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PCR技術

DNA體外快速擴增技術2021/8/231最新PPT一、基礎知識（一）DNA分子的結構C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、基本單位3、脫氧核苷酸結構2021/8/232最新PPT脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）2021/8/233最新PPT一個核苷酸上的磷酸基團上的“－OH”和另一個核苷酸分子的第三位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二脂鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3’和5’碳原子之間形成磷酸二脂鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通過3’、5’、磷酸二脂鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團的末端稱為5’端4、多脫氧核苷酸鏈得形成2021/8/234最新PPT脫氧核苷酸結構式2021/8/235最新PPTOOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’堿基脫氧核糖磷酸基團堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’多脫氧核苷酸鏈結構簡圖2021/8/236最新PPT5、DNA分子的雙螺旋結構①DNA分子是由兩條反向平行的（即一條鏈為3’－5’，另一條鏈為5’－3’）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則雙螺旋結構②脫氧核糖與磷酸交替連結，排列在側，構成基本骨架；堿基排列在鏈的內側③兩條鏈上的堿基通過氫鍵連結起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤一定同胞嘧啶配對2021/8/237最新PPT2021/8/238最新PPT6、利用堿基互補配對規(guī)律的計算規(guī)律一：DNA雙鏈中的兩條互補鏈的堿基相等,任意兩個互補的堿基之和相等即A=T，G=C。任意兩個不互補的堿基之和恒等，占堿基總數(shù)的50%。即：A+G＝T+C＝A+C＝T+G＝50%，（A+G）/(T+C)＝(A+C)/(G+T)＝(T+C)/(A+G)＝1規(guī)律二：在DNA雙鏈中的一條單鏈(A+G)/(T+C)的值與另一條互補鏈的(A+G)/(T+C)的值互為倒數(shù)關系2021/8/239最新PPT規(guī)律三：DNA雙鏈中，一條單鏈的(A+T)/(G+C)的值與另一條互補鏈的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也與整個DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等（二）DNA分子的特性1、穩(wěn)定性在DNA分子雙螺旋結構的內側，通過氫鍵形成的堿基對，使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固的并聯(lián)起來2021/8/2310最新PPT例題：甲DNA分子中，A和T占25％，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25％，A和T占75%，哪一個穩(wěn)定？答：甲DNA分子比乙DNA分子穩(wěn)定。因為A與T之間形成兩個氫鍵，在G和C之間形成三個氫鍵，三個氫鍵比兩個氫鍵穩(wěn)定，所以在DNA分子中含有較多的G－C堿基對比含有較多的A－T堿基穩(wěn)定2021/8/2311最新PPT2、多樣性構成DNA分子的堿基對的數(shù)量不同，堿基對的排列順序千變萬化例題：如果有4000個堿基對，堿基對有多少種排列方式？答：堿基對排列方式有44000種3、特異性不同的DNA分子由于堿基對的排列順序存在差異，因此每一個DNA分子的堿基對都有其特定的排列順序，這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息，每一種生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的2021/8/2312最新PPT（三）DNA的復制2、時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場所細胞核（主）、線粒體、葉綠體4、模板DNA母鏈1、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程2021/8/2313最新PPT5、原材料脫氧核苷酸6、基本條件酶、ATP、原料、模板7、復制過程①DNA的解旋親代DNA分子利用細胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈2021/8/2314最新PPT②RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時的DNA片斷稱為岡崎片斷2021/8/2315最新PPT⑤DNA片斷的連接在DNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的DNA鏈。新鏈與舊鏈構成新的DNA2021/8/2316最新PPT邊解旋邊復制(過程）8、復制特點半保留復制（結果）9、遵循原則堿基互補配對原則2021/8/2317最新PPT10、精確復制的原因11、復制的意義DNA分子通過復制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性①規(guī)則的雙螺旋結構為復制提供了精確的模板②堿基互補配對能力保證了復制準確無誤的進行2021/8/2318最新PPT①一條雙鏈DNA分子，復制N次，形成的子代DNA分子中，含親代DNA母鏈的有兩個DNA分子，占子代DNA總數(shù)的2/2N；親代DNA分子母鏈兩條，占子代DNA中脫氧核苷酸鏈總數(shù)的

2/2N+1=1/2N②設一條DNA分子中有胸腺嘧啶為m個，則該DNA復制n次后，形成子代DNA分子需游離的胸腺嘧啶為T=(2N-1)m12、DNA復制過程中的等量關系2021/8/2319最新PPT（四）PCR(多聚酶鏈式反應）1、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物2、DNA聚合酶作用過程當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸2021/8/2320最新PPT2021/8/2321最新PPT3、PCR原理①在80－100°C的溫度范圍內，DNA的雙螺旋結構將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性②當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結合成雙鏈③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質上也是一臺能夠自動調控溫度的儀器2021/8/2322最新PPT2021/8/2323最新PPT高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術的自動化4、TaqDNA聚合酶的應用5、緩沖液需要為PCR反應提供的物質DNA模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行2021/8/2324最新PPTPCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出6、PCR技術的特點7、細胞內和細胞外DNA復制環(huán)境的區(qū)別體內DNA的復制體外的模擬模板（母鏈）細胞內源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP細胞內源外源加入聚合酶細胞內源外源加入反應環(huán)境細胞內環(huán)境緩沖液2021/8/2325最新PPT①PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為20－30個脫氧核苷酸8、細胞內復制和PCR不同點②PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的2021/8/2326最新PPT（五）PCR的反應過程1、PCR的反應步驟PCR一般經歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復性和延伸①變性（模板DNA解旋）模板DNA經加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結合，為下輪反應作準備2、循環(huán)過程2021/8/2327最新PPT靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性2021/8/2328最新PPT②復性（退火）模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合2021/8/2329最新PPT靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火2021/8/2330最新PPT③延伸DNA模板－引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復制的原理，合成一條新的DNA鏈2021/8/2331最新PPT靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸2021/8/2332最新PPT靶序列

靶序列第1個PCR循環(huán)完成后：得到兩個拷貝的靶序列2021/8/2333最新PPT循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量2021/8/2334最新PPT4、PCR循環(huán)的結果②DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產物也作為模板參與反應，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結合，進行DNA的延伸2021/8/2335最新PPT二、PCR的實驗操作1、PCR儀（一）設備及用具實質上一臺能夠自動調控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總容積為0.5mL3、微量移液器用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次2021/8/2336最新PPTPCR儀2021/8/2337最新PPT微量離心管微量移液器2021/8/2338最新PPT1、準備2、移液（二）實驗操作步驟按照PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑2021/8/2339最新PPT①過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁②注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢2021/8/2340最新PPT將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序①過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s4、離心5、反應②離心目的：使反應液體集中在離心管底部，提高反應效果2021/8/2341最新PPT循環(huán)數(shù)變性復性延伸

第一次94℃,10min

－

－30次９4℃，30s55℃，30s72℃,1min最后一次９4℃,1min55℃，30s72℃,1min2021/8/2342最新PPTPCR技術高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6、注意事項①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；②分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭2021/8/2343最新PPT（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算三、課題成果評價1、一條DNA，復制n次，DNA為2n2、a條DNA，復制n次，DNA為a×2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關2021/8/2344最新PPT2、過程①稀釋2uLPCR反應液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋②對照調零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調節(jié)至零取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定2021/8/2345最新PPT④計算公式DNA含量(g/mL)＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)說明（50的含義）：1g/mL的DNA在厚度為1cm比色杯中在260nm處的吸光值為0.02）2021/8/2346最新PPT比色杯2021/8/2347最新PPT四、課題延伸例如：PCR產物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR技術是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出特點2021/8/2348最新PPT五、實驗小結PCR儀加熱使（）變性,復性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復制的起點,合成新鏈。如此重復改變反應溫度,經（）三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產物進行電泳,經溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復性和延伸72℃2021/8/2349最新PPT9、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。03-2月-2303-2月-23Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。***2/3/20234:38:34PM11、人總是珍惜為得到。03-2月-23**Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。***Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。03-2月-2303-2月-23**03February202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月2023**03-2月-2315、一個人炫耀什么，說明他內心缺少什么。。二月23*03-2月-23*03February202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。**2/3/202317、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。***03-2月-23謝謝大家2021/8/2350最新PPT9、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。03-2月-2303-2月-23Friday,February3,202310、低頭