-土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

尿素分子的立體結(jié)構(gòu)土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌一.研究思路㈠.篩選菌株㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目㈢.設(shè)置對照（一）篩選菌株水生耐熱細菌Taq(Thermus

aquaticus

)——耐高溫的TaqDNA聚合酶美國微生物學科布魯克1966年發(fā)現(xiàn)耐熱細菌在尋找目的菌株時，要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。1、實驗室微生物的篩選原理（P21）

人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。（一）篩選菌株2、選擇培養(yǎng)基

在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。（一）篩選菌株1.在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？碳源是葡萄糖，氮源是尿素2.分析該配方的培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果有，又是如何進行選擇的？有篩選作用。尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。閱讀22頁本課題使用的培養(yǎng)基配方（二）微生物計數(shù)1、顯微鏡直接計數(shù)法1mm每一個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm，所以計數(shù)室的容積為0.1mm3。1mm下面以一個大方格有25個中方格的計數(shù)板為例進行計算：設(shè)五個中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個大方格中的總菌數(shù)是多少?1ml菌液中的總菌數(shù)?(1ml=1cm3=1000mm3）

5AB×1045A缺點：不能區(qū)分死菌與活菌1、顯微鏡直接計數(shù)：利用血細胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。㈡.統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點2、濾膜法

以測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目為例。將已知體積的水過濾后，將濾膜放在伊紅美藍培養(yǎng)液基上培養(yǎng)。在該培養(yǎng)基上，大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色?？梢愿鶕?jù)培養(yǎng)基上黑色菌落的數(shù)目，計算出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。（二）微生物計數(shù)3、統(tǒng)計菌落數(shù)目——稀釋涂布平板法酵母菌的菌落特征：菌落形態(tài)特征與細菌相似，但比細菌大而厚，菌落表面光滑、濕潤、粘稠，多數(shù)不透明

，容易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落顏色單調(diào)，菌落多為乳白色，少數(shù)為紅色，個別為黑色。（二）微生物計數(shù)注意事項①為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進行計數(shù)。②涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為最好。③為使結(jié)果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。④統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。平板菌落數(shù)統(tǒng)計注意事項1、幾個菌落粘連一起，只要肉眼能區(qū)分，就算幾個2、不管菌落大小，只要肉眼看得見，就應(yīng)該計數(shù)；3、菌落數(shù)目過多時，可以合理采用樣方法。菌落數(shù)統(tǒng)計表格（取樣0.1mL,稀釋倍數(shù)106）第1組第2組第3組第4組123456平均每mL樣品中活菌數(shù)平板組別恰當?shù)南♂尪?、正確的涂布操作是成功地統(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。思考1：如何根據(jù)平板上的菌落數(shù)推測出每mL樣品中的菌株數(shù)？

統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，計算出平板上的菌落數(shù)的平均值，然后按公式每mL樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）×M進行計算。C：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V：涂布平板時所用的稀釋液的體積M：稀釋倍數(shù)思考2：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的際數(shù)目高還是低，為什么？

低。因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。思考3：為了增強實驗結(jié)果的說服力和準確性，我們在實驗設(shè)計時應(yīng)該怎么做更合理？

實例分析1

第一位同學只涂布了一個平板，沒有設(shè)置重復組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學考慮到設(shè)置重復組的問題，涂布了三個平板，但是其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另外2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。

實例啟示1、在實驗設(shè)計時，一定要涂布至少3個平板作為重復組，才能增強實驗的說服力和準確性。2、在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮所設(shè)置的重復組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。（三）實驗基本原則1、平行重復原則實例分析2想一想：A同學和其他同學所得實驗結(jié)果差異如此之大，請分析原因可能有哪些？①②實例分析2想一想：你能通過設(shè)置對照，幫助A同學排除上述兩個可能影響實驗結(jié)果的因素嗎？一種方案：可以由其他同學用與A同學一樣的土樣進行實驗。如果結(jié)果與A同學一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。實例分析想一想：你能通過設(shè)置對照，幫助A同學排除上述兩個可能影響實驗結(jié)果的因素嗎？另一種方案：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。

實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的！

實例啟示設(shè)置對照實驗的目的是什么？

排除實驗操作、培養(yǎng)條件等無關(guān)變量對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。（三）實驗基本原則1、平行重復原則2、對照原則3、單一變量原則設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。㈢.設(shè)置對照：設(shè)置對照的方法：空白對照：不給對照組任何處理因素。條件對照：給對照組施以部分實驗因素，但不是所要研究的處理因素。自身對照：對照組和實驗組都在同一研究對象上進行。相互對照：不單設(shè)對照組，而是幾個實驗組相互對照。

A同學的結(jié)果與其他同學不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同；二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。實驗名稱：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)實驗原理：實驗?zāi)康模翰牧嫌镁撸簩嶒灢襟E：1、分組編號

2、處理（遵循實驗設(shè)計的基本原則）對照原則、單一變量原則（等量原則）科學性原則、平行重復原則可行性原則

3、觀察記錄（設(shè)計觀察記錄表）實驗預(yù)期：實驗結(jié)果的分析與評價：實驗結(jié)論：設(shè)計時請利用P23-P24的三個資料資料一.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。

將10g土樣加入盛有90mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，充分搖勻，吸取上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。資料

二.樣品的稀釋

由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？

答：這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應(yīng)當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。思考題

將涂布好的培養(yǎng)皿放在30℃溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生。

以表格的形式記錄選擇培養(yǎng)基中不同菌落的特征。

資料三.微生物的培養(yǎng)與觀察

[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]規(guī)劃時間1、結(jié)