植物病毒病的診斷與鑒定

植物病毒病的診斷與鑒定2010級(jí)3班陽植物病毒病的診斷與鑒定植物病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與組分

2植物病毒病的概況

1植物病毒的鑒定

4植物病毒病的癥狀特點(diǎn)

3植物病毒病的綜合防治

51.植物病毒病的概況病毒（Virus）是包被在蛋白或脂蛋白保護(hù)性衣殼中，只能在適合的寄主細(xì)胞內(nèi)完成自身復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)基因組的核酸分子，又稱分子寄生物。病毒區(qū)別于其他生物的主要特征是：1.病毒是個(gè)體微小的分子寄生物，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；2.專性寄生物，其繁殖需要寄主提供原料和場(chǎng)所。按寄主性的不同，病毒分為寄生植物的植物病毒(PlantVirus)、寄生動(dòng)物的動(dòng)物病毒以及寄生細(xì)菌的噬菌體等。1.植物病毒病的概述病毒引起的病害在數(shù)量上占植物病害的第二位。由植物病毒引起的植物病害的植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫蘆科等。在遼寧省引起毀滅性的植物病毒病有番茄蕨葉病毒病，辣椒花葉病毒病和煙草脈壞死病毒病等。生產(chǎn)上危害較大的植物病毒病害有：煙草花葉病、黃瓜花葉病、馬鈴薯病毒病、玉米矮花葉病等。植物病毒也有可利用的價(jià)值，特別在開發(fā)基因工程的載體、轉(zhuǎn)基因植物研究等方面，發(fā)揮了很大的作用。植物病毒的危害及作用1.植物病毒病的概述植物病毒學(xué)研究歷史：1886年梅耶爾(Mayer)證明了煙草花葉病害的摩擦傳染性;1892年伊凡諾夫斯基(Ivanowski)發(fā)現(xiàn)了煙草花葉病的病原可以通過細(xì)菌過濾器；1898年伯吉林克(Beijeincku)又發(fā)現(xiàn)該病原不是微生物，而是一種傳染性活液(contagiumvivumfluidum)，這就是Virus一詞的來源；1935年，美國(guó)科學(xué)家斯坦利（Stanley）獲得了煙草花葉病毒的蛋白結(jié)晶,認(rèn)為病毒是可在活細(xì)胞內(nèi)增殖的蛋白（1946年獲NobelPrizeinChemistry)。1.植物病毒病的概述植物病毒學(xué)研究歷史：1936年英國(guó)科學(xué)家鮑登(Bawden)證明提純的TMV中含有核酸；l939年Kausch通過電子顯微鏡觀察到植物病毒的形態(tài)；1956年Gierrer證明去掉蛋白質(zhì)的RNA起重要侵染和繁殖作用；1971年Diener發(fā)現(xiàn)了很小的RNA（250-400bps)稱為類病毒（viroid);1982年發(fā)現(xiàn)僅有蛋白質(zhì)的月元病毒2/5/20231.植物病毒病的概述

植物病毒學(xué)研究歷史：

1981年，A.Lwoff在巴黎舉行的第五屆病毒學(xué)大會(huì)上，這一法國(guó)病毒研究所所長(zhǎng)阿爾．沃夫，認(rèn)為病毒不是生物，他的觀點(diǎn)如下：生長(zhǎng)和分裂獨(dú)立進(jìn)化獨(dú)立的生命體活的原生生物＋＋＋＋細(xì)胞＋－－＋線粒體和葉綠體＋－－－膜＋－－－染色體、質(zhì)體含核酸－－－－病毒－－－－綜上所述，認(rèn)為病毒是有機(jī)物，而不是生物。2/5/20231.植物病毒的概述

植物病毒的命名植物病毒的名稱目前不采用拉丁文雙名法，仍以寄主英文俗名加上癥狀來命名，如煙草花葉病毒為Tobaccomosaicvirus，縮寫為TMV；黃瓜花葉病毒為Cucumbermosaicvirus，縮寫為CMV。屬名為專用國(guó)際名稱，常由典型成員寄主名稱(英文或拉丁文)縮寫十主要特點(diǎn)描述(英文或拉丁文)縮寫十virus拼組而成。如：黃瓜花葉病毒屬的學(xué)名為Cucu—mo—virus；煙草花葉病毒屬為Toba—mo—virus。即植物病毒屬的結(jié)尾是一virus，科、屬名書寫時(shí)應(yīng)用斜體，而種和株系的書寫不采用斜體。類病毒(viroid)在命名時(shí)遵循相似于病毒的規(guī)則，因縮寫名易與病毒混淆，新命名規(guī)則規(guī)定類病毒的縮寫為Vd，如馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potatospindletuberviroid)縮寫為PSTVd。2/5/20232.植物病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與組成

2.1植物病毒的形態(tài)觀察需要電子顯微鏡，度量尺度為納米(nm)。植物病毒的基本形態(tài)為球狀、桿狀和線條狀。球狀病毒的直徑大多在20一35nm，少數(shù)可以達(dá)到70-80nm，球狀病毒也稱為多面體病毒或二十面體(icosahedralparticle)病毒。桿狀病毒多為20-80nm×100-250nm，兩端平齊；少數(shù)兩端鈍圓，線狀病毒多為11—13nm×750nm，個(gè)別可以達(dá)到2000nm以上。還有少數(shù)病毒與以上形態(tài)不同，它們有的看上去是兩個(gè)球狀病毒聯(lián)合在一起，被稱為雙聯(lián)病毒(或雙生病毒)；有的像彈頭，被稱為彈狀病毒；還有的呈絲線狀，柔軟不定形。2/5/20232.2植物病毒的結(jié)構(gòu)中間核酸，外為蛋白質(zhì)衣殼，由許多蛋白質(zhì)亞基組成，核酸和蛋白質(zhì)亞基均呈螺旋狀排列。桿狀或條狀病毒的粒體是空心的。

TMV為棒狀，CMV球狀的。球狀病毒：20面體，蛋白質(zhì)亞基為60個(gè)或60的倍數(shù)，蛋白質(zhì)亞基在每個(gè)面上不呈螺旋狀排列，鑲嵌在表面，粒體中心也是空的。核酸鏈排列還不清楚。2/5/20232.3植物病毒的組成植物病毒主要成分是核酸和蛋白質(zhì)，核酸在內(nèi)部，外部由蛋白質(zhì)包被，稱為外殼，有的病毒粒體中還含有少量的糖蛋白或脂類。構(gòu)成病毒的成分：核酸5--40%，蛋白質(zhì)60-95%，還有水分和礦物質(zhì)等。類病毒和擬病毒無蛋白衣殼，無?；匝鍖W(xué)反應(yīng)，真病毒有?；匝宸磻?yīng)。2/5/20232/5/2023植物病毒主要類型1.長(zhǎng)而彎曲的線狀粒體2.僵直的桿狀粒體3.示桿狀或線狀病毒核酸與蛋白亞基的排列4.桿菌狀粒體5.桿菌狀粒體橫切面6.多角體病毒粒體7.二十面體的核酸與蛋白亞基的排列3.植物病毒病的癥狀特征一、外部癥狀(Symptom)：病毒病害在癥狀表現(xiàn)上多為系統(tǒng)發(fā)病，表現(xiàn)為變色、畸形，少數(shù)引起壞死、腐爛，萎蔫極少發(fā)生。變色：花葉(mosaic)，黃化(yellow)。

壞死(negrosis)：也稱作枯斑反應(yīng)，如TMV侵染心葉煙表現(xiàn)為壞死枯斑，馬鈴薯Ｙ病毒的某些株系侵染煙草可產(chǎn)生脈壞死。

畸形：抑制型：矮化(dwarf)，卷葉(leafroll)，皺葉(rugose)，蕨葉(fernleaf)。

刺激型：叢生(rosette)，腫瘤(tumor)。2/5/20232/5/20232/5/2023花葉（變色界限明顯）2/5/2023葉片卷曲3.植物病毒病的癥狀特征二、

病組織的內(nèi)部和細(xì)胞的變化：

1.組織變化：組織壞死：如煙草花葉病毒TMV，它侵染心葉煙引起薄壁組織壞死，有些引起莖部維管束和葉部壞死，煙草花葉病毒侵染大豆引起頂芽和側(cè)枝壞死。一般引起黃化類型的病毒病多是因輸導(dǎo)組織、韌皮部壞死引起。組織增生：病毒侵染后，寄主植物體內(nèi)代謝失調(diào)，產(chǎn)生激素，引起增生。2/5/20232/5/20233.植物病毒病的癥狀特征2.細(xì)胞的變化：

花葉和斑駁是由于細(xì)胞內(nèi)葉綠素遭到破壞所致。

內(nèi)含體(inclussion)：某些植物被病毒侵染后，在病組織中產(chǎn)生的一種特殊結(jié)構(gòu)，存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，在顯微鏡下可以觀察到。分為不定型內(nèi)含體Ｘ－體和結(jié)晶體。結(jié)晶體：有六角型、長(zhǎng)條型、正四面體型等，個(gè)別的還有皿狀，無色透明，主要是由病毒粒體和寄主的蛋白質(zhì)有規(guī)則地排列形成。Ｘ－體：無一定形狀，半透明，通常外有一層膜，也是由病毒粒體和寄主物質(zhì)構(gòu)成

內(nèi)含體的作用：①植物患病毒病后才有，因此，可作為一種診斷的指標(biāo)。②但并不是所有的病毒病都有內(nèi)含體，有些必須發(fā)育到一定階段才形成，同時(shí)一種病毒還可有多種形態(tài)的內(nèi)含體，因此，單靠?jī)?nèi)含體診斷還有一定的局限性。

2/5/20232/5/20233.植物病毒病的癥狀特征三、患病植物的生理變化：表現(xiàn)為：①病毒侵染后呼吸強(qiáng)度先上升，后下降。②碳水化合物含量下降。③淀粉在葉部積累引起黃化。④多酚氧化酶和細(xì)胞色素氧化酶的活性增強(qiáng)，使細(xì)胞中毒壞死。⑤光合作用下降，破壞了寄主的葉綠素。⑥植物內(nèi)源激素水平失去平衡，造成畸形。2/5/20233.植物病毒病的癥狀特征四、癥狀變化：一種病毒引起的癥狀可因病毒、寄主和環(huán)境三方面的因素而改變。

1.病毒本身：

①病毒的株系(Strain)：同一種病毒在致病性上也有差異，也稱為病毒的生理小種，為了便于與真菌生理小種的區(qū)別，稱為株系。有強(qiáng)株系(癥狀表現(xiàn)明顯，危害較大)和弱株系(癥狀不太明顯)。如：TMV(弱株系)番茄花葉或斑駁

TMV番茄條斑株系(強(qiáng)株系)壞死，條斑

TMV弱株系侵染煙草引起輕微斑駁，強(qiáng)株系則引起嚴(yán)重花葉。2/5/2023TMV（煙草花葉病毒）3.植物病毒病的癥狀特征②交互保護(hù)作用(crossprotection)：同一種病毒的弱株系先接種植物后，就可以保護(hù)寄主免受病毒強(qiáng)株系的嚴(yán)重傷害，即先侵染的病毒可以保護(hù)植物不再受親緣關(guān)系較近的另一種病毒的侵染。如果兩種病毒無親緣關(guān)系則沒有這種保護(hù)作用。③拮抗作用和協(xié)生作用：

拮抗作用：一種病毒侵染寄主植物后，可抑制另一種病毒再對(duì)植物的侵染。如煙草蝕紋病毒可抑制天仙子花葉病毒和馬鈴薯Ｙ病毒對(duì)煙草的侵染。

協(xié)生作用：兩種病毒侵染一種寄主植物后，可使癥狀比單獨(dú)侵染時(shí)更為嚴(yán)重，加劇為害。如：番茄花葉病毒輕微斑駁>番茄壞死馬鈴薯Ｘ病毒輕微斑駁

2/5/20233.植物病毒病的癥狀特征2.寄主因素：①一種病毒在不同寄主上可表現(xiàn)不同癥狀。如：TMV普通煙──全株型花葉癥狀心葉煙──局部性壞死枯斑②潛伏侵染：一種病毒感染某些植物后，可以侵染但不表現(xiàn)癥狀的現(xiàn)象。如：小麥黃矮病毒在除小麥之外的禾本科作物上不表現(xiàn)癥狀。③同一種病毒侵染同種寄主的不同品種上表現(xiàn)不同：

a.抗病品種：產(chǎn)生局部枯斑反應(yīng)。TMV──心葉煙。

b.高抗或免疫品種品種：病毒侵入后增殖量很少或不能增殖。

c.耐病品種：侵染寄主后可大量繁殖，但表現(xiàn)癥狀很輕微，這與真菌耐病性不同。2/5/20233.植物病毒病的癥狀特征3.環(huán)境因素：環(huán)境因素可抑制或改變癥狀的表現(xiàn)。（1）溫度：〉35℃或〈10℃病害癥狀輕微，特別是對(duì)于花葉病，如油菜花葉病和TMV。隱癥：已經(jīng)表現(xiàn)病毒病癥狀的植株，由于環(huán)境條件改變，癥狀消失的現(xiàn)象。這種隱癥在條件合適時(shí)又可重新表現(xiàn)癥狀。隱癥：條件不同。潛伏侵染：寄主不同。（2）光照：過強(qiáng)、過弱都會(huì)影響癥狀的表現(xiàn)。多數(shù)在光弱時(shí)花葉病癥狀容易表現(xiàn)，接種易成功2/5/2023植物病毒的分類是將已知病毒按一定標(biāo)準(zhǔn)、相似程度或相關(guān)性的順序排列，拼成一個(gè)系統(tǒng)，即分類系統(tǒng)。植物病毒鑒定的主要目的是確定一種病毒在分類系統(tǒng)中的地位，由于植物病毒個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，對(duì)寄主的依賴性強(qiáng)，鑒定工作難度大，技術(shù)性強(qiáng)，對(duì)工作條件的要求高。鑒定植物病毒過去大多采用病毒間生物學(xué)特性的差異，如所致癥狀類型、傳播方式、寄主范圍等；現(xiàn)在則增加了病毒核酸、蛋白分子生物學(xué)、生物化學(xué)等方面的方法。常用的方法有生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)檢測(cè)和電子顯微鏡觀察等。2/5/20234.植物病毒的鑒定一、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的目的是確定病原的侵染性，用實(shí)驗(yàn)方法證明病毒與病害的直接相關(guān)性。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)還可以確定病毒的傳播方式，明確病毒所致病害的癥狀類型和寄主范圍。在分子生物學(xué)技術(shù)尚欠發(fā)展的過去，只有生物學(xué)方法可以區(qū)分在遺傳信息上一個(gè)核苷酸或者蛋白質(zhì)中一個(gè)氨基酸的變異，因此生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是其它實(shí)驗(yàn)方法所不可取代的。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的是鑒別寄主，即用來鑒別病毒或其株系的具有待定反應(yīng)的植物。凡是病毒侵染后能產(chǎn)生快而穩(wěn)定、并具有特征性癥狀的植物都可作為鑒別寄主。組合使用的幾種或一套鑒別寄主稱為鑒別寄主譜。鑒別寄主譜中一般包括可系統(tǒng)侵柒的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主。如若區(qū)分經(jīng)常出現(xiàn)的黃瓜花葉病毒屬的三個(gè)成員，采用表4—1的鑒別寄主。。2/5/2023表4-1黃瓜花葉病毒屬三種病毒

在鑒別寄主植物上的癥狀反應(yīng)

鑒別寄主 黃瓜花葉病毒 花生矮化病毒番茄不孕病毒

花生無病癥褪綠，矮花葉無癥狀菊花不侵染？侵染黃瓜花葉花葉無花葉 2/5/2023二、電子顯微鏡技術(shù)與光學(xué)顯微鏡相比，電子顯微鏡使用光源的波長(zhǎng)更短(屬于短波電子流)，因此分辨率也大大提高(9.9×l0-11m，比光學(xué)顯微鏡高千倍以上)。但是電子束的穿透力低，樣品厚度必須在10~100nm之間。所以電鏡觀察需要特殊的載網(wǎng)和支持膜，需要復(fù)雜的制樣和切片過程。病毒觀察最常用的是負(fù)染技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)。所謂負(fù)染，是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外圍的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。與超薄切片(正染色)技術(shù)相比，負(fù)染不僅快速簡(jiǎn)易，而且分辨率高，目前廣泛用于生物大分子、細(xì)菌、原生動(dòng)物、亞細(xì)胞碎片、分離的細(xì)胞器、蛋白晶體的觀察及免疫學(xué)和細(xì)胞化學(xué)的研究工作中，尤其是病毒的快速鑒定及其結(jié)構(gòu)研究所必不可少的一項(xiàng)技術(shù)。2/5/2023三、血清學(xué)技術(shù)

抗血清制備：利用植物病毒衣殼蛋白的抗原(antigen)特性，可以制備病毒特異性的抗血清(antiserum)。先將純化的植物病毒注射小動(dòng)物(兔子、小白鼠、雞等)，一定時(shí)間后取血，獲得抗血清。血清制備的關(guān)鍵是病毒的純化，純度高的病毒才能獲得特異性強(qiáng)的抗血清。血清反應(yīng)植物病毒與其血清的反應(yīng)有好多種，但依據(jù)的原理都是抗原與抗體的特異性結(jié)合。最常用的兩種方法是瓊脂雙擴(kuò)散和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。2/5/2023瓊脂雙擴(kuò)散法：在一定濃度的瓊脂凝膠中，抗體和抗原互相擴(kuò)散，在適當(dāng)?shù)奈恢眯纬沙恋恚怀恋砭€的形狀說明抗原和抗體的相互關(guān)系。酶聯(lián)免疫吸附(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)法：該方法利用了酶的放大作用，使免疫檢測(cè)的靈敏度大大提高。與其它檢測(cè)方法相比較，ELISA有突出的優(yōu)點(diǎn)：一是靈敏度高，檢測(cè)濃度可達(dá)1-10ng／m1;二是快速，結(jié)果可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)得到；三專化性強(qiáng)，重復(fù)性好；四是檢測(cè)對(duì)象廣，可用于粗汁液或提純液，對(duì)完整的和降解的病毒粒體都可檢測(cè)，一般不受抗原形態(tài)的影響；五是適用于處理大批樣品，所用基本儀器簡(jiǎn)單，試劑價(jià)格較低,且可較長(zhǎng)期保存。具有自動(dòng)化及試劑盒的發(fā)展?jié)摿ΑLISA是實(shí)現(xiàn)“快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)”檢測(cè)的最好手段之一2/5/2023四、核酸雜交及PCR技術(shù)血清學(xué)技術(shù)利用的是病毒衣殼蛋白的抗原性，檢測(cè)的目標(biāo)是蛋白。由于核酸才是有侵染性的，僅僅檢測(cè)到蛋白并不能肯定病毒有無生物活性。因此，核酸檢測(cè)技術(shù)也是鑒定植物病毒的更可靠方法，主要有核酸雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法比較常用。核酸雜交主要在DNA和RNA之間進(jìn)行，依據(jù)是RNA與互補(bǔ)的DNA之間存在著堿基的互補(bǔ)關(guān)系。在一定的條件下，RNA--DNA形成異質(zhì)雙鏈的過程稱為雜交。其中預(yù)先分離純化或合成的已知核酸序列片段叫做雜交探針(Probe)，由于大多數(shù)植物病毒的核酸是RNA，其探針為互補(bǔ)DNA(complementaryDNA，cDNA)，也稱為cDNA探針。核酸檢測(cè)不僅可以檢測(cè)到目標(biāo)病毒的核酸，而且還可以檢測(cè)出相近病毒(或核酸)間的同源程度。2/5/2023聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增核酸的有效方法，用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。從已知序列合成兩段寡聚核苷酸作為反應(yīng)的引物，它們分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補(bǔ)且位于待擴(kuò)增DNA區(qū)段的兩側(cè)。反應(yīng)時(shí)，首先在過量的兩種引物及4種dNTP參與下對(duì)模板DNA進(jìn)行加熱變性。隨之將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度使引物與其靶序列發(fā)生退火。此后退火引物在耐熱的洲A聚合酶作用下得以延伸。如此反復(fù)進(jìn)行變性、退火和DNA合成這一循環(huán)。每完成一個(gè)循環(huán)，理論上就使目的DNA產(chǎn)物增加1倍，在正常反應(yīng)條件下，經(jīng)25—30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)百萬。

PCR擴(kuò)增在檢測(cè)標(biāo)本中病原的核酸序列、由少量RNA生成cDNA文庫、生成大量DNA以進(jìn)行序列測(cè)定、突變的分析等方向已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。2/5/2023五、物理化學(xué)等特征在植物病毒研究的過程中，人們發(fā)現(xiàn)不同的病毒對(duì)外界條件的穩(wěn)定性不同，這便成為區(qū)別不同病毒的依據(jù)之一。隨著新病毒種類的發(fā)現(xiàn)和分子生物學(xué)研究的深入，人們也逐漸認(rèn)識(shí)到這些物理特性在區(qū)分不同病毒中的局限性。1.稀釋限點(diǎn)(DilutionEndPoint，DEP)保持病毒侵染力的最高稀釋度，用10-1，10-2，10-3……表示，它反映了病毒的體外穩(wěn)定性和侵染能力，也象征著病毒濃度的高低。2.鈍化溫度(ThermalInactivationPoint,TIP)處理十分鐘使病毒喪失活性的最低溫用攝