真菌操作常規(guī)20230307

真菌鑒定操作常規(guī)標(biāo)本的采集和處理1.皮膚、指甲、毛發(fā)和組織在收集標(biāo)本前用75%酒精消毒病變部位。如果損害處已用了軟膏、冷霜或粉劑應(yīng)事先清潔。取材應(yīng)用鈍手術(shù)刀刮取表皮皮屑，或用透明膠帶粘取皮屑直接移至載玻片上，水皰取皰壁組織，膿皰則取膿液。皮膚粘膜交界處或菲薄的皮膚部位如龜頭、大陰唇、口周、肛周等處以浸有生理鹽水的濕棉拭子，檫拭局部后送檢。指甲標(biāo)本應(yīng)取變色、萎縮或變脆的部位，以鈍手術(shù)刀刮除表層，采集病甲邊緣下病甲置載玻片上，滴封固液，微加熱，使甲溶解。毛發(fā)標(biāo)本應(yīng)取無(wú)光澤、脆而松動(dòng)，根部折斷的毛發(fā)。毛發(fā)置載玻片滴加10%KOH溶液，微加熱使角質(zhì)溶解。組織取病變部位，置無(wú)菌生理鹽水中送檢。以無(wú)菌鑷子和剪刀剪碎后進(jìn)行培養(yǎng)或鏡檢，避免使用組織研磨器對(duì)真菌菌絲的折斷及機(jī)械性損害皮膚、指甲、毛發(fā)和組織標(biāo)本一般采用直接鏡檢。2．眼、耳部標(biāo)本懷疑真菌性角膜炎時(shí)，應(yīng)在手術(shù)顯微鏡下以眼科小匙刮取潰瘍的基底和邊緣部位。懷疑真菌性內(nèi)眼炎時(shí)，應(yīng)盡可能收集玻璃體液。結(jié)膜標(biāo)本可用消毒生理鹽水浸濕的棉拭子拭取。耳部標(biāo)本應(yīng)從耳道中刮屑取材，也可采用拭子取材。3．腦脊液標(biāo)本取3-5ml經(jīng)腰穿獲取的腦脊液標(biāo)本至無(wú)菌管內(nèi)立即送檢。將標(biāo)本2500rpm離心15分鐘，上清液可用于血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，沉淀部分用于培養(yǎng)和涂片鏡檢。4．血液、骨髓標(biāo)本抽取5－10毫升血液或骨髓注入需氧菌血培養(yǎng)瓶中，盡快送檢。如血培養(yǎng)儀器報(bào)告陽(yáng)性，及時(shí)取樣接種于沙氏培養(yǎng)基并涂片革蘭染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)真菌孢子報(bào)告病房并登記。5．體液（包括胸腔、腹腔及關(guān)節(jié)腔積液）：將無(wú)菌抽取胸水、腹水和關(guān)節(jié)腔液及時(shí)送檢。標(biāo)本放無(wú)菌離心管中，2500rpm離心10分鐘，取沉渣培養(yǎng)或涂片鏡檢。6．尿液將清洗外陰后留取的中段尿，或經(jīng)導(dǎo)尿管導(dǎo)出的中段尿，或經(jīng)皮膀胱穿刺尿立即送檢。尿標(biāo)本應(yīng)先2500rpm離心10分鐘，取沉淀部分進(jìn)行培養(yǎng)及涂片鏡檢。7．陰道分泌物或男性尿道標(biāo)本女性由婦科醫(yī)師用窺器取陰道或?qū)m頸的偽膜或豆渣樣凝塊。男性則以尿道拭子伸入尿道2.5cm處旋轉(zhuǎn)取出盡可能多的尿道脫落細(xì)胞及分泌物，立即送檢。8．呼吸道標(biāo)本（咳出痰、誘導(dǎo)痰、氣管吸痰、支氣管肺泡灌洗液、肺組織）取清晨新鮮咳出的痰，如病人不能咳痰，可用支氣管鹽水誘導(dǎo)咳痰，插管病人采用氣管吸出痰，必要時(shí)在纖維支氣管鏡檢的同時(shí)獲取支氣管肺泡灌洗液或支氣管毛刷標(biāo)本。對(duì)于局灶性肺部病變，高度懷疑肺部真菌感染的患者可經(jīng)皮穿刺，在影像學(xué)指導(dǎo)下獲取病變部位的肺組織。9．膿液或潰瘍、竇道、瘺管等標(biāo)本用75%酒精消毒病變部位后刮取膿液，竇道壁及周圍盡可能深的部位，若膿腫未破，應(yīng)以無(wú)菌注射器抽出膿液送檢。注意尋找并收集膿液中或竇道開口部位的顆粒送檢。10．大便留取新鮮大便，盡快送檢。收到標(biāo)本后，應(yīng)根據(jù)申請(qǐng)項(xiàng)目將檢驗(yàn)信息錄入計(jì)算機(jī)并獲取檢驗(yàn)號(hào)記錄在申請(qǐng)單上二、真菌的顯微鏡檢查：1．直接檢查：將待檢標(biāo)本（皮膚、甲屑、毛發(fā)或組織）置載玻片上，加一滴載液（根據(jù)不同需要選用相應(yīng)載液），蓋上蓋玻片，放置片刻或在火焰上快速通過2-3次（不可煮沸），輕壓蓋玻片，驅(qū)逐氣泡并將標(biāo)本壓薄，用吸紙吸去周圍溢液，置顯微鏡下鏡檢。檢查時(shí)先在低倍鏡下檢查有無(wú)菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)、特征、位置、大小和排列。結(jié)果報(bào)告依據(jù)鏡下情況報(bào)：“找到真菌孢子”或者“找到真菌菌絲”或者“找到真菌菌絲及孢子”。如未找到真菌孢子及菌絲報(bào)告“未找到真菌”。注意：毛發(fā)標(biāo)本不可過度施壓以免破壞毛發(fā)的結(jié)構(gòu)而影響對(duì)菌絲孢子與毛干相對(duì)位置關(guān)系的判斷。載液：=1\*GB3①生理鹽水：用于稀釋標(biāo)本；=2\*GB3②KOH液：可溶解角蛋白并能清除標(biāo)本中的膿細(xì)胞及其他成分而不破壞菌絲和孢子。一般采用10%-20%溶液。甲屑、毛發(fā)等角質(zhì)厚的標(biāo)本可用20%溶液；=3\*GB3③乳酸酚棉藍(lán)染色液：可使真菌染成藍(lán)色，鏡下易于分辨。絲狀真菌直接鏡檢也使用此載液。2．涂片染色鏡檢：將標(biāo)本或菌液均勻涂于載玻片上（必要時(shí)加生理鹽水或KOH液），火焰固定，革蘭氏染色（或其他特殊染色），鏡檢。如發(fā)現(xiàn)真菌報(bào)“找到（圓形或卵圓形）真菌孢子（及假菌絲）”。如未找到真菌孢子及假菌絲報(bào)告“未找到真菌”。3．墨汁涂片：用于檢查新型隱球菌和其他有莢膜的真菌孢子。以優(yōu)質(zhì)繪圖用黑墨汁少許置載玻片上，加腦脊液沉渣，加蓋玻片。稍待2-3分鐘，用顯微鏡先低倍再高倍鏡檢查；如發(fā)現(xiàn)帶莢膜真菌孢子，報(bào)告“找到隱球菌”。如未找到帶莢膜真菌孢子報(bào)告“未找到隱球菌”。三、真菌的分離培養(yǎng)：病原真菌除鼻孢子菌和鏈狀芽生菌外，大多數(shù)都可人工培養(yǎng)。1．平板培養(yǎng)法：分區(qū)劃線：呼吸道、膿、血液、體液等標(biāo)本使用此法培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取適量標(biāo)本，在沙氏培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，一般分2-3區(qū)。置25℃培養(yǎng)，有真菌生長(zhǎng)及時(shí)鑒定，5天無(wú)菌生長(zhǎng)報(bào)告“真菌培養(yǎng)未生長(zhǎng)”2．試管培養(yǎng)法：=1\*GB3①直接種植：皮膚、指甲、毛發(fā)和組織使用此法培養(yǎng)。用無(wú)菌鑷子夾取待檢標(biāo)本點(diǎn)種在2根沙氏斜面上，可等距離點(diǎn)種幾塊標(biāo)本。置25℃和37℃培養(yǎng)，有真菌生長(zhǎng)及時(shí)鑒定，14天無(wú)菌生長(zhǎng)報(bào)告“真菌培養(yǎng)未生長(zhǎng)”。=2\*GB3②腦脊液離心后的腦脊液用接種環(huán)接種2根沙氏斜面上，分別置25℃和37℃。有真菌生及時(shí)鑒定，14天無(wú)菌生長(zhǎng)報(bào)告“真菌培養(yǎng)未生長(zhǎng)”。在沙氏瓊脂斜面上菌落初為白色、奶油狀，時(shí)間長(zhǎng)顏色漸變?yōu)榈稚Ｓ械木暧姓骋夯厔?shì)，甚至似鼻涕樣流向直立的斜面下部。培養(yǎng)物墨汁涂片，不易見莢膜，即使有莢膜也較小。注意：標(biāo)本應(yīng)至少接種2支沙氏瓊脂斜面，分置于25℃及37不長(zhǎng)方可報(bào)告陰性。新型隱球菌在上述兩種溫度下皆可生長(zhǎng)，某些非致病隱球菌只在25℃或30℃生長(zhǎng)，卻不能在37℃生長(zhǎng)。但初代培養(yǎng)在25℃生長(zhǎng)而于3．玻片培養(yǎng)法（小培養(yǎng)）：=1\*GB3①取無(wú)菌平皿倒入適量溶化的培養(yǎng)基（厚約1mm），凝固后以無(wú)菌刀片劃成1cm2大小的小塊。取一小塊移在無(wú)菌載片上，在小塊四周接種待鑒定的菌株，蓋上消毒的蓋片。放入無(wú)菌平皿中的V形玻棒上，底部鋪上無(wú)菌濾紙，濾紙以無(wú)菌蒸餾水濕潤(rùn)（也可用無(wú)菌濕棉球替代濾紙保濕）。將平皿置溫箱培養(yǎng)。也可以在無(wú)菌載片上均勻地澆上溶化的培養(yǎng)基，凝固后接種待鑒定菌株，蓋無(wú)菌蓋片，其余同上。=2\*GB3②待菌落生長(zhǎng)后，取出載片直接鏡檢。也可揭下蓋片加95%酒精脫水，干后滴PVA乳酸酚棉藍(lán)液封固，鏡檢。四、酵母樣真菌的鑒定酵母樣真菌是以芽殖為主的單細(xì)胞真菌，菌落平滑、濕潤(rùn)，乳酪樣或薄膜樣，無(wú)毛樣氣生菌絲。其中主要致病菌見于念珠菌屬、隱球菌屬、球擬酵母屬、酵母屬和絲孢酵母屬。按是否具有有性繁殖過程及有性孢子產(chǎn)生的方式、特點(diǎn)、形狀和數(shù)目，酵母菌可歸為3類：1.子囊菌亞門(Ascomycotina)：可產(chǎn)生子囊孢子，如酵母屬、漢遜酵母屬、裂殖酵母屬；2.擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina):可產(chǎn)生冬孢子或擲孢子，如冬孢酵母屬、擲孢酵母屬等；3.半知菌類(Derteromycotina)：尚未發(fā)現(xiàn)有性期，如念珠菌屬、隱球菌屬、紅酵母屬、球擬酵母屬、絲孢酵母屬等。（一）念珠菌屬（Candida）的鑒定：1.涂片檢查革蘭染色鏡檢可見圓形或卵圓形芽生孢子，一般為念珠菌。亦有從孢子的芽延長(zhǎng)而成假菌絲者。有大量假菌絲存在說明念珠菌處于生長(zhǎng)活躍狀態(tài)。大小約3-7×3-14μm不等，單個(gè)、成堆或呈短鏈排列。孢子及菌絲皆為革蘭陽(yáng)性，呈紫色。但有時(shí)著色不均，有時(shí)少數(shù)呈革蘭陰性。可報(bào)告“找到（圓形或卵圓形）真菌孢子（及假菌絲）”。2．分離培養(yǎng)沙氏平板或斜面以及中國(guó)藍(lán)平板上有酵母樣菌落長(zhǎng)出后，采用以下方法鑒定：=1\*GB3①形態(tài)學(xué)方法：接種顯色培養(yǎng)基（37℃培養(yǎng)）和玉米粉-吐溫80培養(yǎng)基（25℃培養(yǎng)），根據(jù)菌落形態(tài)、顯色特征和假菌絲特征鑒定菌種。其中，顯色培養(yǎng)上生長(zhǎng)綠色菌落為白色念珠菌，藍(lán)色菌落為熱帶念珠菌，粉紅干燥菌落為克柔念珠菌，紫色=2\*GB3②生化方法：形態(tài)學(xué)無(wú)法鑒定的菌種可使用VitekYST鑒定卡以及API20C生化鑒定系統(tǒng)鑒定。操作方法見該產(chǎn)品使用說明書。（二）隱球菌屬（Cryptococcus）的鑒定：隱球菌較念珠菌少見，但由新型隱球菌引起的腦膜炎卻是一種嚴(yán)重的疾病。該菌存在于鴿糞、土壤、腐爛的水果中，亦見于動(dòng)物和人體。主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也可以侵及肺、骨、皮膚，甚至引起敗血癥。其他隱球菌也可引起嚴(yán)重的臨床感染。1.鏡下特征：=1\*GB3①直接鏡檢：標(biāo)本一般為腦脊液、痰或其他分泌物。鏡下可見圓形5-12-20μm直徑之厚壁芽生孢子，一般少有假菌絲；=2\*GB3②革蘭染色：為革蘭陽(yáng)性圓形芽生真菌孢子。注意勿將其誤作染料小滴。=3\*GB3③墨汁染色：如有新型隱球菌，在黑色背景下可見圓形孢子，其周圍繞以透光的厚莢膜，厚度可與菌體直徑相當(dāng)。菌體的大小和莢膜的寬窄在同一張片子上可有較大不同。有時(shí)可看到出芽的孢子。注意切勿將淋巴細(xì)胞誤認(rèn)為新型隱球菌。新型隱球菌在墨汁涂片中的形態(tài)可歸納為：●圓形或卵圓形的孢子，胞壁厚，邊緣清晰，用微調(diào)節(jié)觀察似有雙圈；●孢子周圍有透亮的厚莢膜，孢子與莢膜之間的界限和莢膜的外緣都非常整齊、清楚；●孢子內(nèi)有反光顆粒；●有的孢子有芽生出，且芽頸甚細(xì)。注意：任何圓形物體邊緣模糊，內(nèi)部無(wú)反光顆粒，外部有較窄、內(nèi)外界線不清的透亮環(huán)者，不是隱球菌。但應(yīng)注意新型隱球菌以外的其他隱球菌也有莢膜。2.生化鑒定：使用VitekYST鑒定卡以及API20C生化鑒定系統(tǒng)，方法見相應(yīng)產(chǎn)品使用說明書。隱球菌對(duì)糖無(wú)發(fā)酵能力，菌種鑒定依賴于同化試驗(yàn)及其他生化反應(yīng)。其中尿素酶陽(yáng)性，而常見念珠菌中絕大多數(shù)為陰性，僅解脂念珠菌和部分克柔念珠菌尿素酶陽(yáng)性。隱球菌中僅新型隱球菌酚氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，其他隱球菌陰性。常見隱球菌的生化特性見表3。（三）其他酵母菌的鑒定：盡管臨床標(biāo)本中分離出的致病酵母菌主要是念珠菌屬及新型隱球菌，但其他酵母菌也可引起嚴(yán)重感染。如絲孢酵母屬、球擬酵母屬、漢遜酵母屬、紅酵母屬、畢赤酵母屬等。如標(biāo)本取自正常無(wú)菌部位（如血液、胸腹水等）應(yīng)根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征或者使用VitekYST鑒定卡鑒定到種。鑒定步驟見表1、表2及表3。表1.不常見酵母菌鑒定程序表純培養(yǎng)1%Tween80玉米粉瓊脂(25℃假菌絲（＋）（—）(－)關(guān)節(jié)菌絲(＋)(＋)色素(－)念珠菌屬芽生孢子尿素酶莢膜(＋)(－)芽管及厚膜胞子(－)（＋）(＋)(－)隱球菌屬酚氧化酶子囊孢子37℃生長(zhǎng)(＋)(－)(－)(＋)其白絲地紅新其球酵漢他念孢霉酵型他擬母遜念珠酵菌母隱隱酵屬酵珠菌母屬屬球球母母菌屬菌菌屬屬表2．臨床可見到的酵母菌各屬特性菌種在玉米粉吐溫80瓊脂上25子囊孢子孢子囊芽管莢膜生長(zhǎng)假菌絲真菌絲沿菌絲芽生孢子關(guān)節(jié)孢子環(huán)痕分生孢子厚膜孢子含放線菌酮25在沙氏瓊脂37在沙氏肉湯芽裂殖酵母屬Blastoschizomyces+++OV+OOOOO++膜樣白念珠菌Candidaalbicans+少+OO+OO+O++NSG其他念珠菌OtherCandidaspp.+V少+OOOOVOOOV+V某些種表面生長(zhǎng)隱球菌屬CryptococcusOOOOOOOO+OVNSG地霉屬GeotrichumO+O+OOOOOOOOW膜樣漢遜酵母屬HansenulaOVOOOO+OOOOVNSG無(wú)綠藻ProtothecaOOOOOO+OOVO+V表面生長(zhǎng)紅酵母屬RhodotorulaOROOOOOOOVOV+VNSG酵母屬SaccharomycesVOOOO+OOOO+NSG球擬酵母屬TorulopsisOOOOOOOOOO+NSG絲孢酵母屬Trichosporon++++OOOOOO+V+V膜樣+：陽(yáng)性；O：陰性；V：菌種或菌株變異；W：弱；R：極偶見發(fā)育不全的形態(tài)；NSG：無(wú)表面生長(zhǎng)。表3.臨床標(biāo)本中常見酵母菌生化反應(yīng)菌種同化試驗(yàn)?zāi)蛩孛赶跛徕浄友趸钙咸烟躯溠刻钦崽侨樘前肴樘敲鄱抢w維二糖肌醇木糖棉子糖海藻糖衛(wèi)矛醇白念珠菌Candidaalbicans+++*+++鏈狀念珠菌C.catenulata++++季也蒙念珠菌C.guilliermondii++++++++++乳酒念珠菌C.Kefyr+++++*+*+*克柔念珠菌C.krusei++*朗比念珠菌C.lambica++解脂念珠菌C.lipolytica++葡萄牙念珠菌C.lusitaniae+++++++近平滑念珠菌C.parapsilosis++++++皺落念珠菌C.rugosa+++*熱帶念珠菌C.tropicalis+++++++涎沫念珠菌C.zeylanoides+**+光滑念珠菌C.glabrata++白球擬酵母T.candida++++*+++++++*平托球擬酵母T.pintolopesii+新型隱球菌Cryptococcusneoformans++++++++*++++淺白隱球菌C.albidus++++*+*+++++++*++羅倫特隱球菌C.laurentii++++++*++++*+++淺黃隱球菌C.luteolus++++++++++++地生隱球菌C.terreus++*+*+*++++*++指甲隱球菌C.uniguttulatus+++**+++**+粘紅酵母Rhodotorulaglutinis++++*++++++深紅酵母R.rubra+++++*++++釀酒酵母Saccharomycescerevisiae++++++*異常漢遜酵母Hansenulaanomala++++++++白吉利絲孢酵母T。beigelii+++++*+*+*+++*+*+*+*茁芽絲孢酵母T.pullulans++++*++*++*+*+*+++白地霉Geotrichumcandidum+++頭狀芽裂殖酵母B。capitatus++小型無(wú)綠藻Protothecawickerhamii++++：陽(yáng)性；–：陰性；*：菌種或菌株變異五、酵母菌的藥敏試驗(yàn)（紙片擴(kuò)散法）1．美藍(lán)儲(chǔ)存液：0.1g美藍(lán)加入20ml無(wú)菌水2．培養(yǎng)基：含2％葡萄糖和0.5μg/ml美藍(lán)的M-H瓊脂在1000mlM-H瓊脂中，加入100μl美藍(lán)儲(chǔ)存液和20g葡萄糖，121℃15分鐘高壓滅菌，水浴55℃倒實(shí)驗(yàn)方法：制備菌液：挑取新鮮菌落至適量無(wú)菌水中，搖勻成菌懸液。將濁度調(diào)致0