工業(yè)微生物分離與篩選

工業(yè)微生物分離與篩選第一頁，共四十二頁，2022年，8月28日定方案：首先查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術得到純種。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。新菌種分離與篩選的步驟第二頁，共四十二頁，2022年，8月28日（一）菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。第三頁，共四十二頁，2022年，8月28日新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。

（二）分離思路第四頁，共四十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)含微生物樣品的采集一、從土壤中采集分布：細菌、放線菌、霉菌、酵母、藻類、原生動物1、土壤特點：有機質(zhì)含量和通氣狀況

5-25cm細菌、放線菌；5-10cm酵母、霉菌酸堿度和植被狀況第五頁，共四十二頁，2022年，8月28日地理條件季節(jié)條件：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。第六頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、根據(jù)微生物生理生化類型采樣1、根據(jù)微生物營養(yǎng)類型采樣自養(yǎng)型、異養(yǎng)性（碳源不同）2、根據(jù)生理特性采樣溫度敏感型、氧敏感性、滲透壓敏感型、酸堿型等3.特殊環(huán)境下采樣：極端微生物

第七頁，共四十二頁，2022年，8月28日三、采樣方式（1）土樣采集森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；用小鏟子除去表土，取離地面5-25cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等。為使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，樣品要及時分離。第八頁，共四十二頁，2022年，8月28日水田等浸水土壤在不損土層結構的情況下插入圓筒采集?；蚩扇‰x地面5～15cm處的土。在采集植物根際土樣時，一般是自土壤中慢慢拔出植物根，在無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分即為根際土樣。采集工具：樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。第九頁，共四十二頁，2022年，8月28日（2）植物體采集采集葉面一般用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。選擇葉面時應考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。采集植物根及根系時，方法與根際土樣采集方法相似。采集根系時，一般與根際土樣一起保存。第十頁，共四十二頁，2022年，8月28日

（3）水樣采集水樣應收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中；由于表層水中含有泥沙，故在采樣時應在較深的靜水層中采集水樣；方法：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進入。水樣不應裝滿采樣瓶。所有水樣都應在24h之內(nèi)迅速進行檢測，或者4℃下貯存。第十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日四、采樣的注意事項采樣時應盡可能保持相對無菌；所采集的樣本必須具有某種代表性；完整地標上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等；應充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的；采好的樣應及時處理，暫不能處理的也應貯存于4℃下，時間不宜過長。第十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日1、營養(yǎng)成分2、培養(yǎng)時間、溫度、pH3、抑制雜菌等一切能提高目的微生物相對生長速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。第二節(jié)含微生物樣品的富集培養(yǎng)第十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎的步驟。在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；所以篩選過程中，應及時調(diào)整檢測方法，以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應。第三節(jié)工業(yè)微生物的常規(guī)分離第十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日一、對工業(yè)微生物的基本要求

菌株應為“純種培養(yǎng)”。鏡檢無其它微生物。且無噬菌體感染。菌種具穩(wěn)定的遺傳性。必須能生長出可再生的單位—營養(yǎng)細胞、孢子種子質(zhì)量好—各級種子罐的擴大培養(yǎng)要生長迅速、強健。微生物菌株是發(fā)酵生產(chǎn)成敗的關鍵。第十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日1在短時間內(nèi)可獲得目的產(chǎn)物——3天或更短。

2菌株的自我保護及采取措施:

降低pH

高溫生長

3目的產(chǎn)物多，且在多組分中易分離。

第十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日二、含微生物樣品的富集培養(yǎng)控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分控制培養(yǎng)條件抑制不需要的菌第十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日從產(chǎn)物角度在培養(yǎng)時以產(chǎn)物的形成有目的的設計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素從形態(tài)的角度菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。三、分離方法確定從生理的角度好氧型、厭氧型第十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日1、生態(tài)學方法用于培養(yǎng)分離中列出所要分離的微生物類群；根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù)，描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地：列出所要考察和測量的環(huán)境參數(shù)，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢及溫度等；將樣本分成若干類型，如植物和植物各部，土壤(類型和土層)、巖石、水、昆蟲和發(fā)酵食品等；列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠；第十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日根據(jù)上述5項中所獲得的數(shù)據(jù)，設計分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件；用標準方法作對照來評價分離方法，根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法；運用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。第二十頁，共四十二頁，2022年，8月28日2、生態(tài)學參數(shù)及培養(yǎng)基的組成原則部分分離培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，應含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。所有分離培養(yǎng)基中都應含有抗真菌劑或抗細菌制劑，濃度約為50μg／m1；瓊脂平板使用前應置于37℃培養(yǎng)箱中孵育l、2天；培養(yǎng)基的生物物理學參數(shù)，如pH及鹽分也應調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。第二十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日1分離培養(yǎng)微生物的常規(guī)操作分離研究微生物要在無菌條件下進行。防雜菌污染1操作在無菌室、無菌箱、超凈工作臺上進行。使用前用70～75％酒精棉球擦拭。2培養(yǎng)容器（試管、培養(yǎng)皿）要事先滅菌。培養(yǎng)時要加蓋。以防污染。3接種用具（吸管、接種環(huán)）要滅菌4接種時塞子或蓋要在火焰上過一下。三、菌種分離方法第二十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日2采樣分離方法（1）從自然界采樣分離

培養(yǎng)分離挖土稀釋

接種——表面向下5cm，編號記錄——1000～100萬倍——取0.1～0.2ml稀釋液——選用易生長發(fā)育的培養(yǎng)基第二十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日（2）從檢樣分離可采取下列方法從檢樣直接分離菌株A把檢樣土直接混合到預先融化的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。B取稀釋后檢樣的上清液混合到固體培養(yǎng)基中。C把上清液接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時間再接入固體培養(yǎng)基。D將土樣連續(xù)幾次在液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)后，接入固體培養(yǎng)基中分離。第二十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日E組織分離法一般有病組織分離法消毒→沖洗→放在培養(yǎng)基上→分離→單一菌落食用菌孢子分離法多孢子分離法單孢子分離法第二十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日3微生物的接種培養(yǎng)方法（1）稀釋平板培養(yǎng)法（定性、定量）加上下面的輔助措施主要適用于厭氧菌的分離培養(yǎng)對絕對厭氧菌的輔助措施培養(yǎng)用培養(yǎng)箱要預先去除氧并密閉第二十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日加還原劑（p72)加入半胱氨酸、維生素C、硫化鈉等焦性沒食子酸法平皿厭氧培養(yǎng)法試管厭氣培養(yǎng)法玻璃板隔絕空氣培養(yǎng)法生物吸氧法第二十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日（2）厭氧菌的稀釋轉動分離培養(yǎng)法瓊脂試管加熱溶解冷卻至50℃（保持液態(tài)），接種一支試管，轉動混合后取出1/10接入第二支試管，轉動混合后再取出1/10接入第三支試管，依次類推，連續(xù)接種6～10支。冷卻凝固。在瓊脂培養(yǎng)基表面傾注一層無菌石蠟，防止空氣中的氧氣進入。第二十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日4純化分離菌種的方法挑取首批菌落菌懸液無菌稀釋液稀釋接種到培養(yǎng)皿培養(yǎng)重復上述步驟單孢子分離稀釋轉動培養(yǎng)——挑取一個菌落——取一部分——觀察。必要時所有操作在無菌條件下進行第二十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日第四節(jié)有用微生物的篩選篩選有用微生物是工業(yè)生產(chǎn)過程的第一步。篩選：從自然界某些含有菌群的材料中，用特定的操作程序分離并發(fā)現(xiàn)有用的微生物。一初篩二復篩三抗菌譜的測定第三十頁，共四十二頁，2022年，8月28日（一）初篩目的：得到具有潛在應用價值的目的微生物。初篩：一次或多次從現(xiàn)有菌群中把多數(shù)無用的微生物淘汰，把少量有用的微生物篩選出來。要求：

快速——有預測或預見敏捷——迅速處理好眾多的樣品。經(jīng)濟——得到有廣泛目標的有用微生物。第三十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日篩選方法瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)出群體后初篩。1、用pH指示劑檢測有無有機酸或胺類。中性麝香草酚藍:pH＜6.0黃,pH＞7.6藍,綠2、在培養(yǎng)基中加入碳酸鈣檢測有機酸?？稍诰褐車纬汕逦奶妓徕}溶解區(qū)。3、在培養(yǎng)基中加入底物檢測細胞外酶、酶抑制劑等特定的底物可以與細胞外酶形成顯色反應；酶的反應對特定底物形成溶解或沉淀。第三十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日4各種抗生素產(chǎn)生菌的初篩（1）有代表性的常用試驗菌（部分是病原菌）細菌真菌原蟲革蘭氏陰性菌革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌枯草桿菌八疊球菌肺炎雙球菌產(chǎn)氣桿菌大腸桿菌痢疾桿菌普通變形桿菌黑曲霉產(chǎn)黃青霉煙曲霉菌白色念珠痢疾阿米巴球蟲第三十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日（2）各種抗生素產(chǎn)生菌的初篩采用抑菌圈法，亦稱平板擴散法、杯碟法方法培養(yǎng)菌液溶化的瓊脂48℃混合倒平板放檢樣杯碟培養(yǎng)無菌操作有抑菌圈為陽性反應第三十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日

（二）復篩微生物初篩鑒定發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)與發(fā)酵抽提試驗第三十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日1、微生物初篩鑒定對初篩菌株進行分類——何屬？何種？目的：預知微生物對人、動物或植物是否有致病性?；蜻M行毒理實驗，最短3月，長達2-5年但分類復雜。以前輕易不作。第三十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日放線菌細菌霉菌植物病原菌碳源：葡萄糖、淀粉、糊精、蔗糖、麥芽糖葡萄糖、檸檬酸鈉乳糖、葡萄糖、蔗糖葡萄糖、蔗糖氮源：大豆粉、蛋白胨、牛肉膏、玉米漿、硝酸銨肉湯、蛋白胨、豆餅粉、酵母膏、硫酸銨玉米漿、蛋白胨蛋白胨無機鹽：氯化鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鉀氯化鈉、磷酸氫二鉀、錳、鐵磷酸氫二鉀、錳、鐵磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、錳、鐵2發(fā)酵培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基的選擇第三十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日3培養(yǎng)與發(fā)酵（1）試管培養(yǎng)試管搖床培養(yǎng)。常用。目的：原種斜面培養(yǎng)后，為了提高初篩效率。（2）搖瓶培養(yǎng)（搖瓶發(fā)酵）250或500ml錐形瓶再200rpm搖床上培養(yǎng)。目的：培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的初篩。

第三十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日（3）玻璃自控發(fā)酵罐容量5～50L。是搖床向發(fā)酵罐的過渡階段。目的：工藝參數(shù)、工藝條件的選擇和考察。（4）試驗罐培養(yǎng)中間工業(yè)試驗階段目的：放大和驗證搖床試驗結果，積累發(fā)酵工藝規(guī)律和發(fā)酵參數(shù)。為工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)打基礎第三十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日