化學發(fā)光法檢測傳染病

化學發(fā)光法檢測傳染病

更靈敏、更特異、更準確放免酶聯(lián)免疫化學發(fā)光熒光免疫60年代70年代80年代90年代免疫標記技術發(fā)展國產(chǎn)進口酶促化學發(fā)光直接化學發(fā)光

化學發(fā)光技術的優(yōu)勢與應用前景

.敏感度高，(10-21mol/L)超過酶免，熒光免疫等方法.精密度，準確度超過放免，酶免，熒光免疫等方法.試劑穩(wěn)定，無放射性，污染或生物毒性；.測定耗時短，方便快速提供結果報告；.測定項目齊全；已發(fā)展成全自動的測定系統(tǒng)。包被微粒子包被磁珠包被微孔包被試管包被技術的發(fā)展---磁微粒子包被磁微粒標記異魯米諾Eg:雙抗夾心法分析模式

磁微粒子上包被的抗體與待檢測抗原及異魯米諾標記抗體結合提升檢測功能靈敏度增加檢測線性范圍比吖啶酯更穩(wěn)定延長試劑效期**********YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY*YYYYYYYY微粒包被液相反應磁微粒、直接化學發(fā)光反應反應充分速度更快酶標板，板式磁微粒，納米級，均相CLIA板式載量YYYYYYYYY磁微粒子直接化學法Ag/Ab酶標板發(fā)光板Ag/Ab微粒子化學發(fā)光法抗體載量優(yōu)勢分配樣品,磁顆粒和試劑孵育使反應物結合在磁場中清洗去除未結合物質加入激發(fā)液產(chǎn)生信號信號檢測微粒子化學發(fā)光原理磁性微粒子及其分離技術磁性微粒子技術的優(yōu)點：快速分離結合相與游離相提高與Ag或Ab包被親和力提高接觸表面積/反應容量比例，實現(xiàn)微量分析不需要抗體分離步驟，杜絕干擾與交叉反應允許共價耦合反應，因此可以檢測大/小分子的各種物質成分能應用各種分析設計與反應模式，擴大應用范圍如：夾心法，竟爭法，抗體檢測法等利于檢測自動化與微量分析磁微粒子直接化學發(fā)光是最新一代免疫檢測新技術具有液相、快速、靈敏、準確的特點通過多中心的臨床評估，基本上驗證了LICA在乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、腫瘤標志物、甲狀腺功能等項目的臨床可用性多家臨床試驗顯示產(chǎn)品的質量不亞于進口的雅培、羅氏和西門子等廠家的產(chǎn)品媲美。AutolumiS2000微粒子化學發(fā)光儀

全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)開發(fā)及其產(chǎn)業(yè)化，在2011年12月通過國家科學技術委員會的鑒定，鑒定委員會認為：

該項目具有創(chuàng)新性和自主知識產(chǎn)權，整體達到國際先進水平。1）磁性微粒子技術：便于分離，反應均勻，提高靈敏度2）泉涌內外壁清洗技術：最小的交叉污染率3）試劑盒蓋設計：減少人工操作誤差和交叉污染，避免試劑揮發(fā)影響結果準確性4）試劑冷藏系統(tǒng)：保證在儀器操作的過程中試劑能夠一直保持穩(wěn)定5）磁性分離技術：保證了清洗效率，對于靈敏度要求極高的標記免疫分析是十分關鍵的專利，獨有技術AutolumiS2000免疫項目甲狀腺功能甲狀腺素三碘甲狀腺原氨酸游離甲狀腺素游離三碘甲狀腺原氨酸促甲狀腺素性腺激素人絨毛膜促性腺激素催乳素雌二醇卵泡刺激素黃體生成素孕酮睪酮腫瘤標志物甲胎蛋白癌胚抗原前列腺特異性抗原游離前列腺特異性抗原糖類抗原125糖類抗原15-3糖類抗原19-9β2微球蛋白鐵蛋白神經(jīng)元特異性烯醇化酶人鈣結合蛋白腫瘤相關抗原72-4鱗狀上皮癌相關抗原細胞角蛋白CYFRA21-1心血管及心肌標志物N末端腦鈉肽肌鈣蛋白Ⅰ肌酸激酶同工酶C反應蛋白心肌脂肪酸結合蛋白脂蛋白相關磷脂酶A2髓過氧化物酶肌紅蛋白肝纖維化四項透明質酸Ⅲ型前膠原N端肽Ⅳ型膠原蛋白層粘連帶白傳染病乙型肝炎病毒前S1抗原乙型肝炎病毒e抗體乙型肝炎病毒e抗原乙型肝炎病毒核心抗體乙型肝炎病毒表面抗體乙型肝炎病毒表面抗原丙型肝炎抗體（HCV）梅毒抗體（TP）人類免疫缺陷病毒抗體糖代謝類胰島素C-肽全自動、管式、直接化學發(fā)光法

---------------特異性強、性能穩(wěn)定

超長時間無人值守（1）試劑區(qū)15個試劑位，（2）樣本區(qū)12╳12=144個樣本位（3）碼垛區(qū)一次性裝載720個反應杯測試中可隨時添加，隨時替換AutolumiS2000微粒子化學發(fā)光儀AutolumiS2000微粒子化學發(fā)光儀真正的急診功能，急診樣本，隨到隨測。測試速度高達220測試/小時原試管上樣，無需倒管。全封閉反應艙，有效減少外界環(huán)境干擾和污染全中文軟件，圖標式界面，操作更簡便綜合測試成本低

管式、微粒子包被技術，反應速度更快，結果更準確。ELISA法檢測乙肝表面抗原、梅毒、艾滋、丙肝按照2010年《藥典》規(guī)定反應時間至少要2小時30分鐘；而全自動微粒子化學發(fā)光試劑則不到30分鐘即可完成。穩(wěn)定性更好特異性更好AutolumiS2000微粒子化學發(fā)光儀大部分國際一流廠家也都采用直接發(fā)光法：羅氏西門子雅培…….傳染病試劑傳統(tǒng)酶免法和微粒子化學發(fā)光法對比方法學項目傳統(tǒng)酶免法微粒子發(fā)光法分析敏感度特異性精密度分析敏感度特異性精密度HBsAgadr0.1IU/mLadw0.1IU/mLay0.2IU/mL(-/-)20/20(+/+)3/313.21%adr0.1IU/mLadw0.1IU/mLay0.2IU/mL(-/-)20/20(+/+)3/38.03%HBsAb10mIU/mL(-/-)20/2012.05%10mIU/mL(-/-)20/207.45%HBeAg1#

≥1:642#

≥1:1283#

≥1:32(-/-)15/15(+/+)9/1012.04%1#

≥1:642#

≥1:1283#

≥1:32(-/-)15/15(+/+)10/108.03%HBeAb1#

≥1:322#

≥1:643#

≥1:64(-/-)15/15(+/+)9/1012.31%1#

≥1:322#

≥1:643#

≥1:64(-/-)15/15(+/+)10/108.20%HBcAb1#

≥1:1282#

≥1:1283#

≥1:256(-/-)15/15(+/+)14/1514.03%1#

≥1:1282#

≥1:1283#

≥1:256(-/-)15/15(+/+)15/1510.34%HCVL1、L2陽性，L3陰性，L4陰性(-/-)29/30(+/+)29/3010.05%L1、L2陽性L3陽性，L4陰性(-/-)30/30(+/+)30/307%HIVS1,S2陰性,S3,S4,S5,S6陽性(-/-)18/20(+/+)20/2014.34%S1陰性,S2,S3,S4,S5,S6陽性(-/-)20/20(+/+)20/2010%TPL1、L2陽性，L3陰性，L4陰性(-/-)20/20(+/+)10/1011.26%L1、L2陽性L3陽性，L4陰性(-/-)20/20(+/+)10/107.98%

參比試劑：雅培I2000乙肝靈敏度特異性符合率HBsAg97.92%100%99.78%Anti-HBs95.98%97.38%96.69%HBeAg95.24%100%99.59%Anti-HBe90.77%97.21%95.36%Anti-HBc91.54%98.9%94.48%試劑性能多中心臨床評估（乙肝）免疫測定試劑的關鍵點作為免疫反應，抗原抗體的選擇是整個免疫分析特異性和總體表現(xiàn)的關鍵如何選擇好一個抗體(單克隆或多克隆)去檢測一個被檢物質，而不與非常相似結構的其它代謝產(chǎn)物有交叉反應,或著是一些沒有臨床意義的分解產(chǎn)物等，這是分析設計的重點中之重點。批內、批間的分析重現(xiàn)性。AFPHBsAg4.50%1.79%4.91%2.14%HCV12345……MeanSDCV批內86.1186.3688.4087.9086.43……86.271.551.79%批間74.5973.6369.6471.9071.96……71.013.204.50%HBsAg12345……MeanSDCV批內72.5971.2576.5075.0578.03……76.611.642.14%批間0.220.220.230.220.23……0.230.014.91%批內批間微粒子化學發(fā)光試劑的精密度相關性相關系數(shù)線性系數(shù)HIV顯著相關0.990.98HCV顯著相關0.930.99參比試劑：雅培試劑性能多中心臨床評估相關性相關系數(shù)線性系數(shù)HIV顯著相關0.970.92HBsAg顯著相關0.960.95N=500，參比試劑：雅培I2000試劑性能多中心臨床評估

丙型肝炎抗體診斷試劑丙肝病毒復雜的基因結構：決定了抗體譜的差異，從而為丙肝抗體檢測敏感度的提高帶來了困難。丙肝診斷試劑目前存在的問題1、灰區(qū)標本的困惑2、陽性標本的漏檢問題形成的技術原因---灰區(qū)的形成1、重組抗原的原因（1）融合蛋白（2）大腸桿菌雜蛋白2、第二抗體的非特異反應（1）酶標抗體對固相載體的直接吸附酶標二抗對于丙肝抗體是非特異的，和各種人IgG均能反應結合。（2）個別標本中IgG濃度過高多聚體的混合：E-E、E-Ab、E-Ab-E、E-Ab-E-Ab，既引起本底背景，又阻遏抗原抗體反應問題形成的技術原因---陽性標本的漏檢1、關于靈敏度的兩個概念（1）分析靈敏度決定因素：

a.單個抗原決定族的抗原性強弱。

b.試劑盒的信號放大能力（2）流行病學敏感度決定因素：

a.抗原片段的種類是否齊全。

b.是否含構像抗原。

c.分析靈敏度的高低。CE1E2/NS1NS2NS3NS4aNS4bNS5aNS5b丙型肝炎病毒的基因結構ELISA-1stRIBA-1stELISA-2stRIBA-2stELISA-3stRIBA-3stC22-3C22-3NS5NS5C100C1005-1-1C33CC100C33CC1005-1-1C33CC33CC100C1005-1-12、抗原片段種類不全3、包涵體抗原，抗原性弱4、缺乏構像表位5、原核表達分子量小，抗原表位有限6、抗原非糖基化，穩(wěn)定性差7、信號放大能力有限8、固相載體形成的空間位阻問題形成的技術原因---陽性標本的漏檢威高新型丙肝化學發(fā)光試劑的關鍵技術1、包被和標記實現(xiàn)雙特異，以降低假陽性率，并提高分析敏感度。2、通過整體系統(tǒng)優(yōu)化，進一步擴大陰陽反差，使結果判讀涇渭分明。威高新型丙肝化學發(fā)光試劑技術策略---灰區(qū)的解決1、酵母真核表達抗原，高效減少灰區(qū)標本

eg:E.coli與Pichiapastoris檢測國標國標品表達載體N2N4N24P1P5P21大腸桿菌（原核表達）0.2600.1490.2350.7422.6590.706畢赫酵母（真核表達）0.0600.0140.0171.7362.8331.619AntiHCV重組NS3抗原

NS3HCV病毒的最重要的抗原

通過酵母真核系統(tǒng)成功的表達NS3抗原,

多重折疊以達到高度的免疫活性

高純度;易于直接標記2、針對Fab端的單特異性抗體標記物

一般二抗和單特異抗體的對比

國標二抗類型P27L3N2N4N18N24L4一般單抗0.5600.1600.2300.1620.0710.2140.065單特異抗體0.8920.3210.0650.0430.0140.1020.009

3、板式固相載體升級為管式磁微粒子包被★包被量更富足

★管式液相反應更充分★更有效的解決空間位阻效應

4、光信號檢測，提高信噪比

信號放大代替靶標放大，減少靶標放大帶來的非特異性反應，遠遠大于ELISA的信噪比。新型丙肝化學發(fā)光試劑---降低漏檢率1、在CORE、NS3、NS4、NS5的基礎上增加了E1區(qū)，保證抗原片段的齊全2、pichiapastoris表達系統(tǒng)帶來以下優(yōu)勢（1）非包涵體而可溶性表達，抗原性強（2）因糖基化而提高穩(wěn)定性（3）分子量大，抗原表位豐富（4）具有構像抗原表位，而提高檢出率3、磁微粒子標記抗原增加抗原抗體的反應強度新型丙肝化學發(fā)光試劑

檢測國家參考品符合率對比方法學陽性符合率陰性符合率最低減出限ELISA30/3029/303/4CLIA30/3030/303/4新型雙特異丙肝化學發(fā)光診斷試劑

臨床驗證報告方法學真陽性檢出率假陽性率酶免試劑146/15019/2000新型雙特異150/1503/2000丙肝化學發(fā)光試劑臨床對比試驗報告對照試劑：雅培I2000SR試驗單位：包頭市中心醫(yī)院雅培總計陽性陰性威高陽性404陰性11314總計51318NO。雅培CUTOFF=18000威高CUTOFF=5040RLUs∕coRLUs∕co17200.0415970.317225200.1420720.411318000.117490.347412600.0717230.342514400.0818750.372618000.1018790.373721600.1223130.45985400.0315120.30099000.0516170.321107200.0416020.3181110800.0618390.365125400.0315220.302137200.0416170.32114340201.8939410.7821522644012.5822200644.04916340201.8922654844.951722644012.585