宿主vero細(xì)胞DNA殘留量SOP

宿主vero細(xì)胞DNA殘留量操作規(guī)程試劑DNA標(biāo)記和檢測試劑盒TaKaRauniversalGenomicDNAExtractionKitver3.0(DV811A)(3)TaKaRaDNAFragmentPurificationKit(807A)DNA雜交膜：尼龍膜2%蛋白酶K溶液：稱取蛋白酶K0.20g，溶于滅菌水10ml中，分裝后儲存于-20°C備用。3%牛血清白蛋白溶液：稱取牛血清白蛋白0.30g，溶于滅菌水10ml中。1mol/l三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液(Ph8.0):用鹽酸調(diào)pH至8.0。5.0mol/l氯化鈉溶液0.5mol/l乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.0)用10mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至8.0。20%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液：用鹽酸調(diào)pH至7.2。蛋白酶緩沖液(pH8.0)量取1mol/lTris溶液1.0ml(pH8.0),5mol/l氯化鈉溶液2.0ml,0.5mol/l乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.0)2.0ml,20%SDS溶液2.5ml，加滅菌水至10ml。TE緩沖液(Ph8.0)量取1mol/lTris溶液10ml,0.5mol/l乙二胺四乙酸二鈉溶液(pH8.0)2ml,加滅菌水至1000ml。1%魚精DNA溶液：精密稱取魚精DNA0.10g,置10ml量瓶中，用TE緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，用7號針頭反復(fù)抽打以剪切DNA成為小分子，分裝后貯藏于-20°C備用。DNA稀釋液:取1%魚精DNA溶液50ul,加TE緩沖液至10ml。washingbuffer：0.1M馬來酸；0.15M氯化鈉；0.3%Tween20;PH7.5。馬來酸溶液：0.1M馬來酸；0.15M氯化鈉；PH7.5。檢測液：0.1MTris-Hcl；0.15M氯化鈉；PH9.5。一、用于標(biāo)記探針和陽性對照的DNA制備DNA的提取:用TaKaRauniversalGenomicDNAExtractionKitver3.0(DV811A)試劑盒提取DNA。測定DNA的吸光度：用TE將DNA稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使DNA的A,”260值在為0.2-1.0之間(一般為40倍)，然后在紫外分光光度計(jì)測定其波長在260nm和280nm的OD值，并且A260/A280應(yīng)在1.8-2.0之間。其含量(pg/ml)為：A260X50X稀釋倍數(shù)。酶切DNA:取DNA約1pg，用Haelll酶(TaKaRaD1051A)酶切1小時(shí)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段大小是否被切開。酶切反應(yīng)液中DNA的回收:使用TaKaRaDNAFragmentPurificationKit(807A)回收酶切反應(yīng)液中的DNA,然后在紫外分光光度計(jì)測定其波長在260nm和280nm的OD值，并且A260/A280應(yīng)在1.8-2.0之間。其含量(pg/ml)為：A260X50X稀釋倍數(shù)。將上述4中回收的DNA作為陽性對照品，標(biāo)明DNA濃度,分裝于EP管中，-20C以下保存。二、 探針的制備取標(biāo)準(zhǔn)DNA約1以g加滅菌水至終體積16u1。變性：沸水浴煮10min，立即冷卻2min。取Via14u1加到變性的DNA中，混合均勻，放入37°C溫箱中放置過夜。次日，取出3,向其中加入2.0u10.2MEDTA(PH8.0),2.5u13M(PH5.2)NaAc，冰無水乙醇75ul，-20C放置2小時(shí)。取出4，4C12500rpm離心15min，輕輕倒掉上清。加入70%乙醇約150ul，緩慢晃動(dòng)，4C12500rpm離心15min，棄掉上清。室溫晾干。加入50ulTE(PH8.0)，吹打管底，放于-20C保存，作為探針。三、 探針效力的檢測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：取Vial2標(biāo)準(zhǔn)品，用稀釋液將其稀釋為10pg/ul、3pg/ul、1pg/ul、0.3pg/ul、0.1pg/ul、0.03pg/ul、0.01pg/ulo探針稀釋同標(biāo)準(zhǔn)品。點(diǎn)樣：將稀釋后的樣品及標(biāo)準(zhǔn)品分別取樣1ul點(diǎn)至尼龍膜上。固定：將點(diǎn)樣后的膜，放置干燥箱中，80C2ho封底：在10ml中blockingsolution(用馬來酸溶液將Vial6做10倍稀釋，即blockingsolution)中孵育30min。加入酶結(jié)合物：在antibodysolution(用blockingsolution將Vial4做5000倍稀釋即antibodysolution)中孵育30min。洗膜：用10mlwashbuffer洗2遍，15min/次。平衡：在10ml檢測液中平衡2min。顯色：加入2ml新鮮配制的顯色液(40ulvial5+2ml檢測液)，避光放置。終止：待理想的斑點(diǎn)顯色后，在50ml滅菌水中洗5min，然后比較探針與標(biāo)準(zhǔn)DNA斑點(diǎn)的顯色程度，計(jì)算DNA探針的濃度。四、測定方法1.陽性DNA的稀釋：用DNA稀釋液將陽性DNA對照稀釋成1pg/ul(D])、0.1pg/ul(D2)、0.01pg/ul(D3)三個(gè)稀釋度。2.蛋白酶K預(yù)處理：加樣量2%蛋白酶K溶液蛋白酶緩沖液3%牛血清白蛋白溶液加水至終體積供試品200ul2ul40ul400ulD1 200ul2ul40ul4ul400ulD2 200ul2ul40ul4ul400ulD3200ul2ul40ul4ul400ul陰性200ul2ul40ul4ul400ul上述樣品混合后放入37°C，保溫4小時(shí)。注：陰性對照為DNA稀釋液；空白對照為未進(jìn)行蛋白酶K預(yù)處理的TE緩沖液。3.提取DNA:于蛋白酶K預(yù)處理的混合液中加入等體積的酚：氯仿:異戊醇的混合液(按25：24：1的比例混合)抽提，混勻后，15000rpm,15min離心，取上層澄清液體于新的離心管中，再加入0.2V的乙酸銨(7.5mol/l)和2V的冰無水乙醇，12000rpm，離心10min，棄上清，加入400ul冰70%乙醇，洗2遍，12000rpm/5min/次，倒掉上清，室溫晾干，然后加入200ulTE溶解DNA。點(diǎn)膜：用TE緩沖液浸潤雜交膜后，將提取后的DNA、空白對照置100°C水浴加熱10min，迅速冰浴冷卻2min,以每分鐘8000轉(zhuǎn)離心5秒。然后用抽濾加樣器點(diǎn)樣于雜交膜(加樣量190ul)。置80C真空干烤1小時(shí)以上。預(yù)雜交5.1在42C預(yù)熱合適體積的雜交液(Vial7)(按10ml/100cm2膜)。5.2將雜交膜在預(yù)雜交液中孵育30min。雜交DNA探針變性：探針(約500ng/ml)煮沸10min，快速冷卻2min。6.2雜交液：將變性的探針加入到預(yù)熱的雜交液(3.5ml/100cm2)中。6.3孵育：倒掉預(yù)雜交液，加入雜交液，放入42C搖床中，孵育過夜。洗膜室溫下用液體A(2XSSC;0.1%SDS)洗2次，5min/次o65C下用液體B(0.5XSSC;0.1%SDS)洗2次，15min/次。封底：在適量(100mlblockingsolution/100cm2膜)的blockingsolution(用馬來酸溶液將Vial6做10倍稀釋，即blockingsolution)中，孵育30min。加入酶結(jié)合物：在適量(20mlantibodysolution/100cm2膜)antibodysolution(用blockingsolution將Vial4做5000倍稀釋即antibodysolution)中孵育30min。洗膜：在適量(100ml/100cm2膜)washbuffer中洗2遍，15min/次。平衡：在檢測液（20ml/100cm2膜）中平衡5min。顯色：加入2ml新鮮配制的顯色液（10ml/100cm2膜）（40ulvial5+2ml檢測液），避光放置。終止：待理想的條帶顯色后，在50ml滅菌水中洗5min。結(jié)果判定：陽性對照應(yīng)顯色，其顏色深度與DNA含量相對應(yīng)，呈一定的顏色梯度；陰性、空白對照應(yīng)不顯色，或顯色深度小于陽性DNA對照D3,試驗(yàn)成立。將供試品與陽性對照進(jìn)行比較，根據(jù)顯色的深淺判定供試品中DNA的含量，其中成品顯色深度應(yīng)不深于陽性DNA對照D2，視為合格。目前存在或尚待解決的問題1.陽性對照DNA的一致性：由于陽性對照DNA為公司內(nèi)部自己制備，與國家檢定機(jī)構(gòu)比較，可能存