醫(yī)療器械產(chǎn)品無菌和微生物限度檢查法

醫(yī)療器械產(chǎn)品無菌和微生物限度檢查法主要內(nèi)容微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則無菌檢查法微生物限度檢查法一二三一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則

（1）人員

（2）培養(yǎng)基（8）檢驗(yàn)方法

（3）試劑（9）污染廢棄物的處理

（4）菌種（10）檢測結(jié)果的質(zhì)量保證和檢測的質(zhì)量控制

（5）環(huán)境（11）實(shí)驗(yàn)記錄

（6）設(shè)備（12）結(jié)果的判斷和檢測報(bào)告

（7）樣品（13）文件用途：用于指導(dǎo)藥品微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制實(shí)施要素（13個(gè)）一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則1.人員（1）檢驗(yàn)人員要求具備微生物學(xué)或相近專業(yè)知識(shí)的教育背景必須熟悉相關(guān)檢測方法、程序、檢測目的和結(jié)果評(píng)價(jià)崗前培訓(xùn)持續(xù)培訓(xùn) 制定繼續(xù)教育計(jì)劃，保證知識(shí)與技能不斷的更新（2）管理人員要求專業(yè)技能和經(jīng)驗(yàn)水平應(yīng)與他們的職責(zé)范圍相符如：管理技能、實(shí)驗(yàn)室安全、試驗(yàn)安排、預(yù)算、實(shí)驗(yàn)研究、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)估和數(shù)據(jù)偏差的調(diào)查、技術(shù)報(bào)告書寫等一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備結(jié)塊顏色變化物理性狀明顯改變選擇質(zhì)量符合要求適當(dāng)條件下貯藏低溫干燥避光密封容器（尤其是盛放脫水培養(yǎng)基的容器）一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基制備過濾（如需要）分裝校正（25℃）±0.2溶化玻璃器皿純化水稱量加塞包扎脫水培養(yǎng)基記錄應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的精確度自制培養(yǎng)基按配方準(zhǔn)確配制按使用說明上的要求操作一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則培養(yǎng)基培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基應(yīng)采用經(jīng)驗(yàn)證的滅菌程序滅菌商品化的成品培養(yǎng)基必須附有所用滅菌方法的資料培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌技術(shù)，特殊培養(yǎng)基可采用薄膜過濾除菌應(yīng)確定每批培養(yǎng)基滅菌后的pH值一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則培養(yǎng)基培養(yǎng)基的貯藏自配的培養(yǎng)基應(yīng)標(biāo)記名稱、批號(hào)、配制日期、制備人等信息，并在已驗(yàn)證的條件下貯藏商品化的成品培養(yǎng)基標(biāo)簽上應(yīng)標(biāo)有名稱、批號(hào)、生產(chǎn)日期、失效期及培養(yǎng)基的有關(guān)特性，生產(chǎn)商和使用者應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基使用說明書上的要求進(jìn)行貯藏培養(yǎng)基滅菌后不得貯藏在髙壓滅菌器中，瓊脂培養(yǎng)基不得在0℃或

0℃以下存放瓊脂平板最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如置冰箱保存，一般不超過1周，且密閉包裝一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則2.培養(yǎng)基培養(yǎng)基的質(zhì)量控制試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定試驗(yàn)用培養(yǎng)基的質(zhì)量控制程序，確保所用培養(yǎng)基質(zhì)量符合相關(guān)檢査的需要實(shí)驗(yàn)室配制或商品化的成品培養(yǎng)基的質(zhì)量依賴于其制備過程，采用不適宜方法制備的培養(yǎng)基將影響微生物的生長或復(fù)蘇，從而影響試驗(yàn)結(jié)果的可靠性所有配制好的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室配制的培養(yǎng)基的常規(guī)監(jiān)控項(xiàng)目是pH值、適用性檢査試驗(yàn)，定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期除藥典附錄另有規(guī)定外，在實(shí)驗(yàn)室中，若采用已驗(yàn)證的配制和滅菌程序制備培養(yǎng)基且過程受控，那么同一批脫水培養(yǎng)基的適用性檢査試驗(yàn)可只進(jìn)行1次一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則3.試劑試劑試劑接收檢查貯藏關(guān)鍵試劑適應(yīng)性文件化管理控制保存記錄相關(guān)資料標(biāo)簽標(biāo)明名稱制備依據(jù)適用性濃度貯藏條件制備日期有效期制備人等確保所用試劑質(zhì)量符合相關(guān)要求一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則菌種概念和要求微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株：應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株：從國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過復(fù)活并在適宜的培養(yǎng)基中生長后，即為標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則菌種概念和要求工作菌株標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株用于制備每月或每周1次轉(zhuǎn)種的菌株工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過5代（從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代，任何形式的轉(zhuǎn)種均被認(rèn)為是傳代1次）必要時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)工作菌株的特性和純度進(jìn)行確認(rèn)。常用菌種保藏方法：瓊脂斜面低溫保藏法、甘油冷凍管低溫保藏法、液氮超低溫保藏法。一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則菌種文件化規(guī)定（管理）與記錄建立和保存所有菌種的進(jìn)出、收集、貯藏、確認(rèn)試驗(yàn)以及銷毀的記錄應(yīng)有菌種管理的程序文件標(biāo)準(zhǔn)菌種的申購記錄從標(biāo)準(zhǔn)菌株到工作菌株操作及記錄定期轉(zhuǎn)種傳代，菌種純度、特性等實(shí)驗(yàn)室所需關(guān)鍵指標(biāo)確認(rèn)的記錄每支菌種都應(yīng)注明其名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期、傳代數(shù)菌種生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件菌種保藏的位置和條件其他需要的程序一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則環(huán)境實(shí)驗(yàn)室的布局和運(yùn)行實(shí)驗(yàn)室布局設(shè)計(jì)基本原則防止微生物的污染防止對(duì)人員和環(huán)境造成危害合理區(qū)分，避免混亂和污染，便利操作生物安全設(shè)計(jì)和建筑材料要求適用性：利于清潔、消毒、滅菌、減少污染的風(fēng)險(xiǎn)潔凈區(qū)應(yīng)配獨(dú)立空氣機(jī)組或空氣凈化系統(tǒng)一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則潔凈室隔離系統(tǒng)生物安全控制區(qū)域?qū)嶒?yàn)輔助室5.環(huán)境實(shí)驗(yàn)室區(qū)

域無菌檢查室隔離系統(tǒng)或B+A單向流潔凈區(qū)域微限檢查室不低于D級(jí)環(huán)境下生物安全柜或B級(jí)單向流潔凈區(qū)域陽性間洗滌室實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室培養(yǎng)基配制室實(shí)驗(yàn)材料貯備室樣品接收室培養(yǎng)室試驗(yàn)結(jié)果觀察區(qū)域菌種保藏室滅菌室污染物處理室一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則環(huán)境各潔凈級(jí)別懸浮粒子和環(huán)境微生物標(biāo)準(zhǔn)一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則5.環(huán)境潔凈實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測頻次及監(jiān)測項(xiàng)目一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則環(huán)境文件化規(guī)定和記錄建立進(jìn)出潔凈區(qū)域的人和物的控制程序和SOP并記錄建立潔凈度驗(yàn)證及監(jiān)測、消毒、清潔維護(hù)的程序和記錄微生物實(shí)驗(yàn)室使用權(quán)限應(yīng)限于經(jīng)授權(quán)的工作人員一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則設(shè)備一般要求（1）微生物實(shí)驗(yàn)室設(shè)備配備與檢驗(yàn)?zāi)芰凸ぷ髁肯噙m應(yīng)

類型、測量范圍和準(zhǔn)確度等級(jí)應(yīng)滿足檢驗(yàn)所采用標(biāo)準(zhǔn)的要求（2）設(shè)備的安裝和布局便于操作易于維護(hù)易于清潔和校準(zhǔn)保持清潔保持良好工作狀態(tài)（3）唯一標(biāo)識(shí)用于試驗(yàn)的每臺(tái)儀器、設(shè)備應(yīng)該有唯一標(biāo)識(shí)（4）儀器設(shè)備應(yīng)有合格證書完成相應(yīng)的檢定、校準(zhǔn)、驗(yàn)證、確認(rèn)其性能，并形成相應(yīng)的操作、維護(hù)和保養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程后方可正式使用（5）儀器設(shè)備使用和日常監(jiān)控要有記錄一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則樣品樣品采集隨機(jī)抽樣無菌抽樣抽樣消毒培訓(xùn)人員 受控條件 防止污染無菌條件 無菌操作 環(huán)境監(jiān)測不危害樣品中微生物

抽樣環(huán)境

應(yīng)監(jiān)測并記錄，同時(shí)還需記錄采樣時(shí)間

所抽樣品 清晰標(biāo)識(shí)，避免樣品混淆和誤用一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則7.樣品樣品儲(chǔ)存和運(yùn)輸待檢樣品應(yīng)在合適的條件下貯藏并保證其完整性，盡量減少污染的微生物發(fā)生變化樣品在運(yùn)輸過程中，應(yīng)保持原有（規(guī)定）的儲(chǔ)存條件或采取必要的措施（如冷藏或冷凍）應(yīng)明確規(guī)定和記錄樣品的貯藏和運(yùn)輸條件一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則7.樣品樣品的確認(rèn)和處理實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有被檢樣品的傳遞、接收、儲(chǔ)存和識(shí)別管理程序收到樣品應(yīng)盡快檢查，記錄被檢樣品所有相關(guān)信息樣品存在數(shù)量不足、包裝破損、標(biāo)簽缺失、溫度不適等，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在決定是否檢測或拒絕接受樣品之前與相關(guān)人員溝通樣品的包裝和標(biāo)簽有可能被嚴(yán)重污染，因此搬運(yùn)和儲(chǔ)存樣品時(shí)應(yīng)小心以避免污染的擴(kuò)散，容器外部的消毒應(yīng)不影響樣品的完整性選擇具有代表性的樣品，根據(jù)有關(guān)的國家或國際標(biāo)準(zhǔn)，或者使用經(jīng)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)方法，盡快進(jìn)行檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照書面管理程序?qū)悠愤M(jìn)行保留和處置。如果實(shí)驗(yàn)用的是已知被污染的樣品，應(yīng)該在丟棄前進(jìn)行滅菌一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則8.檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)方法選擇應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康倪x擇適宜的方法進(jìn)行樣品檢驗(yàn)檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證藥典方法或標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法是經(jīng)過驗(yàn)證的，當(dāng)進(jìn)行樣品檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適用性確認(rèn)如果不是藥典或標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法，使用前應(yīng)進(jìn)行替代方法的驗(yàn)證，確認(rèn)其應(yīng)用效果優(yōu)于或等同于藥典方法替代方法的驗(yàn)證按藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則（通則9201）進(jìn)行一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則9.污染廢棄物處理污染廢棄物廢棄樣品過期（或失效）培養(yǎng)基有害廢棄物處理原則減少檢查環(huán)境和材料的污染符合國家環(huán)境和健康安全規(guī)定針對(duì)類似于帶菌培養(yǎng)物溢出的意外事件制定處理規(guī)程一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則檢測結(jié)果的質(zhì)量保證和檢測的質(zhì)量控制內(nèi)部質(zhì)量控制應(yīng)制定對(duì)所承擔(dān)的工作進(jìn)行連續(xù)評(píng)估的程序應(yīng)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度、培養(yǎng)基的適用性、滅菌方法、菌株純度和活性(包括性能）、試劑的質(zhì)量等進(jìn)行監(jiān)控并詳細(xì)記錄應(yīng)定期對(duì)檢測人員進(jìn)行技術(shù)考核應(yīng)對(duì)重要的檢驗(yàn)設(shè)備如自動(dòng)化檢驗(yàn)儀器等進(jìn)行比對(duì)外部質(zhì)量控制應(yīng)參加與檢測范圍相關(guān)的國家能力驗(yàn)證或?qū)嶒?yàn)室之間的比對(duì)實(shí)驗(yàn)來評(píng)估檢測水平，通過參加外部質(zhì)量評(píng)估來評(píng)定檢測結(jié)果的偏差一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則11.實(shí)驗(yàn)記錄所有關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)實(shí)驗(yàn)記錄數(shù)據(jù)完整原始記錄檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)設(shè)備記錄修改SOP實(shí)驗(yàn)日期檢品名稱實(shí)驗(yàn)人員姓名SOP編號(hào)或方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差（存在時(shí)）實(shí)驗(yàn)參數(shù)主管/復(fù)核人簽名現(xiàn)行有效應(yīng)有記錄，設(shè)備日志或表格應(yīng)設(shè)計(jì)合理，滿足試驗(yàn)記錄的追蹤性，設(shè)備溫度必須記錄，且有追溯性。應(yīng)指出如何進(jìn)行正確的試驗(yàn)操作記錄寫錯(cuò)時(shí)，劃掉并簽字，原數(shù)據(jù)不能抹去或被覆蓋一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則結(jié)果的判斷和檢測報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行充分和全面的評(píng)價(jià)所有影響結(jié)果觀察的微生物條件和因素應(yīng)完全考慮異常結(jié)果出現(xiàn)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查實(shí)驗(yàn)室環(huán)境抽樣區(qū)的防護(hù)條件樣品在該檢驗(yàn)條件下以往檢驗(yàn)的情況樣品本身具有使微生物存活或繁殖的特性等情況回顧試驗(yàn)過程，也可評(píng)價(jià)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性及實(shí)驗(yàn)過程是否恰當(dāng)試驗(yàn)操作被確認(rèn)是引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符合的原因，那么應(yīng)制定糾正和預(yù)防措施一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則12.結(jié)果的判斷和檢測報(bào)告樣品檢驗(yàn)應(yīng)有重試的程序微生物實(shí)驗(yàn)室檢測報(bào)告應(yīng)該符合檢測方法的要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)準(zhǔn)確、清晰、明確和客觀地報(bào)告每一項(xiàng)或每一份檢測的結(jié)果一、微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則文件文件應(yīng)當(dāng)充分表明試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室里按可控的檢查法進(jìn)行的一般包括人員培訓(xùn)與資格確認(rèn)設(shè)備驗(yàn)收、驗(yàn)證、檢定(或校準(zhǔn)期間核查）和維修設(shè)備使用中的運(yùn)行狀態(tài)(設(shè)備的關(guān)鍵參數(shù)）培養(yǎng)基制備、貯藏和質(zhì)量控制菌種管理檢驗(yàn)規(guī)程中的關(guān)鍵步驟數(shù)據(jù)記錄與結(jié)果計(jì)算的確認(rèn)質(zhì)量責(zé)任人對(duì)試驗(yàn)報(bào)告的評(píng)估數(shù)據(jù)偏離的調(diào)查二、無菌檢查法概念無菌無任何存活微生物存在無菌檢查法用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、敷料及其他品種是否無菌的一種方法如供試品無菌檢查符合規(guī)定，僅表明供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染性質(zhì)：安全性、定性試驗(yàn)特點(diǎn)：局限性二、無菌檢查法需符合無菌要求的產(chǎn)品有哪些？做什么？通則1107中的要求制劑通則、品種項(xiàng)下要求無菌的及標(biāo)示無菌的制劑和原輔料用于手術(shù)、嚴(yán)重?zé)齻?、?yán)重創(chuàng)傷的局部給藥制劑標(biāo)簽標(biāo)示無菌的制劑用于止血并可被組織吸收的制劑要求無菌的醫(yī)療器械，包括外科用敷料，器材二、無菌檢查法需符合無菌要求的產(chǎn)品有哪些？做什么？二、無菌檢查法為什么無菌產(chǎn)品需符合無菌要求？為什么做？無菌產(chǎn)品污染微生物造成的危害微生物的生長繁殖，降低產(chǎn)品的有效性微生物的代謝產(chǎn)物（如一些霉素），可能危害使用者致病活微生物的存在，可能造成使用者再次感染二、無菌檢查法近些年來發(fā)生的藥害事件時(shí)間事件后果事件原因2006年7月“欣弗事件”致死11名患者未按批準(zhǔn)的工藝參數(shù)滅菌，影響滅菌效果，導(dǎo)致微生物污染2008年10月“刺五加事件”3人死亡、3人嚴(yán)重不良反應(yīng)流通環(huán)節(jié)被雨水浸泡，導(dǎo)致微生物污染二、無菌檢查法無菌產(chǎn)品的無菌檢查-怎么做？保證無菌檢查結(jié)果準(zhǔn)確的要素：人、機(jī)、料、法、環(huán)各個(gè)環(huán)節(jié)的保證人員要求機(jī)：常用儀器：集菌儀、薄膜過濾裝置、冰箱、培養(yǎng)箱、顯微鏡、菌種鑒定儀等料：集菌培養(yǎng)器、濾膜、培養(yǎng)皿、玻璃器皿、試劑、生物指示劑、培養(yǎng)基、菌種方法：薄膜過濾法、直接接種法環(huán)境：無菌隔離系統(tǒng)或B+A硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（30~35

℃培養(yǎng)）金黃色葡萄球12mL培養(yǎng)基7支3種×2支/菌1支空白對(duì)照，不接菌3天內(nèi)生長良好菌銅綠假單胞菌生孢梭菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（20~25

℃培養(yǎng)）枯草芽孢桿菌9mL培養(yǎng)基7支3種×2支/菌白色念珠菌1支空白對(duì)照，不接菌黑曲霉5天內(nèi)生長良好接入小于100cfu的菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTM）胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）培養(yǎng)基適用性檢查靈敏度檢查（金葡、銅綠、生孢、枯草、白念、黑曲）無菌性檢查（5支，14天，應(yīng)無菌）二、無菌檢查法培養(yǎng)基二、無菌檢查法如何開展無菌檢查實(shí)驗(yàn)？查標(biāo)準(zhǔn)確定是否有具體的檢查方法有具體檢查方法無具體檢查方法方法確認(rèn)方法適用性試驗(yàn)確定無菌檢查方法二、無菌檢查法方法適用性試驗(yàn)開展目的開展時(shí)間實(shí)驗(yàn)菌種確認(rèn)所采用的方法適合于供試品的無菌檢查。（確認(rèn)供試品在該檢驗(yàn)量、該檢驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不計(jì)）建立檢查法組分發(fā)生改變?cè)瓩z驗(yàn)條件改變大腸、金葡、枯草、生孢、白念、黑曲每種培養(yǎng)基的3個(gè)試驗(yàn)菌株逐一進(jìn)行適用性試驗(yàn)，均應(yīng)符合規(guī)定薄膜過濾法：取規(guī)定的樣品量過濾、沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100cfu試驗(yàn)菌，過濾。將相應(yīng)培養(yǎng)基加入濾筒中。另取同體積培養(yǎng)基加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。培養(yǎng)時(shí)間不得超過5天。各菌同法操作直接接種法：取6管硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管；取6管胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，接入小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入規(guī)定量樣品，另1管作為對(duì)照。培養(yǎng)不超過5天二、無菌檢查法方法適用性試驗(yàn)二、無菌檢查法供試品的無菌檢查關(guān)鍵理念無菌檢查法 包括薄膜過濾法和直接接種法只要供試品性質(zhì)允許，應(yīng)采用薄膜過濾法所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件須與方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法相同無菌檢查中使用的表面活性劑、滅活劑、中和劑等，應(yīng)證明其有效性和對(duì)微生物無毒性二、無菌檢查法供試品的無菌檢查檢驗(yàn)數(shù)量指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量二、無菌檢查法供試品的無菌檢查檢驗(yàn)量指供試品每個(gè)最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量（g

或

ml)表1、表2、表3中最小檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽性對(duì)照試驗(yàn)用量二、無菌檢查法陽性對(duì)照和陰性對(duì)照陽性對(duì)照選擇①

無抑菌作用和抗革蘭陽性菌為主的供試品 金葡②

抗革蘭陰性菌為主的供試品 大腸③

抗厭氧菌的供試品 生孢④

抗真菌的供試品 白念⑤

陽性對(duì)照菌菌液制備同適用性試驗(yàn)，加菌量為小于100cfu，陽性對(duì)照用供試品用量，同供試品無菌檢查時(shí)每份培養(yǎng)基接種的供試品量⑥

陽性對(duì)照容器72小時(shí)內(nèi)應(yīng)生長良好取相應(yīng)溶劑的稀釋液、沖洗液同供試品操作，不得有菌生長陰性對(duì)照二、無菌檢查法接種培養(yǎng)基、培養(yǎng)及觀察一般樣品接種兩種培養(yǎng)基的支或瓶數(shù)相等。接種供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%FTM每管不得少于15mlTSB每管不得少于10ml供試品檢查時(shí)培養(yǎng)基用量和高度同方法適用性檢查FTM管置30~35℃，TSB管置20~25℃，培養(yǎng)14天，逐日觀察并記錄結(jié)果如在供試品加入后或培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，14天培養(yǎng)后不能從外觀判斷有無微生物生長，可轉(zhuǎn)種同種新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天，觀察是否再出現(xiàn)渾濁，或鏡檢判斷是否有菌二、無菌檢查法結(jié)果判斷合格結(jié)果無效不合格供試品管和陰性對(duì)照均澄清無菌生長，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，陽性對(duì)照管中陽性菌生長良好供試品管中任一管顯渾濁并確證有菌生長，陽性對(duì)照管中陽性菌生長良好，陰性對(duì)照均澄清無菌生長陽性、陰性及供試品管均澄清無菌生長。陰性對(duì)照長菌。樣品管長的菌非樣品本身的所用設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查要求回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）

無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時(shí)應(yīng)重新取同量供試品試驗(yàn)二、無菌檢查法判試驗(yàn)結(jié)果無效的條件三、微生物限度法1.微生物計(jì)數(shù)法微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求（D+B）需氧菌總數(shù)：指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基生長的總菌落數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)：指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基生長的總菌落數(shù)方法選擇原則：根據(jù)供試品理化特性和限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)三、微生物限度法計(jì)數(shù)方法1.微生物計(jì)數(shù)法平皿法 傾注法和涂布法薄膜過濾法最可能數(shù)法（MPN法）

用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜方法時(shí)使用，不適用于霉菌計(jì)數(shù)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（30～35℃銅綠假單胞菌接種量不大于100cfu，培養(yǎng)時(shí)間不超過3天金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌接種量不大于100cfu，培養(yǎng)時(shí)間不超過5天黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（20～25℃白色念珠菌接種量不大于100cfu，培養(yǎng)時(shí)間不超過5天黑曲霉與對(duì)照培養(yǎng)基比較，回收率在50％~200％之間））培養(yǎng)基：需氧菌總數(shù)：TSA霉菌及酵母菌總數(shù)：SDA培養(yǎng)基適用性檢查：TSA：銅綠、金葡、枯草、白念、黑曲SDA：白念、黑曲結(jié)果判定：

0.5-2三、微生物限度法1.微生物計(jì)數(shù)法三、微生物限度法1.微生物計(jì)數(shù)法-方法適用性檢查應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)前評(píng)估根據(jù)配方進(jìn)行分析，產(chǎn)品中是否有抑菌成分參照歷史上曾經(jīng)進(jìn)行過的方法驗(yàn)證，根據(jù)歷史數(shù)據(jù)判斷產(chǎn)品是否有抑菌。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)判斷樣品中有無抑菌通過以上判斷，起草方法適用性試驗(yàn)草案，確定方法適用性試驗(yàn)具體過程。需氧菌計(jì)數(shù)用5種菌株試驗(yàn)（銅綠、金葡、枯草、白念、黑曲）霉菌和酵母菌總數(shù)用2種菌株試驗(yàn)（白念、黑曲）抑菌劑活性的去除和滅活（增加稀釋液或培養(yǎng)基體積、加入適宜的中和劑或滅活劑）三、微生物限度法1.微生物計(jì)數(shù)法-方法適用性檢查試驗(yàn)組供試液中加入規(guī)定量的菌液供試品對(duì)照組供試液，不加菌液按照試驗(yàn)組進(jìn)行試驗(yàn)菌液對(duì)照組取不含中和劑、滅活劑及表面活性劑的稀釋液加入規(guī)定量的菌液中和劑對(duì)照組中和劑、滅活劑及表面活性劑的稀釋液中加入規(guī)定量菌液結(jié)果判斷（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)比值應(yīng)在0.5～2內(nèi)（中和劑或滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組菌落數(shù)比值應(yīng)在0.5～2內(nèi)三、微生物限度法1.微生物計(jì)數(shù)法-方法適用性檢查+

0.1ml白色念珠菌液++

0.10.1mlml枯草芽孢桿菌液枯草芽孢桿菌液+++++

0.10.10.10.10.1mlmlmlmlml金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液++++

0.10.10.10.1mlmlmlml銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液+

0.1ml黑曲霉菌液+

0.1ml白色念珠菌液+

0.1ml枯草芽孢桿菌液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性分裝5份，采取適宜的方法9.9ml制備合適的供試液。供試液+

0.1ml銅綠假單胞菌液<1>試驗(yàn)組：稀釋度依據(jù)樣品特性，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定平皿法保證平皿中的菌數(shù)不大于100cfu三、微生物限度法1.微生物計(jì)數(shù)法-方法適用性檢查同試驗(yàn)組用供試液不含中和劑、滅活劑及表面活性劑的的相應(yīng)稀釋液分裝5份9.9ml稀釋液+

0.1ml白色念珠菌液++

0.10.1mlml枯草芽孢桿菌液枯草芽孢桿菌液+++++

0.10.10.10.10.1mlmlmlmlml金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液++++

0.10.10.10.1mlmlmlml銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液+

0.1ml黑曲霉菌液+

0.1ml白色念珠菌液+

0.1ml枯草芽孢桿菌液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液+

0.1ml銅綠假單胞菌液<2>供試品對(duì)照組：供試品對(duì)照組為中國藥典特殊規(guī)定的，協(xié)調(diào)案無相關(guān)要求<3>菌液對(duì)照組：保證平皿中的菌數(shù)不大于100cfu平皿法三、微生物限度法1.微生物計(jì)數(shù)法-方法適用性檢查分裝5份9.9ml稀釋液+++++

0.10.10.10.10.1mlmlmlmlml金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液+

0.1ml白色念珠菌液++

0.10.1mlml枯草芽孢桿菌液枯草芽孢桿菌液++++

0.10.10.10.1mlmlmlml銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液+

0.1ml黑曲霉菌液+

0.1ml白色念珠菌液

+

0.1ml枯草芽孢桿菌液+

0.1ml銅綠假單胞菌液稀釋液90

ml稀釋液中和劑、抑菌劑或表面活性劑稀釋液<4>中和劑或滅活劑對(duì)照組：保證平皿中的菌數(shù)不大于100cfu平皿法三、微生物限度法1.微生物計(jì)數(shù)法-方法適用性檢查三、微生物限度法微生物計(jì)數(shù)法-供試品檢查檢驗(yàn)量：一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或cm2）隨機(jī)抽樣，不少于2個(gè)最小包裝，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。除另有規(guī)定外，一般取10g或10ml供試品進(jìn)行檢測，膜劑為100cm2；貴重藥品，微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可酌減；大蜜丸不得少于4丸，膜劑不得少于4片。計(jì)數(shù)按照計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。供試品檢查時(shí)需進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)。如果對(duì)照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查三、微生物限度法微生物計(jì)數(shù)法-供試品檢查培養(yǎng)試驗(yàn)方式：按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)的測定培養(yǎng)條件：胰酪大豆胨瓊脂平板在30～35℃培養(yǎng)3-5天，沙氏葡萄糖瓊脂平板在20～25℃培養(yǎng)5～7天；MPN法和供試品接種，所有試驗(yàn)管在30～35℃培養(yǎng)3～5天結(jié)果判斷-計(jì)數(shù)要求需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)(包括真菌菌落數(shù))霉菌及酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)(包括細(xì)菌菌落數(shù))若因沙氏葡萄糖瓊脂上生長的細(xì)菌使霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素(如氯霉素、慶大霉素)的沙氏葡萄糖瓊脂中或選擇性培養(yǎng)基(如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基)，使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查若采用

MPN

法，測定結(jié)果為需氧菌總數(shù)結(jié)果判斷-計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)各品種項(xiàng)下要求執(zhí)行的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：101cfu：

可接受的最大限度為20；102cfu：

可接受的最大限度為200；103cfu：

允許的最大限度為

2000：依此類推。若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。三、微生物限度法1.微生物計(jì)數(shù)法-供試品檢查系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢査供試品中是否存在特定的微生物供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試三、微生物限度法2.控制菌檢查法在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不短于規(guī)定的最長培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長液體：與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好；固體：被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。促生長能力抑制能力指示能力培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)培養(yǎng)18h后觀察菌落形態(tài)三、微生物限度法2.控制菌檢查法三、微生物限度法2.控制菌檢查法培養(yǎng)基三、微生物限度法控制菌檢查法-方法適用性檢查試驗(yàn)菌根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗(yàn)菌株，確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí)，采取大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌方法按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于100cfu的試驗(yàn)菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中；采用薄膜過濾時(shí)，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中

依相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度及最短時(shí)間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗(yàn)菌相應(yīng)的反應(yīng)特征結(jié)果判斷若上述試驗(yàn)檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性（《非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)法》中的“抗菌活性的去除或滅活”）如果經(jīng)過試驗(yàn)確證供試品對(duì)試驗(yàn)菌的抗菌作用無法消除，可認(rèn)為受抑制的微生物不可能存在于該供試品中，選擇抑菌成份消除相對(duì)徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查陽性對(duì)照試驗(yàn)

陽性對(duì)照試驗(yàn)方法同供試品的控制菌檢查，對(duì)照菌的加量應(yīng)不大于lOOcfu。陽性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌陰性對(duì)照試驗(yàn)

以稀釋劑代替供試液按照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。如果陰性對(duì)照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查三、微生物限度法2.控制菌檢查法-供試品檢查耐膽鹽革蘭陰性菌預(yù)培養(yǎng)2h，20-25℃供試品至TSB制成1：10供試液腸道菌增菌液體30-35℃，24-48h相當(dāng)于1g到腸道菌增菌液體紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂選擇性瓊脂30-35℃，18-24h供試液A供試液B

+菌測試菌株：大腸埃希菌銅綠假單胞菌定性試驗(yàn)結(jié)果判斷：如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽格蘭陰性菌。三、微生物限度法2.控制菌檢查法-供試品檢查預(yù)培養(yǎng)2h，20-25℃供試品至TSB制成1：10供試液選擇性增菌30-35℃，24-48h腸道菌增菌液體0.1,0.01,0.001g選擇性瓊脂30-35℃，18-24h紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂供試液A供試液B

+菌定量試驗(yàn)?zāi)湍扄}革蘭陰性菌結(jié)果判斷：若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長，則對(duì)應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2查對(duì)1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的最大可能數(shù)。三、微生物限度法2.控制菌檢查法-供試品檢查增菌培養(yǎng) 30-35℃,18-24h結(jié)果判斷：若麥康凱瓊脂平板上有菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn),確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。相當(dāng)于1g到TSB選擇性增菌，42℃，24-48h1mL到100mL麥康凱液體選擇性瓊脂30-35℃,18-72h麥康凱瓊脂供試液A供試液B

+菌大腸埃希菌三、微生物限度法2.控制菌檢查法-供試品檢查增菌培養(yǎng)30-35℃,18-24h10g到TSB選擇性增菌，30-35℃,18-24h0.1mL到

10mLRV沙門增菌液體選擇性瓊脂30-35℃,18-48h木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂供試液A供試液B

+菌沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上生長良好，菌落為紅色、中心有或無黑色。結(jié)果判斷：若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層有黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn),確證是否為沙門菌。