第十一章熒光分析方法

第十一章熒光分析方法1

有些物質(zhì)受到光照射時，除吸收某種波長的光之外還會發(fā)射出比原來所吸收光的波長更長的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。最常見的光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光。熒光是物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)時發(fā)射出的光。熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度進行物質(zhì)鑒定和含量測定的方法。23熒光分析法的特點（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級檢測下限：0.1～0.1μg/cm-3（2）選擇性強既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少缺點：應(yīng)用范圍小。3第一節(jié)熒光分析法的基本原理

一、分子熒光

（一）分子熒光的產(chǎn)生

1.分子的電子能級與激發(fā)過程在基態(tài)時，分子中的電子成對地填充在能量最低的各軌道中。根據(jù)Pauli不相容原理，一個給定軌道中的兩個電子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子數(shù)分別為1／2和-1／2；其總自旋量子數(shù)s等于0，即基態(tài)沒有凈自旋。

4

電子能級的多重性可用M＝2s+1表示，當(dāng)s＝0時，分子的多重性M＝1，此時分子所處的電子能態(tài)稱為單重態(tài)，用符號S表示。當(dāng)s＝1時，分子的多重性M＝3，此時分子所處的電子能態(tài)稱為三重態(tài)。用符號T表示。

當(dāng)基態(tài)的一個電子吸收光輻射被激發(fā)而躍遷至較高的電子能態(tài)時，通常電子不發(fā)生自旋方向的改變，即兩個電子的自旋方向仍相反，總自旋量子數(shù)s仍等于0，這時分子處于激發(fā)單重態(tài)(2s+1＝1)。

S0+hν→S15

在某些情況下，電子在躍遷過程中還伴隨著自旋方向的改變，這時分子的兩個電子的自旋方向相同，自旋量子數(shù)都為1／2，總自旋量子數(shù)s等于1，這時分子處于激發(fā)三重態(tài)(2s+1＝3)。S0+hν→T167激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的區(qū)別：激發(fā)單重態(tài)分子是抗磁性分子，激發(fā)三重態(tài)分子是順磁性分子；激發(fā)單重態(tài)的平均壽命大約10-8s，激發(fā)三重態(tài)的平均壽命大約10-4~1s；電子由S0→S1，S2等的躍遷較容易，屬于允許躍遷。電子由S0→T1，T2等的躍遷較難發(fā)生，屬于禁阻躍遷。激發(fā)三重態(tài)比激發(fā)單重態(tài)能級稍低一些。7

2.熒光的產(chǎn)生分子的去激發(fā)：分子中處于激發(fā)態(tài)的電子以輻射（發(fā)光）躍遷方式或無輻射躍遷方式回到基態(tài)。輻射躍遷：熒光或磷光無輻射躍遷：振動馳豫、內(nèi)轉(zhuǎn)移、體系間跨越、外轉(zhuǎn)移。8（1）無輻射躍遷：①振動弛豫(vibrationrelexation):處于激發(fā)態(tài)各振動能級的分子通過與溶劑分子的碰撞而將部分振動能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級的過程。

振動弛豫過程很快，約10-12~10-14s

在其他去激發(fā)過程發(fā)生之前，電子已首先完成了由較高能級躍遷至同一電子能級的最低振動能級的振動弛豫過程。9②內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（內(nèi)轉(zhuǎn)換internalconversion）是當(dāng)兩個電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動能級有重疊時，受激分子常由高電子能級以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級的過程。③外部能量轉(zhuǎn)換（外轉(zhuǎn)換externalconversion）是溶液中的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或與其他溶質(zhì)分子之間相互碰撞而失去能量，并以熱能的形式釋放能量的過程。外轉(zhuǎn)換常發(fā)生在第一激發(fā)單重態(tài)或激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中。外轉(zhuǎn)換會降低熒光強度。

10④體系間跨越(intersystemcrossing)：是處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過程。

如S1→T1，S1上的受激電子發(fā)生自旋方向變化而變成T1，即可通過自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無輻射躍遷。如果兩個電子能級態(tài)（如S1與T1)的振動能級相重疊，則發(fā)生體系間跨越的幾率將增大。體系間跨越常見于含有重原子（如碘、溴等）的有機分子。11（2）輻射躍遷①熒光發(fā)射：分子最初處于激發(fā)單重態(tài)，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換及振動弛豫，均可返回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，然后再以輻射形式發(fā)射光量子而返回至基態(tài)的任一振動能級上，這時發(fā)射的光量子稱為熒光。

S1→S0+hνF

熒光發(fā)射的時間10-9~10-7s

熒光波長大于激發(fā)波長（Stokes效應(yīng)）12②磷光(phosphorescence)發(fā)射：經(jīng)過體系間跨越的分子再通過振動弛豫降至激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級，分子在激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級可以存活一段時間，然后返回至基態(tài)的各個振動能級而發(fā)出光輻射，這種光輻射稱為磷光。

T1→S0+hνp

磷光發(fā)射時間較長，約10-4-10s。激發(fā)光停止后，磷光可持續(xù)一段時間。電子由S0→T1為禁阻躍遷，需由S1經(jīng)過體系間跨越轉(zhuǎn)化為T1。同一分子的S1→S0

比T1→S0

的能級差大，磷光的波長比熒光波長長1314S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量λ

2λ1λ

3

外轉(zhuǎn)換λ

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫分子內(nèi)的光物理過程1415熒光與磷光的不同點：躍遷時重度不同。熒光：S1→S0重度未變。磷光：T1→S0重度改變。輻射強度不同。熒光：強度較大，因從S0→S1是自旋允許的，處于S1，S2態(tài)電子多，因而熒光亦強。磷光：很弱，因為S0→T1是自旋禁阻的，處于T1態(tài)電子少。壽命不同。熒光：10-9~10-7s，壽命短。磷光：10-4~100s，壽命稍長。15（二）熒光的激發(fā)光譜和熒光光譜1.激發(fā)光譜激發(fā)光譜表示不同激發(fā)波長的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對效率。繪制激發(fā)光譜曲線時，固定發(fā)射單色器在某一波長，通過激發(fā)單色器掃描，以不同波長的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，記靈熒光強度(F)對激發(fā)波長(λex)的關(guān)系曲線，即激發(fā)光譜，其形狀與吸收光譜極為相似。162.熒光光譜：熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對強度。繪制發(fā)射光譜時，使激發(fā)光的波長和強度保持不變，通過發(fā)射單色器掃描以檢測各種波長下相應(yīng)的熒光強度，記錄熒光強度(F)對發(fā)射波長(λem)的關(guān)系曲線，即熒光光譜。

激發(fā)光譜和熒光光譜可用來鑒別熒光物質(zhì)，而且是選擇測定波長的依據(jù)。1718溶液熒光光譜通常具有如下特征：（1）斯托克斯位移熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)光波長的現(xiàn)象。原因：①激發(fā)態(tài)分子通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫過程而迅速到達第一激發(fā)單重態(tài)s1*的最低振動能級；②熒光發(fā)射可能使激發(fā)態(tài)分子返回到基態(tài)的各個不同振動能級．然后進一步損失能量；③激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子的相互作用。19（2）熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)（3）熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系20二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率

1．熒光壽命(fluorescencelifetime)：當(dāng)除去激發(fā)光源后，分子的熒光強度降低到最大熒光強度的l／e所需的時間，常用τ表示。當(dāng)熒光物質(zhì)受到一個及其短暫的光脈沖激發(fā)后，它從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的變化可用指數(shù)衰減定律表示：F0和Ft分別是在激發(fā)時t＝0和激發(fā)后時間t時的熒光強度，K是衰減常數(shù)。21假定在時間t＝τf時測得的Ft為F0的1/e，即Ft＝(1／e)F0，則：

如果以1nF0/Ft對t作圖，直線斜率即為1/τf，此可計算熒光壽命。利用分子熒光壽命的差別，可以進行熒光物質(zhì)混合物的分析。222．熒光效率(fluorescenceefficiency)又稱熒光量子產(chǎn)率(fluorescencequantumyield)

激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的光子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)之比，常用φf表示；23（二）有機化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系

能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)同時具備兩個條件：即有強的紫外—可見吸收和一定的熒光效率。

1．長共扼結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)、因為芳香環(huán)和雜環(huán)分子具有長共軛的π—π*躍遷。π電子共軛程度越大，熒光強度(熒光效率)越大，而熒光波長也長移。242．分子的剛性

在同樣的長共軛分子中，分子的剛性越強，熒光效率越大，熒光波長產(chǎn)生越長。芴（φf=1.0）聯(lián)苯（φf=0.2）2，2’-二羥基偶氮苯（無熒光）配合物（熒光）253．

取代基：a增加分子的π電子共軛程度，常使熒光效率提高，熒光波長長移．如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-CN、-NR2等；常為給電子取代基b減弱分子的π電子共軛程度，使熒光減弱甚至熄滅，如-COOH、

-NO2

、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-X等；常為吸收電子取代基c對π電子共軛體系作用較小，如：-R、-SO3H、-NH3+等，對熒光的影響也不明顯。26（三）熒光試劑為了提高測定的靈敏度和選據(jù)性，常使弱熒光物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強熒光性產(chǎn)物，擴大熒光分析法的應(yīng)用范圍。

1．熒光胺能與脂肪族和芳香族伯胺形成高度熒光衍生物。

2．鄰苯二甲醛(OPA)與伯胺類、特別是半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的α-氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。

3．1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘能與伯、仲胺及酚基的生物堿反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物

4．測定無機離子的熒光試劑27

三、影響熒光強度的外部因素

1.溫度：在一般情況下，隨著溫度的升高，溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率和熒光強度將降低。

2.溶劑：一般情況下，溶劑極性增加，熒光波長發(fā)生紅移，熒光強度增加。溶劑粘度降低，降低分子的熒光強度。28

3.酸度：具酸或堿性基團的有機物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變；pH<2無熒光pH=7~12藍色熒光pH>13無熒光對無機熒光物質(zhì)，因pH值會影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強度發(fā)生改變。29

4．熒光熄滅劑熒光熄滅又稱熒光淬滅指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。熒光熄滅劑引起熒光熄滅的物質(zhì)鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、碳基和羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。30熒光熄滅的原因：①熒光物質(zhì)的分子和熄滅劑分子碰撞而損失能量；②熒光物質(zhì)的分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配位化合物；③溶解氧的存在，使熒光物質(zhì)氧化，或是由于氧分子的順磁性，促進了體系間跨越，使激發(fā)單重態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三重態(tài)；④濃度較大(超過1g/L)時，還發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。31

5．散射光當(dāng)一束平行單色光照射在液體樣品上時，大部分光線透過溶液，小部分由于光子與物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運功方向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱為散射光。光子和物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞時，發(fā)生能量的交換，僅僅是光子運動方向發(fā)生改變，這種散射光稱為瑞利光。其波長與入射光波長相同。32光子和物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時．在光子運動方向發(fā)生改變的同時，光子與物質(zhì)分子發(fā)生能量的交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量，而發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光，這種散射光稱為拉曼光。散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光。選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長可消除拉曼光的干擾。33第二節(jié)熒光定量分析方法一、熒光強度與物質(zhì)濃度的關(guān)系熒光強度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強度34二、定量方法

1.工作曲線（校正曲線)法：用一定量的對照品配制成濃度不同的對照品系列溶液（標(biāo)準系列溶液），測得對照品系列溶液的熒光強度，繪制熒光強度F對濃度c的標(biāo)準曲線。然后，測量同樣條件供試品溶液的熒光強度，對照標(biāo)準曲線求出供試品溶液的濃度。35

2．比例法如果熒光分析的校正曲線通過原點，就可選擇其線性范圍，用比例法進行測定。取已知量的對照品，配置一對照品溶液（CS），使其濃度在線性范圍之內(nèi)，測定熒光強度（FS），然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強度（Fx）。按比例關(guān)系計算試樣中熒光物質(zhì)的含量（Cx）。在空白溶液的熒光強度不能調(diào)到o時．必須從FS及FX值中扣除空白溶液的熒光強度（F0）．然后進行計算。36

3．聯(lián)立方程式法此法用于多組分混合物的熒光分析。如果混合物中各組分熒光峰相距較遠，而且相互之間無顯著干擾，則可分別在不同波長處測定各個組分的熒光強度，從而直接求出各個組分的濃度。如果各個組分的熒光光譜相互重疊，可利用熒光強度的加和性質(zhì)，在適宜的熒光波長處，測定混合物的熒光強度，再根據(jù)各組分在該熒光波長處的熒光強度，列出聯(lián)立方程式，分別求出它們各自的含量。3738三、熒光分析條件的選擇1.選擇線性范圍熒光物質(zhì)濃度較低時，熒光強度與物質(zhì)濃度才呈線性關(guān)系，應(yīng)通過一定條件下的標(biāo)準曲線確定方法的線性范圍。高濃度時，由于熒光自熄滅和自吸收等原因，使熒光強度與濃度呈非線性關(guān)系。分析時應(yīng)在線性范圍內(nèi)進行，否則會產(chǎn)生誤差。38392.激發(fā)光波長λex

由激發(fā)光譜選擇能產(chǎn)生最強熒光的激發(fā)光波長，即最大激發(fā)波長，作為分析用的激發(fā)光波長，以λex表示。3.熒光波長λem

分析時，應(yīng)根據(jù)熒光光譜選擇最強熒光的波長作為熒光測定波長，以λem表示。39404.散射光干擾的排除散射光包括瑞利散射光和拉曼散射光。瑞利散射光的波長與激發(fā)光波長相同；拉曼散射光的波長一般情況下比激發(fā)波長要長，有時靠近熒光波長。消除方法：①選擇適宜的激發(fā)波長；②選擇合適溶劑。40415.溶劑的選擇對于π-π*共軛的熒光物質(zhì)，宜用極性溶劑。對于n-π*共軛的熒光物質(zhì)（π電子體系上連有-OH、-COOH、-NH2等），宜用非極性溶劑。6.pH值的選擇7.消除熒光猝滅物質(zhì)干擾41第三節(jié)熒光分光光度計一熒光分光光度計

用于測量熒光強度的儀器分類：

⒈濾光片熒光計不能測定光譜，可用于定量分析。

⒉濾光片-單色器熒光計不能測定激發(fā)光譜，可測定熒光光譜。

⒊熒光分光光度計可測量某一波長處的熒光強度，還可繪制激發(fā)光譜和熒光光譜。42431）光源：氙燈：波長250~700nm。宜連續(xù)使用，避免頻繁啟動。低壓汞燈：線狀光譜，主要能量集中在紫外光區(qū)，其常用譜線為253.7nm，常用它進行單色器的波長校正。高壓汞燈：常用譜線為365.0nm。2）單色器：用光柵制成3）樣品池：石英（低熒光材料）4）檢測器：光電倍增管為減少激發(fā)光的雜散光干擾，檢測器與激發(fā)光方向垂直放置。44二、其他熒光分析技術(shù)簡介激光誘導(dǎo)熒