第二章 病毒培養(yǎng)

第二章病毒的培養(yǎng)本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雞胚體外培養(yǎng)的組織細(xì)胞第一節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、倉鼠1、分離病毒，并借助感染范圍試驗(yàn)鑒定病毒2、測定各毒株之間的抗原關(guān)系3、制備免疫血清和單克隆抗體4、作病毒感染的實(shí)驗(yàn)研究，包括病毒毒力測定，建立病毒病動(dòng)物模型5、培養(yǎng)病毒，制造抗原和疫苗注意：選擇對目的病毒敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種品系，以及適宜的接種途徑和劑量。

一、優(yōu)點(diǎn)

1、組織分化程度低，病毒易于增殖

2、可選擇不同的日齡和接種途徑

3、感染病毒的組織和液體中含大量病毒

4、容易采集和處理

5、來源充足

6、設(shè)備和操作簡便易行第二節(jié)雞胚二、缺點(diǎn)

1、胚內(nèi)可能污染細(xì)菌和病毒

沙門氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽腦脊髓炎病毒

2、母源抗體

3、許多病毒在雞胚中增殖缺乏特異性的感染指針三、受精卵的質(zhì)量和孵化

１、受精卵最好來自SPF雞群

２、受精卵應(yīng)該是新鮮的

３、受精卵的殼最好是白色的

４、孵化溫度37.5-38.5℃，濕度50-60%，通風(fēng)。

SPF(無特定病原微生物污染的)四、接種途徑

1、絨毛尿囊膜接種

2、尿囊腔接種

3、卵黃囊接種

4、靜脈接種藍(lán)舌病毒

5、羊膜腔接種正粘病毒和副粘病毒

6、腦內(nèi)接種狂犬病毒

7、眼球接種雞胚的結(jié)構(gòu)與接種途徑第三節(jié)組織培養(yǎng)

組織塊培養(yǎng)

器官培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)一、細(xì)胞

原代細(xì)胞：應(yīng)用胰酶等分散劑將動(dòng)物組織消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，適當(dāng)洗滌以后，加入營養(yǎng)液，使其貼附于玻璃瓶壁上，并生長增殖。

繼代細(xì)胞：將已長成單層的原代細(xì)胞從瓶壁上消化下來再作培養(yǎng)獲得的細(xì)胞。＝《100代傳代細(xì)胞：由于遺傳突變或者在理化學(xué)物質(zhì)和致瘤病毒的作用下，組織培養(yǎng)細(xì)胞中有時(shí)出現(xiàn)惡性變細(xì)胞，也就是癌變細(xì)胞，這種病變細(xì)胞具有很高的增殖勢能，而且?guī)缀蹩梢詿o限地傳代。無接觸抑制現(xiàn)象，而原代細(xì)胞有

BHK-21倉鼠腎細(xì)胞、PK-15、IBRS-2、MDBK牛腎、MDCK、Hela、Vero非洲綠猴腎細(xì)胞、TK-143、Marc-145、Sf9昆蟲

細(xì)胞瓶：800ml(100~150ml)100ml(10ml)50ml(6~8ml)優(yōu)點(diǎn)：

1)可以無限的傳代。

2)不少細(xì)胞系對病毒很敏感。

3)某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。

4)生長旺盛，繁殖快速，對營養(yǎng)條件不苛刻。

缺點(diǎn)：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。綠熒光蛋白在IBRS-2細(xì)胞中的表達(dá)40X100XA正常IBRS-2B消化的IBRS-2BAAA正常PK-15B消化的PK-15C感染PRV的PK-15CB接種PRV后不同時(shí)間的PK-15BA二、細(xì)胞培養(yǎng)所用器材

1、玻璃器皿

2、塑料制品

3、橡皮制品

4、濾器

蔡氏濾器、玻璃濾器、微孔濾膜三、洗液和溶液

1、Hanks液（NaCl、KCl、MgSO4、MgCl2、CaCl2、Na2HPO4、KH2PO4）

使用前用NaHCO3調(diào)pH值。

2、Earle液（NaCl、KCl、MgCl2、NaH2PO4）

使用前用NaHCO3調(diào)pH值。

3、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、MgCl2、CaCl2）4、組織培養(yǎng)常用抗生素液抗生素抗菌譜參考濃度（μg/ml）細(xì)菌真菌支原體青霉素-GG+100IU/ml鏈霉素G-100慶大霉素G+/G-+200四環(huán)素G+/G-+10卡那霉素G+/G-+50兩性霉素B+2制霉菌素+255、pH調(diào)整液

NaHCO3溶液（7.4%、5.6%、3.7%）

Herpes溶液（羥乙基哌嗪乙硫磺酸）

6、谷氨酰胺7、細(xì)胞分散劑（消化液）

能使組織塊或成片細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞。

１）胰蛋白酶溶液（trypsinsolution）

作用機(jī)制：使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解，導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)水解而使細(xì)胞或組織塊消化為分散的單個(gè)細(xì)胞。

其活力用解離酪蛋白的能力來表示，常見的有1:125和1:250兩種。

使用濃度：0.25%、0.125%、0.08%

最佳作用條件：pH8.0、37℃２）乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）(Versene液）

作用機(jī)制：與鈣、鎂離子結(jié)合

使用濃度：0.02%

使用方法：單獨(dú)作用或與胰酶按一定比例混合作用

３）灰色鏈絲菌酶

蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶四、培養(yǎng)液（基）

（一）天然培養(yǎng)基

動(dòng)物血清、水解乳蛋白以及自制的體液或組織提取液1、血清（serum）

1）血清的種類和來源

胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)

新生牛血清(newborncalfserum,NCS)

成年牛血清(adultbovineserum)

馬血清(horseserum)

雞血清(chickenserum)

兔血清(rabbitserum)

羊血清(sheeporgoatserum)

人血清(humanserum)2）血清的作用

A、能提供細(xì)胞生存、生長和增生所必須的生長調(diào)節(jié)因子。（胰島素、生長激素、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子）

B、能補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。（低分子量營養(yǎng)因子）

C、含有一些可供貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿表面貼附和鋪展的生長基質(zhì)成分。D、提供載體蛋白（轉(zhuǎn)鐵蛋白、無脂肪酸白蛋白），可結(jié)合維生素、脂質(zhì)、金屬離子等。

E、有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害的作用。

F、給培養(yǎng)液提供良好的緩沖系統(tǒng)。

G、提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞釋放的蛋白酶的損害。3）應(yīng)用血清存在的問題

A、存在不少有害于細(xì)胞生長和繁殖的物質(zhì)：補(bǔ)體、免疫球蛋白、生長抑制因子等。

B、成分不明確，影響對結(jié)果的分析。

C、不同動(dòng)物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定。4）采血后血清的分離

采血后將采血瓶或管傾斜，于室溫放置2~4h，等血液充分凝結(jié)后，移入4℃冰箱過夜，讓血清析出，次日吸取析出的血清，以4000r/min離心10min，收集血清。5）血清的質(zhì)量要求

A、無細(xì)菌、無支原體、無病毒和內(nèi)毒素

B、肉眼觀察外觀呈淡黃色、澄清透明、較少溶血、無雜質(zhì)

6）血清使用前的處理

A、過濾除菌

B、滅活（56℃30min）

C、針對所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行促細(xì)胞生長效應(yīng)的測定

2、水解乳蛋白

為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸，可用于許多細(xì)胞系和原代細(xì)胞的培養(yǎng)。

3、胚胎浸出液

雞胚浸出液

牛胚浸出液

主要成分為大分子蛋白和小分子氨基酸。（二）合成培養(yǎng)基

1、種類：E-MEM（Eagle氏最低要素營養(yǎng)液）

RPMI-1640

DMEM

199

L-15

主要成份：氨基酸、糖類、無機(jī)鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長因子

氨基酸：精、組、亮、異亮、蛋、賴、苯丙、蘇、色、酪、纈、谷氨酸和谷氨酰胺2、合成培養(yǎng)基的配制：

A、取清洗干凈的大燒杯1個(gè)，加入新鮮制備的三蒸水，加熱至15~30℃。

B、加1袋培養(yǎng)基干粉入水中，并用少量三蒸水涮洗裝培養(yǎng)基的袋，涮洗的水倒入大燒杯中，攪拌使粉劑溶解。

C、按說明書，加入所需量的NaHCO3以及其它可能需添加的成分。D、加水至終量。

E、測定培養(yǎng)液的pH值，并用1mol/LHCl或1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值，一般調(diào)至pH7.0~7.2。

F、用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌。

G、標(biāo)記培養(yǎng)液名稱和配制時(shí)間，置4℃冰箱貯存。生長液：含10%犢牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)液

維持液：含2-5%犢牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)液（三）無血清培養(yǎng)基

優(yōu)點(diǎn)：

A、成分確定

B、可以排除血清中許多未知因素的干擾。缺點(diǎn)：

A、成本高。

B、針對性很強(qiáng)，一種無血清培養(yǎng)基僅適用于某一類細(xì)胞的培養(yǎng)五、細(xì)胞培養(yǎng)

（一）細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求

1、細(xì)胞密度

原代細(xì)胞：4~6×105個(gè)/ml

傳代細(xì)胞：2~3×105個(gè)/ml

2、pH范圍最適pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8

3、培養(yǎng)溫度（二）細(xì)胞培養(yǎng)的方法

1、單層細(xì)胞培養(yǎng)

2、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

3、微載體細(xì)胞培養(yǎng)（三）原代細(xì)胞培養(yǎng)

基本步驟：

切取要培養(yǎng)的動(dòng)物器官或大組織塊

洗去血污

剔除多余成分

將所取組織剪碎

蛋白酶溶液消化機(jī)械方法吹打組織塊

不銹鋼網(wǎng)篩過濾

對濾過液離心

用培養(yǎng)液懸浮成細(xì)胞懸液

計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)密度

用于分離細(xì)胞培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞：

１）在無菌條件下采取9-10日齡雞胚，置滅菌平皿中，除去頭（或僅除去喙和眼）、爪和內(nèi)臟，并剪成塊。

２）用Hanks液充分沖洗后移入平皿中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎塊。３）剪碎后移入大號(hào)青霉素瓶或其它容器中，加入Hanks液，充分沖洗，并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加洗液。如此反復(fù)沖洗2-3遍。

４）于沉淀組織塊內(nèi)加入約4倍量的0.25%胰酶，并調(diào)pH至7.6-7.8，振蕩混勻后置37℃水浴中感作30min，每10min輕輕搖動(dòng)一次。５）取出，小心吸棄上層胰酶溶液，用洗液輕洗2次后，用大口徑吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞游離。

６）用雙層或3層紗布過濾，收集濾液于離心管中，以2000r/min離心沉淀5-10min，吸棄上清液，按每個(gè)雞胚5ml的量，加入營養(yǎng)液，并用吸管反復(fù)吹打，直至形成均勻的細(xì)胞懸液。７）細(xì)胞計(jì)數(shù)（培養(yǎng)時(shí)，使細(xì)胞達(dá)到5×105個(gè)/ml）

按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算4角4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)（N）。

每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)（n）=N/4×10000×K（稀釋倍數(shù)）。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板○表示可計(jì)數(shù)●表示不計(jì)數(shù)

體外細(xì)胞的染色檢測方法：

原理：死活細(xì)胞對染料的不同反應(yīng)而區(qū)分開兩種細(xì)胞。

常用染料：中性紅（活細(xì)胞著色，死細(xì)胞不著色）

結(jié)晶紫（死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色）

臺(tái)盼藍(lán)（死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色）臺(tái)盼藍(lán)排除檢測法：

2%臺(tái)盼藍(lán)溶液的配制：稱取2g臺(tái)盼藍(lán)，加少量雙蒸水研磨粉碎后，再加水至50ml，離心后取上清液，再加入1.8%NaCl溶液至100ml。

活體染色與細(xì)胞計(jì)數(shù)：

將1滴細(xì)胞懸液與2滴臺(tái)盼藍(lán)液混合后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板。

2min后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞。未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞。計(jì)算活細(xì)胞百分比（活細(xì)胞應(yīng)在95%以上）。

8）分裝于細(xì)胞瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。（四）傳代細(xì)胞系培養(yǎng)

1）取長滿單層的細(xì)胞一瓶，傾去培養(yǎng)液。

2）加入1~2ml胰酶消化液，于37℃培養(yǎng)箱放置幾分鐘，至細(xì)胞間出現(xiàn)空隙或細(xì)胞變圓后，倒去消化液。3）加入生長液，反復(fù)吹打幾次，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，然后分裝于3個(gè)小瓶中。再在每個(gè)小瓶中補(bǔ)充生長液至10ml，然后置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)1~2天即可長成單層。（五）細(xì)胞培養(yǎng)物的常溫短期保存

1、實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞短期保存。

①

將已長成單層的細(xì)胞換液后置室溫或20-22℃下避光保存，可達(dá)15天以上。

②

將細(xì)胞培養(yǎng)溫度由37℃降至32℃甚至30℃，可隔15-30天傳代一次。2、長途運(yùn)送細(xì)胞培養(yǎng)物的保存。

取剛長成單層的細(xì)胞培養(yǎng)物，棄去營養(yǎng)液，加入維持液至滿瓶，勿使培養(yǎng)瓶內(nèi)存留空氣，隨后用橡皮塞緊塞瓶口，并作適當(dāng)?shù)陌＿\(yùn)輸途中的溫度應(yīng)保持在15-25℃左右，到達(dá)目的地后，置37℃培養(yǎng)1天，再行傳代。（六）細(xì)胞培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇

1、培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇原理

冷凍保存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。

復(fù)蘇(thawing)：以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程。原理：在低于-70℃的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏貤l件，即可使生命活動(dòng)固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳矬w恢復(fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷(intracellularicedamage)：因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷。

溶質(zhì)損傷(solutedamage)：也稱為溶液損傷(solutiondamage)，由于保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷。1）冷凍保護(hù)劑

滲透性保護(hù)劑：甘油、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇

非滲透性保護(hù)劑：聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白、羥乙基淀粉

作用機(jī)制：減少冰晶損傷和溶質(zhì)損傷。2）冷凍速率

細(xì)胞在凍存過程中的生理變化：當(dāng)細(xì)胞被冷至-5℃左右時(shí)，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低了溶液的冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至-5℃~-15℃之間時(shí)，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)水分為了和細(xì)胞外水分保持化學(xué)能的平衡，會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)。冷凍速度慢：細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰。

冷凍速度快：細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時(shí)間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。

冷凍速度非常快（即超快速冷凍）：細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃化冷凍）。不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同:

1.6℃~3000℃/min

小鼠骨髓干細(xì)胞1.6℃/min

酵母7℃/min

人紅細(xì)胞200℃/min

3）冷凍保存溫度

-196℃可保存10年以上

-70℃可保存1個(gè)月左右

在冰點(diǎn)至-40℃范圍內(nèi)保存細(xì)胞效果不好

4）復(fù)溫速率

在37℃水浴中，于1~min內(nèi)完成復(fù)溫2、冷凍保存方法

按冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶分為：

非玻璃化凍存有冰晶形成

玻璃化凍存無冰晶形成非玻璃化凍存方法

1）待凍存細(xì)胞懸液的準(zhǔn)備

A、按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備成單細(xì)胞懸液。計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。

B、將細(xì)胞懸液800~1000r/min離心5min，棄上清液。C、向沉淀物中加入冷凍液（含10%DMSO、20%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，或含10%DMSO的小牛血清）。輕輕吹吸均勻，使細(xì)胞密度達(dá)到1×106~1×107個(gè)/ml。

D、按每管1~1.5ml的量，分裝于凍存管內(nèi)。擰緊管蓋。

E、在凍存小管上做標(biāo)記，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期，凍存人。2）分級(jí)冷凍的方法

第一種方法：

A、先將凍存小管放入普通冰箱下層（4~8℃），約40min~2h。

B、置于普通冰箱上層冰盒（-10~-20℃），30min~2h。

C、再于-30℃放置30min左右。

D、然后在-70~-80℃下過夜。

E、最后將凍存小管投入液氮保存。第二種方法：

將凍存小管放入電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀內(nèi)，并根據(jù)不同的細(xì)胞以不同的降溫速度連續(xù)降至-100℃以下，再投入液氮保存。

第三種方法：

將凍存小管先懸掛在液氮罐口20min，再直接投入液氮中保存。第四種方法：

用4℃預(yù)冷的冷凍保護(hù)液懸浮細(xì)胞，分裝凍存小管后，將凍存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1cm以上的泡沫塑料小盒內(nèi)封好，再將小盒放置在-70~-80℃冰箱中24h以上至1周；再將凍存小管投入液氮中保存。第五種方法：

將凍細(xì)胞管置于液氮?dú)庀嘀?，?min1cm的速度逐漸往下降，直至液氮中長期保存。

3）記錄

日期、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置、凍存人。4）注意事項(xiàng)

A、DMSO對人體有毒，使用時(shí)不需要高溫。

B、小心液氮凍傷皮膚。

C、凍存前要確保細(xì)胞具有高活力、無微生物污染。

D、在每批細(xì)胞凍存一段時(shí)間后，要復(fù)蘇1~2管，以觀察其活力以及是否受到微生物污染。

E、凍存管最好采用塑料管。3、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

（非玻璃化凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法）

1）復(fù)蘇過程

第一種方法：

A、調(diào)配37~40℃的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)至37~40℃。

B、從液氮中取出凍存小管，立即投入37~40℃溫水中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全融解。最好在1~2min內(nèi)完成復(fù)溫。C、將細(xì)胞凍存懸液移入離心管中，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹勻。

D、將細(xì)胞懸液經(jīng)800~1000r/min離心5min，棄上清液。

E、加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸均勻。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加足生長液進(jìn)行培養(yǎng)。

第二種方法：

A、B同前

C、將融解的細(xì)胞培養(yǎng)物直接轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足生長液，置溫箱中培養(yǎng)，貼壁幾小時(shí)后，再換入新的生長液繼續(xù)培養(yǎng)。（七）培養(yǎng)物的污染

1、微生物污染的判斷

判斷微生物污染的方法：目測、顯微鏡觀察、電鏡檢查、特殊染色鑒定、微生物培養(yǎng)試驗(yàn)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測

1）細(xì)菌的污染及其判斷

培養(yǎng)液混濁、呈現(xiàn)黃綠色、顯微鏡下可見到點(diǎn)狀或桿狀的細(xì)菌2）真菌的污染及其判斷

酵母菌污染：培養(yǎng)液混濁、呈現(xiàn)黃綠色、顯微鏡下可見到圓形或卵圓形的酵母菌。

霉菌污染：顯微鏡下可見到呈絲狀或樹枝狀生長的菌絲。肉眼可見有白色如棉絮狀的絲狀團(tuán)塊漂浮在培養(yǎng)液中。3）支原體的污染及其判斷

在顯微鏡下無特殊的外觀表現(xiàn)，培養(yǎng)基也不混濁。

初步判斷支原體污染的依據(jù)：顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞較多，需頻繁改善營養(yǎng)環(huán)境才能支持長期傳代培養(yǎng)。

檢測方法：DNA熒光染色、PCR、免疫學(xué)方法、支原體培養(yǎng)法A、未受微生物污染B、受細(xì)菌污染C、受酵母污染D、受霉菌污染4）病毒的污染及其判斷

A、引起細(xì)胞病變的病毒的污染

可直接通過顯微鏡觀察

B、不引起細(xì)胞病變的病毒的污染

電子顯微鏡觀察、PCR、免疫學(xué)方法2、污染的預(yù)防

1）培養(yǎng)操作前的準(zhǔn)備

A、定期清洗或更換超凈臺(tái)的空氣濾網(wǎng)，檢查超凈臺(tái)的空氣凈化標(biāo)準(zhǔn)

B、檢查培養(yǎng)器皿是否有消毒標(biāo)志

C、檢查培養(yǎng)液是否無菌

D、操作前提前半小時(shí)啟動(dòng)超凈臺(tái)及其紫外燈

E、操作者應(yīng)先洗手2）培養(yǎng)操作時(shí)的注意事項(xiàng)

A、在超凈工作臺(tái)面放置的所有培養(yǎng)瓶瓶口不能與超凈工作臺(tái)的風(fēng)向相逆。

B、不允許用手觸及器皿的無菌部分。

C、在安裝吸管、開啟或封閉瓶口操作時(shí)要經(jīng)過火焰燒灼，并在火焰附近進(jìn)行。

D、吸取培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液等液體時(shí)，應(yīng)專管專用，以防止污染擴(kuò)大或造成培養(yǎng)物之間的交叉污染。E、使用培養(yǎng)液前，不宜過早開瓶，不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封閉瓶口。

F、培養(yǎng)的細(xì)胞在處理之前勿過早暴露于空氣中

G、操作時(shí)不要交談、咳嗽。

H、操作完畢后應(yīng)整理好工作臺(tái)，用消毒劑抹式工作面，關(guān)閉超凈工作臺(tái)。3、污染的排除

1）抗生素的應(yīng)用

2）巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的方法

A、在良好的體外培養(yǎng)條件下，巨噬細(xì)胞可存活7-10d。

B、分泌一些細(xì)胞生長因子支持其它細(xì)胞的克隆生長。

C、吞噬微生物并將其消化。

3）小鼠皮下/腹腔過繼培養(yǎng)法

主要用于腫瘤細(xì)胞和雜交細(xì)胞中污染的細(xì)菌與支原體的清除。六、病毒在細(xì)胞中的培養(yǎng)

1、病毒（PPV除外）在細(xì)胞中培養(yǎng)的方法

1）選長滿單層的細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液。

2）加入適量的病毒懸液

3）置溫箱中感作（吸附）45min~1h。

4）取出瓶子，倒掉或不倒掉病毒懸液，補(bǔ)足維持液，置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)