(jì)育種方案的制定，新的基因的導(dǎo)入和在寄主細(xì)胞中的表達(dá)，內(nèi)酶的擴(kuò)增，基因的刪除，酶活力修飾，轉(zhuǎn)錄的解調(diào)或酶的解調(diào)等。3.2“綜合”部分2023/2/321張星元：發(fā)酵原理（講座）

在綜合方面，代謝工程的另一個(gè)不同尋常的特征是代謝途徑的“集成”，而往往不是單個(gè)反應(yīng)的導(dǎo)入。這樣，代謝工程研究的是整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)，涉及到途徑分析和熱動(dòng)力學(xué)可能性，途徑流量及其控制。2023/2/322張星元：發(fā)酵原理（講座）

我們研究的出發(fā)點(diǎn)正在經(jīng)歷從單個(gè)酶反應(yīng)向相互影響的生化反應(yīng)體系轉(zhuǎn)變。2023/2/323張星元：發(fā)酵原理（講座）通過對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系而不是一個(gè)個(gè)孤立的反應(yīng)的考察就有可能獲得關(guān)于代謝和細(xì)胞功能的更全面的認(rèn)識(shí)，在這個(gè)的意義上“代謝網(wǎng)絡(luò)”的觀念是最為重要的。2023/2/324張星元：發(fā)酵原理（講座）

因此，代謝工程使用來自還原論者的大量的信息和研究技術(shù)，來進(jìn)行設(shè)計(jì)和綜合。而關(guān)于整個(gè)體系的運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài)的觀察（工程數(shù)據(jù)采集），對(duì)于進(jìn)一步的合理的分析來說，又是最好的指導(dǎo)。2023/2/325張星元：發(fā)酵原理（講座）

代謝工程讓人們把注意力轉(zhuǎn)向代謝網(wǎng)絡(luò)的整個(gè)體系而不是其組成部分。這個(gè)轉(zhuǎn)向說明基因工程已在總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)中走向成熟。2023/2/326張星元：發(fā)酵原理（講座）

代謝工程把發(fā)酵工程的兩個(gè)關(guān)鍵的組成部分菌種和發(fā)酵工藝控制凝聚在一起，這正是發(fā)酵原理的基本立場(chǎng)。在發(fā)酵工業(yè)的歷史上菌種和發(fā)酵工藝控制的分開，促進(jìn)了發(fā)酵生產(chǎn)的工業(yè)化，也束縛了高精度發(fā)酵工程的發(fā)展。代謝工程使發(fā)酵工程返樸歸真，代謝工程是強(qiáng)化了生物學(xué)屬性的廣義的發(fā)酵工程。2023/2/327張星元：發(fā)酵原理（講座）

發(fā)酵原理（工業(yè)發(fā)酵的生物學(xué)原理）是代謝控制發(fā)酵通向代謝工程的橋梁，是分子生物學(xué)技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)上取得豐碩成果的向?qū)В彩俏覈?guó)生物工程、發(fā)酵工程界后生超越前輩、領(lǐng)先世界的“內(nèi)功”。2023/2/328張星元：發(fā)酵原理（講座）

4代謝工程的含義

DNA重組技術(shù)剛進(jìn)入可行階段不久，就出現(xiàn)了不少可用來說明這種技術(shù)在定向的途徑修飾方面的潛在應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)。如分子育種（1981年），體外進(jìn)化（1988年），微生物工程或代謝途徑工程（1988~1991年），細(xì)胞工程（1991年）和代謝工程（1991年），盡管不同的作者提出不完全相同的定義，這些定義均傳達(dá)了與代謝工程的總目標(biāo)和手段相似或遞進(jìn)的含義。

2023/2/329張星元：發(fā)酵原理（講座）

幾十年來我們一直是用物理或化學(xué)誘變來改變微生物的遺傳特性。通過傳統(tǒng)的誘變和篩選，成功開發(fā)了大量的生產(chǎn)抗生素和氨基酸的菌種。在已知代謝途徑的基礎(chǔ)上，采用了一些精心設(shè)計(jì)的篩選方法，但是整體上這個(gè)方法還僅僅是一種“試差法”。2023/2/330張星元：發(fā)酵原理（講座）

DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)使人類的許多美好理想有可能成為現(xiàn)實(shí)。用目標(biāo)明確的遺傳修飾替代傳統(tǒng)的暗箱操作去改變代謝途徑，已取得可喜的成績(jī)。發(fā)酵工程和微生物代謝流的分析提供的信息，又可以校正遺傳修飾的精度，從而更進(jìn)一步逼近預(yù)定目標(biāo)。2023/2/331張星元：發(fā)酵原理（講座）

代謝工程最初被定義為：

用DNA重組技術(shù)修飾特定的生化反應(yīng)或引進(jìn)新的生化反應(yīng)，直接改善產(chǎn)物的形成和細(xì)胞的性能的學(xué)科。

2023/2/332張星元：發(fā)酵原理（講座）這樣定義的代謝工程的基本特征是工作目標(biāo)的確切性。也就是說，先要找到要進(jìn)行修飾或要引進(jìn)的目標(biāo)生化反應(yīng)，一旦找準(zhǔn)了目標(biāo)，就用已建立的分子生物學(xué)技術(shù)去擴(kuò)增、去抑制或刪除、去傳遞相應(yīng)的基因或酶，或者解除對(duì)相應(yīng)的基因或酶調(diào)節(jié)，而廣義的DNA重組只是常規(guī)地應(yīng)用于不同步驟中，以便于達(dá)到這些目標(biāo)。2023/2/333張星元：發(fā)酵原理（講座）

也有人這樣給代謝工程下定義：

通過使用DNA重組和分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)代謝途徑進(jìn)行修飾和（或）引進(jìn)缺失，從而改變細(xì)胞的新陳代謝作用和（或）細(xì)胞特性的生物工程的分支。這樣的定義盡管強(qiáng)調(diào)了代謝工程目標(biāo)的確切性，但仍不能包容代謝工程的工程分析方面的內(nèi)容，仍不能做到“分析”和“綜合”的有機(jī)結(jié)合。

2023/2/334張星元：發(fā)酵原理（講座）

應(yīng)該根據(jù)代謝工程的生物學(xué)和工程學(xué)實(shí)質(zhì)來規(guī)范代謝工程的內(nèi)涵，給代謝工程下定義。2023/2/335張星元：發(fā)酵原理（講座）代謝工程的定義：

把量化代謝流及其控制的工程分析方法與根據(jù)分析結(jié)果制定的遺傳修飾方案付之實(shí)施的分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，以反復(fù)分析、校驗(yàn)和修正的方式進(jìn)行實(shí)際操作，改善微生物的產(chǎn)物形成的能力和微生物的細(xì)胞性能，從而滿足人類對(duì)生物的特定需求的生物工程的分支。2023/2/336