第十一章熒光分析方法

第十一章熒光分析方法1

有些物質(zhì)受到光照射時(shí)，除吸收某種波長(zhǎng)的光之外還會(huì)發(fā)射出比原來(lái)所吸收光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。最常見的光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光。熒光是物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法。23熒光分析法的特點(diǎn)（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)檢測(cè)下限：0.1～0.1μg/cm-3（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。3第一節(jié)熒光分析法的基本原理

一、分子熒光

（一）分子熒光的產(chǎn)生

1.分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程在基態(tài)時(shí)，分子中的電子成對(duì)地填充在能量最低的各軌道中。根據(jù)Pauli不相容原理，一個(gè)給定軌道中的兩個(gè)電子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子數(shù)分別為1／2和-1／2；其總自旋量子數(shù)s等于0，即基態(tài)沒(méi)有凈自旋。

4

電子能級(jí)的多重性可用M＝2s+1表示，當(dāng)s＝0時(shí)，分子的多重性M＝1，此時(shí)分子所處的電子能態(tài)稱為單重態(tài)，用符號(hào)S表示。當(dāng)s＝1時(shí)，分子的多重性M＝3，此時(shí)分子所處的電子能態(tài)稱為三重態(tài)。用符號(hào)T表示。

當(dāng)基態(tài)的一個(gè)電子吸收光輻射被激發(fā)而躍遷至較高的電子能態(tài)時(shí)，通常電子不發(fā)生自旋方向的改變，即兩個(gè)電子的自旋方向仍相反，總自旋量子數(shù)s仍等于0，這時(shí)分子處于激發(fā)單重態(tài)(2s+1＝1)。

S0+hν→S15

在某些情況下，電子在躍遷過(guò)程中還伴隨著自旋方向的改變，這時(shí)分子的兩個(gè)電子的自旋方向相同，自旋量子數(shù)都為1／2，總自旋量子數(shù)s等于1，這時(shí)分子處于激發(fā)三重態(tài)(2s+1＝3)。S0+hν→T167激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的區(qū)別：激發(fā)單重態(tài)分子是抗磁性分子，激發(fā)三重態(tài)分子是順磁性分子；激發(fā)單重態(tài)的平均壽命大約10-8s，激發(fā)三重態(tài)的平均壽命大約10-4~1s；電子由S0→S1，S2等的躍遷較容易，屬于允許躍遷。電子由S0→T1，T2等的躍遷較難發(fā)生，屬于禁阻躍遷。激發(fā)三重態(tài)比激發(fā)單重態(tài)能級(jí)稍低一些。7

2.熒光的產(chǎn)生分子的去激發(fā)：分子中處于激發(fā)態(tài)的電子以輻射（發(fā)光）躍遷方式或無(wú)輻射躍遷方式回到基態(tài)。輻射躍遷：熒光或磷光無(wú)輻射躍遷：振動(dòng)馳豫、內(nèi)轉(zhuǎn)移、體系間跨越、外轉(zhuǎn)移。8（1）無(wú)輻射躍遷：①振動(dòng)弛豫(vibrationrelexation):處于激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的分子通過(guò)與溶劑分子的碰撞而將部分振動(dòng)能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程。

振動(dòng)弛豫過(guò)程很快，約10-12~10-14s

在其他去激發(fā)過(guò)程發(fā)生之前，電子已首先完成了由較高能級(jí)躍遷至同一電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)的振動(dòng)弛豫過(guò)程。9②內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（內(nèi)轉(zhuǎn)換internalconversion）是當(dāng)兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，受激分子常由高電子能級(jí)以無(wú)輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)的過(guò)程。③外部能量轉(zhuǎn)換（外轉(zhuǎn)換externalconversion）是溶液中的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或與其他溶質(zhì)分子之間相互碰撞而失去能量，并以熱能的形式釋放能量的過(guò)程。外轉(zhuǎn)換常發(fā)生在第一激發(fā)單重態(tài)或激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程中。外轉(zhuǎn)換會(huì)降低熒光強(qiáng)度。

10④體系間跨越(intersystemcrossing)：是處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過(guò)程。

如S1→T1，S1上的受激電子發(fā)生自旋方向變化而變成T1，即可通過(guò)自旋-軌道耦合而產(chǎn)生無(wú)輻射躍遷。如果兩個(gè)電子能級(jí)態(tài)（如S1與T1)的振動(dòng)能級(jí)相重疊，則發(fā)生體系間跨越的幾率將增大。體系間跨越常見于含有重原子（如碘、溴等）的有機(jī)分子。11（2）輻射躍遷①熒光發(fā)射：分子最初處于激發(fā)單重態(tài)，通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換及振動(dòng)弛豫，均可返回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，然后再以輻射形式發(fā)射光量子而返回至基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)上，這時(shí)發(fā)射的光量子稱為熒光。

S1→S0+hνF

熒光發(fā)射的時(shí)間10-9~10-7s

熒光波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)（Stokes效應(yīng)）12②磷光(phosphorescence)發(fā)射：經(jīng)過(guò)體系間跨越的分子再通過(guò)振動(dòng)弛豫降至激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，分子在激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)可以存活一段時(shí)間，然后返回至基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)而發(fā)出光輻射，這種光輻射稱為磷光。

T1→S0+hνp

磷光發(fā)射時(shí)間較長(zhǎng)，約10-4-10s。激發(fā)光停止后，磷光可持續(xù)一段時(shí)間。電子由S0→T1為禁阻躍遷，需由S1經(jīng)過(guò)體系間跨越轉(zhuǎn)化為T1。同一分子的S1→S0

比T1→S0

的能級(jí)差大，磷光的波長(zhǎng)比熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)1314S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量λ

2λ1λ

3

外轉(zhuǎn)換λ

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫分子內(nèi)的光物理過(guò)程1415熒光與磷光的不同點(diǎn)：躍遷時(shí)重度不同。熒光：S1→S0重度未變。磷光：T1→S0重度改變。輻射強(qiáng)度不同。熒光：強(qiáng)度較大，因從S0→S1是自旋允許的，處于S1，S2態(tài)電子多，因而熒光亦強(qiáng)。磷光：很弱，因?yàn)镾0→T1是自旋禁阻的，處于T1態(tài)電子少。壽命不同。熒光：10-9~10-7s，壽命短。磷光：10-4~100s，壽命稍長(zhǎng)。15（二）熒光的激發(fā)光譜和熒光光譜1.激發(fā)光譜激發(fā)光譜表示不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)熒光的相對(duì)效率。繪制激發(fā)光譜曲線時(shí)，固定發(fā)射單色器在某一波長(zhǎng)，通過(guò)激發(fā)單色器掃描，以不同波長(zhǎng)的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，記靈熒光強(qiáng)度(F)對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)(λex)的關(guān)系曲線，即激發(fā)光譜，其形狀與吸收光譜極為相似。162.熒光光譜：熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長(zhǎng)組分的相對(duì)強(qiáng)度。繪制發(fā)射光譜時(shí)，使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度保持不變，通過(guò)發(fā)射單色器掃描以檢測(cè)各種波長(zhǎng)下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，記錄熒光強(qiáng)度(F)對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)(λem)的關(guān)系曲線，即熒光光譜。

激發(fā)光譜和熒光光譜可用來(lái)鑒別熒光物質(zhì)，而且是選擇測(cè)定波長(zhǎng)的依據(jù)。1718溶液熒光光譜通常具有如下特征：（1）斯托克斯位移熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光波長(zhǎng)的現(xiàn)象。原因：①激發(fā)態(tài)分子通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫過(guò)程而迅速到達(dá)第一激發(fā)單重態(tài)s1*的最低振動(dòng)能級(jí)；②熒光發(fā)射可能使激發(fā)態(tài)分子返回到基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)．然后進(jìn)一步損失能量；③激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子的相互作用。19（2）熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)（3）熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系20二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率

1．熒光壽命(fluorescencelifetime)：當(dāng)除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的l／e所需的時(shí)間，常用τ表示。當(dāng)熒光物質(zhì)受到一個(gè)及其短暫的光脈沖激發(fā)后，它從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的變化可用指數(shù)衰減定律表示：F0和Ft分別是在激發(fā)時(shí)t＝0和激發(fā)后時(shí)間t時(shí)的熒光強(qiáng)度，K是衰減常數(shù)。21假定在時(shí)間t＝τf時(shí)測(cè)得的Ft為F0的1/e，即Ft＝(1／e)F0，則：

如果以1nF0/Ft對(duì)t作圖，直線斜率即為1/τf，此可計(jì)算熒光壽命。利用分子熒光壽命的差別，可以進(jìn)行熒光物質(zhì)混合物的分析。222．熒光效率(fluorescenceefficiency)又稱熒光量子產(chǎn)率(fluorescencequantumyield)

激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的光子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)之比，常用φf(shuō)表示；23（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系

能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)同時(shí)具備兩個(gè)條件：即有強(qiáng)的紫外—可見吸收和一定的熒光效率。

1．長(zhǎng)共扼結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)、因?yàn)榉枷悱h(huán)和雜環(huán)分子具有長(zhǎng)共軛的π—π*躍遷。π電子共軛程度越大，熒光強(qiáng)度(熒光效率)越大，而熒光波長(zhǎng)也長(zhǎng)移。242．分子的剛性

在同樣的長(zhǎng)共軛分子中，分子的剛性越強(qiáng)，熒光效率越大，熒光波長(zhǎng)產(chǎn)生越長(zhǎng)。芴（φf(shuō)=1.0）聯(lián)苯（φf(shuō)=0.2）2，2’-二羥基偶氮苯（無(wú)熒光）配合物（熒光）253．

取代基：a增加分子的π電子共軛程度，常使熒光效率提高，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移．如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-CN、-NR2等；常為給電子取代基b減弱分子的π電子共軛程度，使熒光減弱甚至熄滅，如-COOH、

-NO2

、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-X等；常為吸收電子取代基c對(duì)π電子共軛體系作用較小，如：-R、-SO3H、-NH3+等，對(duì)熒光的影響也不明顯。26（三）熒光試劑為了提高測(cè)定的靈敏度和選據(jù)性，常使弱熒光物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物，擴(kuò)大熒光分析法的應(yīng)用范圍。

1．熒光胺能與脂肪族和芳香族伯胺形成高度熒光衍生物。

2．鄰苯二甲醛(OPA)與伯胺類、特別是半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的α-氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。

3．1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘能與伯、仲胺及酚基的生物堿反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物

4．測(cè)定無(wú)機(jī)離子的熒光試劑27

三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素

1.溫度：在一般情況下，隨著溫度的升高，溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率和熒光強(qiáng)度將降低。

2.溶劑：一般情況下，溶劑極性增加，熒光波長(zhǎng)發(fā)生紅移，熒光強(qiáng)度增加。溶劑粘度降低，降低分子的熒光強(qiáng)度。28

3.酸度：具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；pH<2無(wú)熒光pH=7~12藍(lán)色熒光pH>13無(wú)熒光對(duì)無(wú)機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會(huì)影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。29

4．熒光熄滅劑熒光熄滅又稱熒光淬滅指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。熒光熄滅劑引起熒光熄滅的物質(zhì)鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、碳基和羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。30熒光熄滅的原因：①熒光物質(zhì)的分子和熄滅劑分子碰撞而損失能量；②熒光物質(zhì)的分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配位化合物；③溶解氧的存在，使熒光物質(zhì)氧化，或是由于氧分子的順磁性，促進(jìn)了體系間跨越，使激發(fā)單重態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三重態(tài)；④濃度較大(超過(guò)1g/L)時(shí)，還發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。31

5．散射光當(dāng)一束平行單色光照射在液體樣品上時(shí)，大部分光線透過(guò)溶液，小部分由于光子與物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)功方向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱為散射光。光子和物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞時(shí)，發(fā)生能量的交換，僅僅是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變，這種散射光稱為瑞利光。其波長(zhǎng)與入射光波長(zhǎng)相同。32光子和物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時(shí)．在光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變的同時(shí)，光子與物質(zhì)分子發(fā)生能量的交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量，而發(fā)射出比入射光稍長(zhǎng)或稍短的光，這種散射光稱為拉曼光。散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾，尤其是波長(zhǎng)比入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的拉曼光。選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)可消除拉曼光的干擾。33第二節(jié)熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系熒光強(qiáng)度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度34二、定量方法

1.工作曲線（校正曲線)法：用一定量的對(duì)照品配制成濃度不同的對(duì)照品系列溶液（標(biāo)準(zhǔn)系列溶液），測(cè)得對(duì)照品系列溶液的熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度F對(duì)濃度c的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，測(cè)量同樣條件供試品溶液的熒光強(qiáng)度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出供試品溶液的濃度。35

2．比例法如果熒光分析的校正曲線通過(guò)原點(diǎn)，就可選擇其線性范圍，用比例法進(jìn)行測(cè)定。取已知量的對(duì)照品，配置一對(duì)照品溶液（CS），使其濃度在線性范圍之內(nèi)，測(cè)定熒光強(qiáng)度（FS），然后在同樣條件下測(cè)定試樣溶液的熒光強(qiáng)度（Fx）。按比例關(guān)系計(jì)算試樣中熒光物質(zhì)的含量（Cx）。在空白溶液的熒光強(qiáng)度不能調(diào)到o時(shí)．必須從FS及FX值中扣除空白溶液的熒光強(qiáng)度（F0）．然后進(jìn)行計(jì)算。36

3．聯(lián)立方程式法此法用于多組分混合物的熒光分析。如果混合物中各組分熒光峰相距較遠(yuǎn)，而且相互之間無(wú)顯著干擾，則可分別在不同波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)組分的熒光強(qiáng)度，從而直接求出各個(gè)組分的濃度。如果各個(gè)組分的熒光光譜相互重疊，可利用熒光強(qiáng)度的加和性質(zhì)，在適宜的熒光波長(zhǎng)處，測(cè)定混合物的熒光強(qiáng)度，再根據(jù)各組分在該熒光波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，列出聯(lián)立方程式，分別求出它們各自的含量。3738三、熒光分析條件的選擇1.選擇線性范圍熒光物質(zhì)濃度較低時(shí)，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度才呈線性關(guān)系，應(yīng)通過(guò)一定條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定方法的線性范圍。高濃度時(shí)，由于熒光自熄滅和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度與濃度呈非線性關(guān)系。分析時(shí)應(yīng)在線性范圍內(nèi)進(jìn)行，否則會(huì)產(chǎn)生誤差。38392.激發(fā)光波長(zhǎng)λex

由激發(fā)光譜選擇能產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長(zhǎng)，即最大激發(fā)波長(zhǎng)，作為分析用的激發(fā)光波長(zhǎng)，以λex表示。3.熒光波長(zhǎng)λem

分析時(shí)，應(yīng)根據(jù)熒光光譜選擇最強(qiáng)熒光的波長(zhǎng)作為熒光測(cè)定波長(zhǎng)，以λem表示。39404.散射光干擾的排除散射光包括瑞利散射光和拉曼散射光。瑞利散射光的波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)相同；拉曼散射光的波長(zhǎng)一般情況下比激發(fā)波長(zhǎng)要長(zhǎng)，有時(shí)靠近熒光波長(zhǎng)。消除方法：①選擇適宜的激發(fā)波長(zhǎng)；②選擇合適溶劑。40415.溶劑的選擇對(duì)于π-π*共軛的熒光物質(zhì)，宜用極性溶劑。對(duì)于n-π*共軛的熒光物質(zhì)（π電子體系上連有-OH、-COOH、-NH2等），宜用非極性溶劑。6.pH值的選擇7.消除熒光猝滅物質(zhì)干擾41第三節(jié)熒光分光光度計(jì)一熒光分光光度計(jì)

用于測(cè)量熒光強(qiáng)度的儀器分類：

⒈濾光片熒光計(jì)不能測(cè)定光譜，可用于定量分析。

⒉濾光片-單色器熒光計(jì)不能測(cè)定激發(fā)光譜，可測(cè)定熒光光譜。

⒊熒光分光光度計(jì)可測(cè)量某一波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，還可繪制激發(fā)光譜和熒光光譜。42431）光源：氙燈：波長(zhǎng)250~700nm。宜連續(xù)使用，避免頻繁啟動(dòng)。低壓汞燈：線狀光譜，主要能量集中在紫外光區(qū)，其常用譜線為253.7nm，常用它進(jìn)行單色器的波長(zhǎng)校正。高壓汞燈：常用譜線為365.0nm。2）單色器：用光柵制成3）樣品池：石英（低熒光材料）4）檢測(cè)器：光電倍增管為減少激發(fā)光的雜散光干擾，檢測(cè)器與激發(fā)光方向垂直放置。44二、其他熒光分析技術(shù)簡(jiǎn)介激光誘導(dǎo)熒