-土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

尿素分子的立體結(jié)構(gòu)土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對照（一）篩選菌株水生耐熱細(xì)菌Taq(Thermus

aquaticus

)——耐高溫的TaqDNA聚合酶美國微生物學(xué)科布魯克1966年發(fā)現(xiàn)耐熱細(xì)菌在尋找目的菌株時(shí)，要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。1、實(shí)驗(yàn)室微生物的篩選原理（P21）

人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。（一）篩選菌株2、選擇培養(yǎng)基

在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。（一）篩選菌株1.在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？碳源是葡萄糖，氮源是尿素2.分析該配方的培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果有，又是如何進(jìn)行選擇的？有篩選作用。尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。閱讀22頁本課題使用的培養(yǎng)基配方（二）微生物計(jì)數(shù)1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法1mm每一個(gè)大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。1mm下面以一個(gè)大方格有25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算：設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個(gè)大方格中的總菌數(shù)是多少?1ml菌液中的總菌數(shù)?(1ml=1cm3=1000mm3）

5AB×1045A缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)2、濾膜法

以測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目為例。將已知體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)液基上培養(yǎng)。在該培養(yǎng)基上，大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色。可以根據(jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目，計(jì)算出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。（二）微生物計(jì)數(shù)3、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目——稀釋涂布平板法酵母菌的菌落特征：菌落形態(tài)特征與細(xì)菌相似，但比細(xì)菌大而厚，菌落表面光滑、濕潤、粘稠，多數(shù)不透明

，容易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落顏色單調(diào)，菌落多為乳白色，少數(shù)為紅色，個(gè)別為黑色。（二）微生物計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。③為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。④統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。平板菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)注意事項(xiàng)1、幾個(gè)菌落粘連一起，只要肉眼能區(qū)分，就算幾個(gè)2、不管菌落大小，只要肉眼看得見，就應(yīng)該計(jì)數(shù)；3、菌落數(shù)目過多時(shí)，可以合理采用樣方法。菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)表格（取樣0.1mL,稀釋倍數(shù)106）第1組第2組第3組第4組123456平均每mL樣品中活菌數(shù)平板組別恰當(dāng)?shù)南♂尪?、正確的涂布操作是成功地統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。思考1：如何根據(jù)平板上的菌落數(shù)推測出每mL樣品中的菌株數(shù)？

統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，計(jì)算出平板上的菌落數(shù)的平均值，然后按公式每mL樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）×M進(jìn)行計(jì)算。C：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V：涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積M：稀釋倍數(shù)思考2：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的際數(shù)目高還是低，為什么？

低。因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。思考3：為了增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說服力和準(zhǔn)確性，我們在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該怎么做更合理？

實(shí)例分析1

第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了三個(gè)平板，但是其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另外2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。

實(shí)例啟示1、在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力和準(zhǔn)確性。2、在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。（三）實(shí)驗(yàn)基本原則1、平行重復(fù)原則實(shí)例分析2想一想：A同學(xué)和其他同學(xué)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異如此之大，請分析原因可能有哪些？①②實(shí)例分析2想一想：你能通過設(shè)置對照，幫助A同學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素嗎？一種方案：可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。實(shí)例分析想一想：你能通過設(shè)置對照，幫助A同學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素嗎？另一種方案：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的！

實(shí)例啟示設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)的目的是什么？

排除實(shí)驗(yàn)操作、培養(yǎng)條件等無關(guān)變量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。（三）實(shí)驗(yàn)基本原則1、平行重復(fù)原則2、對照原則3、單一變量原則設(shè)置對照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置對照：設(shè)置對照的方法：空白對照：不給對照組任何處理因素。條件對照：給對照組施以部分實(shí)驗(yàn)因素，但不是所要研究的處理因素。自身對照：對照組和實(shí)驗(yàn)組都在同一研究對象上進(jìn)行。相互對照：不單設(shè)對照組，而是幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組相互對照。

A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同；二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。實(shí)驗(yàn)名稱：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模翰牧嫌镁撸簩?shí)驗(yàn)步驟：1、分組編號

2、處理（遵循實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本原則）對照原則、單一變量原則（等量原則）科學(xué)性原則、平行重復(fù)原則可行性原則

3、觀察記錄（設(shè)計(jì)觀察記錄表）實(shí)驗(yàn)預(yù)期：實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與評價(jià)：實(shí)驗(yàn)結(jié)論：設(shè)計(jì)時(shí)請利用P23-P24的三個(gè)資料資料一.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。

將10g土樣加入盛有90mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，充分搖勻，吸取上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。資料

二.樣品的稀釋

由于初次實(shí)驗(yàn)，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細(xì)菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？

答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。思考題

將涂布好的培養(yǎng)皿放在30℃溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生。

以表格的形式記錄選擇培養(yǎng)基中不同菌落的特征。

資料三.微生物的培養(yǎng)與觀察

[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標(biāo)記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]規(guī)劃時(shí)間1、結(jié)