第三章生物材料的預(yù)處理和液固分離

回顧第二章的知識(shí)點(diǎn)

一、生化制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

二、微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

三、生物技術(shù)制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

第一節(jié)生物材料的預(yù)處理

一、選擇預(yù)處理方法的依據(jù)1、生物活性物質(zhì)來(lái)源、存在狀態(tài)“胞內(nèi)”、“胞外”

微生物酶—胞外培養(yǎng)液

DNA與電子傳遞系統(tǒng)物質(zhì)（氧化磷酸化的酶系）--線粒體2、后續(xù)工藝要求3、目的物穩(wěn)定性--可被材料中酶、微生物破壞，還可能受酸、堿、鹽、重金屬離子、機(jī)械攪拌、溫度、甚至空氣和光線作用改變活性。第三章生物材料的預(yù)處理和液固分離

防止目的物的失活放在首位二、細(xì)胞培養(yǎng)液的預(yù)處理

（一）雜蛋白質(zhì)的去除1、凝聚作用---在某些電解質(zhì)作用下，使擴(kuò)散雙電層的排斥電位（即ζ電位）降低，破壞膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，而使膠體粒聚集的過(guò)程.

原理：在發(fā)酵液中加入具有相反電性的電解質(zhì)：①中和膠粒電性，降低雙電層排斥力.②離子的水化作用，破壞膠粒的水化層.

離子對(duì)帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力的次序:

Al3+＞Fe2+

＞H1+

＞Ca2+

＞Mg2+

＞K1+

＞Na1+

＞Li1+

常用的凝聚劑：Al2(SO4)3.18H2O(明礬）

AlCl3.6H2O，F(xiàn)eCl3.ZnSO4，MgCO3.。

。

2、絮凝作用

指在某些高分子絮凝劑存在下，在懸浮粒子之間產(chǎn)生架橋作用而使膠粒粗大絮凝團(tuán)的過(guò)程。

絮凝劑是天然的或人工合成的有機(jī)高分子化合物，具有長(zhǎng)鏈線狀的結(jié)構(gòu)，易溶于水，其分子量可高達(dá)數(shù)萬(wàn)至一千萬(wàn)以上，在長(zhǎng)的鏈上含有相當(dāng)多的活性功能團(tuán).如：殼聚糖、海藻酸鈉、明膠及酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物和聚丙烯酸類等。

影響絮凝效果的因素主要有：（1）絮凝劑的分子量（2）絮凝劑的用量（3）溶液pH值（4）攪拌速度和時(shí)間3、變性沉淀—加熱紫外有機(jī)溶劑等4、等電點(diǎn)沉淀

5、加各種沉淀劑沉淀---三氯乙酸鹽各種金屬(Ag+Cu2+Zn2+)等6、吸附---例如四環(huán)素發(fā)酵液中加入黃血鹽和硫酸鋅，生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀，能將雜蛋白質(zhì)和菌體等黏附在其中而除去.（二）、多糖的去除

可用酶轉(zhuǎn)化為單糖黏多糖可與一些陽(yáng)離子表面活性劑如十六烷基溴化銨（CTAB）生成沉淀去除。（三）、高價(jià)金屬離子的去除

1、離子交換法2、沉淀法Ca2+-------草酸

Mg2+---------磷酸鹽Fe3+----------黃血鹽第二節(jié)細(xì)胞破碎

動(dòng)植物和微生物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差別很大動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，只有細(xì)胞膜，易于破碎植物和微生物細(xì)胞具有堅(jiān)固的細(xì)胞壁，破碎困難一、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破碎細(xì)胞的目的--使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，

釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物。。為何進(jìn)行細(xì)胞破碎？二、動(dòng)物材料的預(yù)處理動(dòng)物細(xì)胞因沒(méi)有細(xì)胞壁容易破碎。動(dòng)物組織勻漿的一般步驟是：先將動(dòng)物組織切成碎塊，懸在冰冷的勻漿緩沖液中，在搗碎機(jī)中研磨。三、細(xì)胞的破碎技術(shù)（一）機(jī)械法1、高壓勻漿器由高壓泵和勻漿閥組成，主要利用液相剪切力與固定表面撞擊所產(chǎn)生的應(yīng)力，使細(xì)胞破碎。蛋白質(zhì)變性問(wèn)題2、珠磨法微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑（通常是d<1mm的無(wú)鉛玻璃珠）在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間及珠子與細(xì)胞之間相互剪切、碰撞，促使細(xì)胞壁破裂，釋出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，槳液流出，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。

高壓勻漿和高速珠磨法比較指標(biāo)高壓勻漿法高速珠磨法操作參數(shù)少多操作次數(shù)多次一次冷卻用換熱器級(jí)間冷卻珠磨機(jī)兼有冷卻作用應(yīng)用范圍絲狀真菌和小革蘭氏陽(yáng)性菌除外所有微生物料液損傷小大

3、超聲波破碎

超聲波破碎法利用發(fā)射聲頻高于15—25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液進(jìn)行細(xì)胞破碎.可能機(jī)理：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。（二）、非機(jī)械法

1、干燥法空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥

2、物理法1）滲透壓沖擊法---先把細(xì)胞放在高滲溶液中，細(xì)胞發(fā)生收縮，然后將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，細(xì)胞快速膨脹，使產(chǎn)物釋放至溶液2）凍結(jié)—融化法3）微波加熱3、化學(xué)法（1）作用機(jī)理通過(guò)改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來(lái)，這種處理方法稱為滲透法。（2）常用的化學(xué)試劑有機(jī)溶劑（如苯，甲苯）、抗生素、表面活性（SDS、TritonX-100)、金屬螯合劑（EDTA)、變性劑（鹽酸胍、脲）等。

(3)丙酮法保存化學(xué)滲透法的優(yōu)缺點(diǎn)：（與機(jī)械法比較）1)優(yōu)點(diǎn)：①對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性.②細(xì)胞外形保持完整，碎片少，有利于后分離.③核酸釋出量少，漿液粘度低，便于進(jìn)一步提取.2）缺點(diǎn)：①時(shí)間長(zhǎng)，效率低.②化學(xué)試劑具有毒性,進(jìn)一步分離時(shí)需要用透析法除去.③通用性差,某種試劑只用于某些特定類型的細(xì)胞.物理法和化學(xué)法的比較物理破碎法缺點(diǎn)：A、高能、高溫、高噪音、高剪切力(四高)，易使產(chǎn)品變性失活；B、非專一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難；C、細(xì)胞碎片大小不一，難分離.

化學(xué)破碎法缺點(diǎn)：A、費(fèi)用高.B、引起新的污染，尤其是其他化學(xué)方法.C、一般只有有限的破碎，常需與其他物理法連用.4、酶溶法—生物法利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁消化溶解，受到部分或完全破壞的方法。

通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、pH或添加有機(jī)溶劑，誘使細(xì)胞產(chǎn)生溶解自身的酶的方法也是一種酶溶法，稱為自溶。溶菌酶:它是一個(gè)小分子酶，能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的糖鏈，從而破壞其完整結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌裂解死亡。

酶溶法處理細(xì)胞存在的問(wèn)題：

①存在酶產(chǎn)物的抑制問(wèn)題，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放率降低。②酶價(jià)高，限制了大規(guī)模應(yīng)用。目前僅用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。③通用性差，不同的菌株用不同的酶。（三）、選擇破碎方法的依據(jù)

1、規(guī)模及成本2、目的物的穩(wěn)定性3、破碎效果和產(chǎn)物釋放率4、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機(jī)械法破碎5、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法6、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機(jī)械法結(jié)合的方法破碎率的測(cè)定（1）直接測(cè)定法：利用適當(dāng)?shù)姆椒?，記?shù)破碎前后的細(xì)胞數(shù)即可直接計(jì)算破碎率（顯微鏡、染色）（2）目的產(chǎn)物測(cè)定法：測(cè)定破碎液中目的產(chǎn)物的釋放量來(lái)估算破碎率（比如蛋白的含量或活性）（3）導(dǎo)電率測(cè)定法（測(cè)定破碎前后導(dǎo)電率的變化，導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線性增加）第三節(jié)液-固分離(過(guò)濾）一、過(guò)濾方式

1、常規(guī)過(guò)濾

溶劑和小于膜孔的溶質(zhì)在壓力的驅(qū)動(dòng)下透過(guò)膜，大于膜孔的顆粒被截留，通常堆積在膜面上.但是,隨著時(shí)間的增加，膜面上堆積的顆粒也在增加，過(guò)濾阻力增大，膜滲透速率下降。因此必須周期性的停下來(lái)清洗膜表面的污染層，或者更換膜.操作簡(jiǎn)單，適于小規(guī)模場(chǎng)合.

2、錯(cuò)流過(guò)濾

在泵的推動(dòng)下料液平行于膜面流動(dòng)，與死端過(guò)濾不同的是料液流經(jīng)膜面時(shí)產(chǎn)生的剪切力把膜面上滯留的顆粒帶走，從而使污染層保持在一個(gè)較薄的水平.

二、過(guò)濾設(shè)備

1、板框過(guò)濾機(jī)(間隙操作)是由濾板、濾框（板框式）排列構(gòu)成濾室，在輸料泵的壓力作用下，將料液送進(jìn)各濾室，通過(guò)過(guò)濾介質(zhì)，將固體和液體分離.廣泛應(yīng)用于化工、染料、石油、陶瓷、制藥、制糖、食品、淀粉及各行業(yè)的污水處理等.

2、真空式連續(xù)過(guò)濾機(jī)(連續(xù)式):

以過(guò)濾布或?yàn)V網(wǎng)為介質(zhì)，使料漿水平布置于過(guò)濾介質(zhì)之上，充分利用料漿重力和真空吸力實(shí)現(xiàn)固液分離。連續(xù)水平真空帶式過(guò)濾機(jī)可適用于多種濃度條件下的物料，過(guò)濾效高.

特點(diǎn)：喂料、過(guò)濾、洗滌、脫渣、濾布再生可連續(xù)自動(dòng)完成，自動(dòng)化程度高三、過(guò)濾介質(zhì)和助濾劑1、過(guò)濾介質(zhì)：濾布或膜2、助濾劑：要求為惰性物質(zhì)、無(wú)毒、有一定細(xì)毒及硬度，成本低廉。

常用有：硅藻土、紙漿、石棉、纖維素等第四節(jié)沉淀一、鹽析1.定義：是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過(guò)向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、較少變性缺點(diǎn)：分辨率不高，要除鹽兩種現(xiàn)象：鹽溶：低鹽情況，鹽離子強(qiáng)度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大.鹽析：高鹽，鹽離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)溶解度減小.2.鹽析原理：（1）形成離子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來(lái)。（2）中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，使其沉淀。3、影響鹽析的因素（1）無(wú)機(jī)鹽的種類鹽析能力：半徑小的高價(jià)離子在鹽析時(shí)的作用較強(qiáng)，陰離子的鹽析效果比陽(yáng)離子好，尤其以高價(jià)陰離子更為明顯。PO43-＞SO42―＞CH3COO―＞Cl―＞NO3―＞I―NH4+＞K+＞Na+＞Li+

常用：硫酸銨

（2）溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類的影響（3）蛋白質(zhì)濃度的影響蛋白質(zhì)濃度提高，鹽用量減少。（4）溫度的影響在無(wú)鹽或稀鹽溶液中，大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度是隨溫度升高而增大的，但在高鹽溶液中常相反。（5）pH的影響當(dāng)溶液的pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近時(shí)，可以分級(jí)沉淀蛋白質(zhì).

4、鹽析操作（1）鹽析用鹽的濃度表示固體粉末、硫酸銨飽和溶液常用“飽和度”來(lái)表征硫酸銨在溶液中的最終濃度，25℃時(shí)(NH4)2SO4的飽和濃度為4.1mol／L,767g/L，定義它為100%飽和度.（2）鹽析方法和注意事項(xiàng)分級(jí)鹽析法重復(fù)鹽析法反抽提法：一定的鹽濃度下將目的蛋白夾帶一定量的雜蛋白一同沉淀，將沉淀用較低濃度鹽溶液平衡，溶出其中的雜蛋白.

注意事項(xiàng)：“局部過(guò)濃”溫度（室溫）分離方法反抽提法(RNA聚合酶)二.有機(jī)溶劑沉淀法1.定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。2.基本原理：（1）降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。（2）水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。

優(yōu)點(diǎn)：乙醇等有機(jī)溶劑易除去，產(chǎn)品更純凈；密度差較大，離心收集。缺點(diǎn)：容易使蛋白質(zhì)變性，操作常需低溫，成本高，需防火防爆.三、等電點(diǎn)沉淀法

蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀。與鹽析法結(jié)合用。例如味精生產(chǎn)，利用等電點(diǎn)(PH3.22)沉淀法提取谷氨酸.胰島素純化：

胰島素的粗提物

pH8

除去堿性雜蛋白

pH3除去酸性雜蛋白四.生物堿試劑和某些酸類沉淀法當(dāng)溶液PH<PI時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷→易與生物堿酸根負(fù)離子反應(yīng)→沉淀

例如：?jiǎn)螌幩?、苦味酸、鎢酸。

用途：臨床可用于檢驗(yàn)?zāi)蛑械鞍踪|(zhì)。五、重金屬鹽沉淀法當(dāng)溶液PH>PI，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，易與重金屬離子－→生成沉淀

Ca2+-------草酸成鹽

Mg2+-------三聚磷酸鹽

Fe2+--------黃血鹽用途：搶救誤服重金屬鹽的病人六、高分子聚合物沉淀

水溶性非離子型高分子聚合物，如不同分子量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯等，能使蛋白質(zhì)水合作用減弱而發(fā)生沉淀。七、表面活性劑

十六烷基三甲基季胺溴化物（CTAB）十六烷基氯化吡啶（CPC）第五節(jié)結(jié)晶技術(shù)(crystallization)1、結(jié)晶：

溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體，晶體的化學(xué)成分均一，具有各種對(duì)稱的晶體，其特征為離子和分子在空間晶格的結(jié)點(diǎn)上呈規(guī)則的排列。

固體有結(jié)晶和無(wú)定形兩種狀態(tài)(1)結(jié)晶：析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時(shí)間進(jìn)行排列，粒子排列有規(guī)則。(2)無(wú)定形固體：析出速度快，粒子排列無(wú)規(guī)則.2、結(jié)晶操作的特點(diǎn)(1)只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過(guò)程有良好的選擇性。(2)通過(guò)結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會(huì)留在母液中，再通過(guò)過(guò)濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。(3)結(jié)晶過(guò)程具有成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。結(jié)晶過(guò)程的實(shí)質(zhì)(1)結(jié)晶是指溶質(zhì)自動(dòng)從過(guò)飽和溶液中析出，形成新相的過(guò)程。(2)這一過(guò)程不僅包括溶質(zhì)分子凝聚成固體，還包括這些分子有規(guī)律地排列在一定晶格中，這一過(guò)程與表面分子化學(xué)鍵力變化有關(guān)；(3)因此，結(jié)晶過(guò)程是一個(gè)表面化學(xué)反應(yīng)過(guò)程。3、結(jié)晶過(guò)程分析穩(wěn)定區(qū)和亞穩(wěn)定區(qū)在溫度-溶解度關(guān)系圖中，SS曲線下方為穩(wěn)定區(qū)，在該區(qū)域任意一點(diǎn)溶液均是穩(wěn)定的；而在SS曲線和TT曲線之間的區(qū)域?yàn)閬喎€(wěn)定區(qū)，此刻如不采取一定的手段（如加入晶核），溶液可長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定；加入晶核后，溶質(zhì)在晶核周圍聚集、排列，溶質(zhì)濃度降低，并降至SS線；介于飽和溶解度曲線和過(guò)飽和溶解度曲線之間的區(qū)域，可以進(jìn)一步劃分刺激結(jié)晶區(qū)和養(yǎng)晶區(qū)不穩(wěn)定區(qū)在TT曲線的上半部的區(qū)域稱為不穩(wěn)定區(qū)，在該區(qū)域任意一點(diǎn)溶液均能自發(fā)形成結(jié)晶，溶液中溶質(zhì)濃度迅速降低至SS線（飽和）；晶體生長(zhǎng)速度快，晶體尚未長(zhǎng)大，溶質(zhì)濃度便降至飽和溶解度，此時(shí)已形成大量的細(xì)小結(jié)晶，晶體質(zhì)量差；因此，工業(yè)生產(chǎn)中通常采用加入晶種，并將溶質(zhì)濃度控制在養(yǎng)晶區(qū)，以利于大而整齊的晶體形成。過(guò)飽和溶液的形成

(1)、蒸發(fā)法---(小分子化合物)(2)、溫度誘導(dǎo)法熱盒技術(shù)(3)、鹽析結(jié)晶法結(jié)晶包括三個(gè)過(guò)程：(1)形成過(guò)飽和溶液;溶液達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)是結(jié)晶的前提；過(guò)飽和度是結(jié)晶的推動(dòng)力。(2)晶核形成;(3)晶體生長(zhǎng)。(4)、透析結(jié)晶法(5)、等電點(diǎn)法(6)、化學(xué)反應(yīng)結(jié)晶法調(diào)節(jié)溶液的pH或向溶液中加入反應(yīng)劑，生成新物質(zhì)，結(jié)晶析出。

晶體的形成(1)形成新相（固體）需要一定的表面自由能。因此，溶液濃度達(dá)到飽和溶解度時(shí)，晶體尚不能析出，只有當(dāng)溶質(zhì)濃度超過(guò)飽和溶解度后，才可能有晶體析出。(2)首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核具有較大的溶解度。實(shí)質(zhì)上，在飽和溶液中，晶核是處于一種形成—溶解—再形成的動(dòng)態(tài)平衡之中，只有達(dá)到一定的過(guò)飽和度以后，晶核才能夠穩(wěn)定存在。凱爾文（Kelvin）公式C2---小晶體的溶解度；

C1---普通晶體的溶解度σ---晶體與溶液間的表面張力；ρ---晶體密度γ2---小晶體的半徑；

γ1---普通晶體半徑

R---氣體常數(shù)； T---絕對(duì)溫度晶體生長(zhǎng)在過(guò)飽和溶液中已有晶核形成或加入晶種后，以過(guò)飽和度為推動(dòng)力，晶核或晶種將長(zhǎng)大，這種現(xiàn)象稱為晶體生長(zhǎng)。影響晶體生長(zhǎng)速度的因素：(1)雜質(zhì)：改變晶體和溶液之間界面的滯留層特性，影響溶質(zhì)長(zhǎng)入晶體、改變晶體外形、因雜質(zhì)吸附導(dǎo)致的晶體生長(zhǎng)緩慢；(2)攪拌：加速晶體生長(zhǎng)、加速晶核的生成；(3)溫度：促進(jìn)表面化學(xué)反應(yīng)速度的提高，增加結(jié)晶速度；提高晶體質(zhì)量的方法晶體質(zhì)量包括三個(gè)方面的內(nèi)容： 晶體大小、形狀和純度(1)影響晶體大小的因素： 溫度、晶核質(zhì)量、攪拌等(2)影響晶體形狀的因素： 改變過(guò)飽和度、改變?nèi)軇w系、雜質(zhì)(3)影響晶體純度的因素：母液中的雜質(zhì)、結(jié)晶速度、晶體粒度及粒度分布重結(jié)晶：經(jīng)過(guò)一次粗結(jié)晶后，得到的晶體通常會(huì)含有一定量的雜質(zhì)。此時(shí)工業(yè)上常常需要采用重結(jié)晶的方式進(jìn)行精