南京林業(yè)大學酶工程-3 動、植物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶

第三章動、植物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶80年代以來，生物工程研究和開發(fā)的新領域。動物細胞通過離心分離技術、雜交瘤技術、胰蛋白酶消化等獲得；培養(yǎng)方式有懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)；獲得疫苗、激素、多肽、單抗等；植物細胞通過搗碎、酶解、愈傷組織誘導獲得；培養(yǎng)方式有固體培養(yǎng)、液體層培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等；主產(chǎn)色素、藥物、香精、酶等。動、植物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)區(qū)別動物細胞無細胞壁，且大多數(shù)哺乳動物細胞附著在固體或半固體的表面才能生長；對營養(yǎng)要求嚴格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需有血清。動物細胞對環(huán)境敏感，包括pH、溶氧、溫度、剪切應力都比微生物有更嚴的要求，一般須嚴格的監(jiān)測和控制。植物細胞對營養(yǎng)要求較動物細胞簡單。但由于植物細胞培養(yǎng)一般要求在高密度下才能得到一定濃度的培養(yǎng)產(chǎn)物，以及植物細胞生長較微生物要緩慢，長時間的培養(yǎng)對無菌要求及反應器的設計也提出特殊的要求。動植物、微生物細胞的培養(yǎng)比較微生物動物細胞植物細胞

大小懸浮生長營養(yǎng)要求生長速率代謝調節(jié)環(huán)境敏感細胞分化剪切應力敏感傳統(tǒng)變異，篩選技術細胞或產(chǎn)物濃度1-10可以簡單快，倍增時間0.5-5小時內部不敏感無低廣泛使用較高10-100多數(shù)細胞需附著表面才能生長非常復雜慢，倍增時間15-100小時內部、激素非常敏感有非常高不常使用低10-100可以，但易結團，無單個細胞較復雜慢，倍增時間24-74小時內部、激素能忍受廣泛范圍有高有時使用低第一節(jié)植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶從中得到最普遍而必不可少的藥物有17類；全世界用其制備天然芳香化合物的價值超過15億＄/年；美國用其生產(chǎn)藥物超過30億＄/年；我國使用的中草藥及其制備大部分來自植物。植物來源的物質生產(chǎn)幾乎采用提取分離法，如從木瓜中提取木瓜蛋白酶；1902，Haberlandt提出分離植物單細胞培養(yǎng)成株的設想，至今已成為專門學科。通過植物細胞產(chǎn)酶的進展：表3-1目前植物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶概況:

酶

植物細胞（年份）

糖苷酶

β-半乳糖苷酶漆酶過氧化物酶

β-葡萄糖苷酶酸性轉化酶堿性轉化酶糖化酶木瓜蛋白酶苯丙氨酸氨裂合酶

胡蘿卜細胞（1981）紫苜宿細胞（1982）假挪威槭細胞（1983）甜菜細胞（1983）大豆細胞（1989）利馬豆細胞（1987）甜菜細胞（1988）甜菜細胞（1988）甜菜細胞（1988）木瓜細胞（1990）花生細胞（1986）大豆細胞（1989）表3-1植物細胞發(fā)酵產(chǎn)酶和動物細胞相似細胞壁(CellWall)細胞膜(Cellmembrane)細胞質(Cytoplasm)液泡(Vacuole)細胞核(Nucleus)葉綠體(Chloroplast)固體顆粒(Solidgranule)線粒體(Mitochondrion)覆蓋在細胞膜外，由纖維素構成，雖然厚但可讓物質自由穿過。功能：1.支持細胞，使它有固定形狀。2.保護細胞

植物細胞通常有較大的液泡許多植物細胞都含有葉綠體；內有綠色的葉綠素，鈉負吸收光能，進行光合行用如淀粉顆粒和不溶解的廢物植物細胞的構造一、植物細胞的特性

表2-2微生物、植物、動物細胞的特性比較（P78）微生物細胞植物細胞動物細胞細胞大?。é蘭）1~1020~30010~100倍增時間（h）0.3~6>12>15營養(yǎng)要求簡單簡單復雜對剪切力大多數(shù)不敏感敏感敏感主要產(chǎn)物醇類，有機酸，氨基酸，抗生素，酶，核苷酸色素，香精，藥物，酶激素，疫苗，單克隆抗體，酶二、植物細胞培養(yǎng)的特點例如,紫草寧(shikonin)生產(chǎn)，發(fā)酵細胞中的紫草寧比紫菜根(Lithospermumerythrorhizon)中高10倍，比產(chǎn)率達到種植紫草的830倍。紫草寧及其結構（1）提高產(chǎn)率植物細胞培養(yǎng)的特點（續(xù)）（2）縮短周期發(fā)酵周期10～30天，種植周期幾個月～幾年。（3）易于管理減低勞動強度；不受地理環(huán)境和氣候條件等影響。（4）提高產(chǎn)品質量主要產(chǎn)物濃度高，易于分離純化，減少環(huán)境中各種有害物質污染和侵蝕。（5）其它生物反應器的設計工藝條件注意的問題。三、植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（一）植物細胞培養(yǎng)的工藝流程外植體細胞獲取細胞培養(yǎng)分離純化產(chǎn)物go1、外植體的選擇與處理從植株取出，預處理后用于植物組織細胞培養(yǎng)的片段或小塊；選擇無病蟲害，生長旺盛的植株；切成小塊，消毒，漂洗back2、植物細胞的獲?。ǎ保┲苯臃蛛x法，有機械法、酶解法；（２）愈傷組織誘導法；（３）原生質體再生法需要大量無機鹽，除P、S、K、Ca、Mg外，還需B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、I需要各種維生素和植物激素，如硫胺素、吡哆素、煙酸、肌醇、激動素等。Sixmajorgroupsofplanthormones:1,AUXINS茁長素;2,CYTOKININS細胞分裂素;3,GIBBERELLINS赤霉素;4,ABSCISICACID脫落酸;5,ETHYLENE乙烯;6,BRASSINOSTEROIDS苔云素一般為無機氮源。一般以蔗糖為碳源。（二）植物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基植物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（續(xù)）（三）溫度的控制室溫（25℃）、（四）pH值的控制微酸性（pH5～6）（五）溶解氧的調節(jié)控制代謝慢，耗氧少，對剪切力敏感，攪拌不宜強烈。（六）光照的控制（七）前體的添加提高次級代謝物的產(chǎn)量。（八）刺激劑(electior)的應用強化次級代謝產(chǎn)物的生物合成。常用微生物細胞壁碎片和胞外酶。四、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過程超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內清除超氧化物陰離子自由基(O2—)的重要金屬酶類。它和過氧化氫酶、過氧化物酶一起構成了生物體內重要的酶促反應防御體系，從而維護生物體內細胞正常的生理代謝和生化反應。衰老自由基學說認為衰老源于機體正常代謝過程中產(chǎn)生過量的自由基對機體損害的結果。超氧化物歧化酶(SOD)作為能催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應的自由基清除劑，具有延緩衰老的作用。天瑞SOD蘋果

大蒜細胞培養(yǎng)產(chǎn)ＳＯＤ１、大蒜愈傷組織的誘導２、大蒜細胞的懸浮培養(yǎng)３、ＳＯＤ的分離純化第二節(jié)動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個術語;1907年Harrison

和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動物細胞的培養(yǎng);動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學研究中的應用，如抗病毒疫苗的生產(chǎn)等，現(xiàn)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一門精細技術。許多細胞株、細胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細胞系，如Hela細胞系（Gey，1952），可用來進行一系列研究，更加促進了組織培養(yǎng)技術的發(fā)展;20世紀50年代,Earle,病毒疫苗細胞培養(yǎng);1967,動物細胞貼壁培養(yǎng)微載技術;1975,雜交瘤技術;動物細胞可產(chǎn)生較高價值的物質,特別是激素、疫苗，單克隆抗體和酶等動物功能蛋白。動物細胞的構造細胞膜(Cellmembrane)細胞質(Cytoplasm)細胞核(Nucleus)液泡(Vacuole)固體顆粒

(Solidgranules)線粒體(Mitochondrion)一層薄膜，由脂類和蛋白質構成；功能：1.包裏細胞質

2.控制物質進入細胞呈膠狀的混合物，含多種化學物如：蛋白質和水；包圍著更小的細胞器如線粒體和液泡；是細胞內所進行化學反應的媒介。內含染色體。染色體攜帶遺傳訊息及控制細胞里所有活動。被一層薄膜包圍，內含溶解的化學物質和食物粒子等。在呼吸作用中協(xié)助釋放能量。一、動物細胞特性1,無細胞壁,脆弱;2,體積比微生物細胞大幾千倍,稍小于植物細胞;3,具有群體效應、錨定依賴性、接觸抑制性、功能全能性；4，營養(yǎng)要求復雜。二、動物細胞培養(yǎng)的特點1，主產(chǎn)各種功能蛋白；2，生長緩慢；3，需加抗生素防污染；4，對剪切力敏感；5，具錨定依賴性，宜貼壁培養(yǎng)；部分用懸浮培養(yǎng)；6，培養(yǎng)基成分復雜；7，原代細胞培養(yǎng)50代后需重新分離細胞。三、動物細胞培養(yǎng)的方式來自血液、淋巴組織的細胞、腫瘤細胞、雜交瘤細胞等非錨定依賴性細胞采用。類似于微生物細胞的深層發(fā)酵，但工藝條件有較大差別。雜交瘤細胞半懸浮培養(yǎng)

1、懸浮培養(yǎng)細胞懸浮培養(yǎng)法的優(yōu)點可連續(xù)收集部分細胞進行移植繼代培養(yǎng)，傳代時無需消化分散，免遭酶類、EDTA及機械損害。細胞收率高，并可連續(xù)測定細胞濃度，還有可能實現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。

注意事項培養(yǎng)過程中，為確保細胞呈單顆粒均勻懸浮狀態(tài)，需采用攪拌或氣升式反應器，以較低攪拌速度及一定速度通入含5％CO2的無菌空氣，保持細胞懸浮態(tài)并維持培養(yǎng)液溶解氧。此外不同細胞懸浮條件亦異，為使細胞不致凝集、成團或沉淀，在配制培養(yǎng)基的基礎鹽溶液中不加鈣和鎂離子。間歇或連續(xù)更換部分培養(yǎng)液，可維持pH值，若使用HEPES緩沖鹽溶液時尚可不必連續(xù)通入含5％CO2空氣。

來自動物器官中的細胞，采用:（1）滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng):結構簡單,重現(xiàn)性好;2、貼壁培養(yǎng)將動物細胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，使細胞在微載體表面長成單層的培養(yǎng)方法稱為微載體培養(yǎng)法或微珠培養(yǎng)法。由葡聚糖凝膠制成微球,動物細胞依附其上單層生長繁殖,懸浮于培養(yǎng)液中;特點:比表面積大,單位體積培養(yǎng)液細胞產(chǎn)率高;具有懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點.（2）微載體系統(tǒng):制備微載體的材料主要有：葡聚糖（DEAE—SephadexA50及A25）塑料明膠玻璃纖維素微載體培養(yǎng)優(yōu)點兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢，且是均相培養(yǎng)。細胞所處環(huán)境均一，放大容易。培養(yǎng)操作可系統(tǒng)化、自動化，障低了污染發(fā)生的機會。3、固定化細胞培養(yǎng)動物細胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術謂之細胞固定化培養(yǎng)法。錨定與非錨定依賴性動物細胞均可;一般采?。何椒ǎㄋ幂d體有陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒）；包埋法（將細胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質中）固定化培養(yǎng)優(yōu)點細胞可維持在較小體積培養(yǎng)液中生長；細胞損傷程度低；易于更換培養(yǎng)液；細胞和培養(yǎng)液易于分離；培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度高，簡化了產(chǎn)品分離純化操作。為什么大多數(shù)細胞培養(yǎng)需要用二氧化碳培養(yǎng)箱？

一般細胞培養(yǎng)液的pH在7.0-7.4之間。由于碳酸鹽pH緩沖系統(tǒng)是一種生理pH緩沖系統(tǒng)（它是人體血液中最重要的pH緩沖系統(tǒng)），大多數(shù)培養(yǎng)液用它來保持穩(wěn)定的pH。用粉末配制培養(yǎng)液時，常常需要加入一定量的碳酸氫鈉。對大多數(shù)以碳酸鹽作為pH緩沖系統(tǒng)的培養(yǎng)液而言，以為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)箱中的二氧化碳需要維持在2-10%之間，以保持培養(yǎng)液中溶解的二氧化碳的濃度。同時細胞培養(yǎng)的器皿需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。

為什么培養(yǎng)的細胞要及時傳代？體外培養(yǎng)的細胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當一個細胞被其他細胞包圍的時候，它就會停止生長。當細胞鋪滿培養(yǎng)器皿的表面時，正常的細胞停止生長，但是轉化（即發(fā)生遺傳物質突變）的對接觸抑制不敏感的細胞會繼續(xù)生長。如果不及時傳代，這些轉化的細胞就會逐步取代正常的細胞。四、動物細胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制種質細胞：體細胞、雜交瘤細胞；工藝過程：種質細胞胰蛋白酶懸浮細胞懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)收集培養(yǎng)液分離純化動物細胞培養(yǎng)工藝過程（一）動物細胞培養(yǎng)基組成成分1、氨基酸：各種必需氨基酸，谷氨酰胺等，作為碳源和能源利用；2、維生素：血清中，B