第四章 蛋白質(zhì)

第一章蛋白質(zhì)的化學(xué)ChemistryofProtein什么是蛋白質(zhì)(protein)?

由許多氨基酸通過(guò)肽鍵相連形成的高分子含氮化合物生物學(xué)重要性組成成分參與多種生理功能氧化供能——生命的“執(zhí)行者”第一節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成TheMolecularComponentofProtein一、元素組成主要元素:C、H、O、

、S微量元素:鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬、磷、碘N16%樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=樣品含氮克數(shù)×6.25（一）氨基酸結(jié)構(gòu)組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅20種α-氨基酸(Pro除外)L-氨基酸(Gly除外)二、氨基酸(aminoacids)αα-氨基酸結(jié)構(gòu)通式

脯氨酸

Pro（亞氨基酸）L-氨基酸的通式RCH3丙氨酸H甘氨酸

（二）氨基酸的分類(lèi)1.依據(jù)R基團(tuán)分類(lèi)非極性氨基酸極性不帶電荷氨基酸帶負(fù)電荷氨基酸帶正電荷氨基酸非極性疏水性氨基酸甘氨酸

glycine

Gly

G

丙氨酸

alanineAlaA

纈氨酸

valineValV

亮氨酸

leucine

LeuL

異亮氨酸

isoleucineIleI

苯丙氨酸

phenylalaninePheF

脯氨酸

prolineProP

色氨酸

tryptophanTryW

絲氨酸

serineSerS

酪氨酸

tyrosineTryY

半胱氨酸

cysteine

CysC

蛋氨酸

methionine

MetM

天冬酰胺

asparagine

AsnN

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

蘇氨酸

threonine

ThrT2.極性中性氨基酸天冬氨酸

asparticacidAspD

谷氨酸

glutamicacidGluE

賴氨酸

lysineLysK

精氨酸

arginine

ArgR

組氨酸

histidineHisH

3.酸性氨基酸4.堿性氨基酸特殊分類(lèi)含硫：Cys、Met含酰胺：Asn、Gln含羥基：Ser、Thr、Tyr芳香族：Phe、Tyr、Trp支鏈：Val、Leu、Ile含胍基——Arg；含咪唑基——His

含吲哚基——Trp

（二）氨基酸的分類(lèi)（二）氨基酸的分類(lèi)按營(yíng)養(yǎng)需要營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸營(yíng)養(yǎng)非必需氨基酸Met、Val、Lys、IlePhe、Leu、Trp、Thr

特殊氨基酸+-HH胱氨酸二硫鍵第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)TheMolecularStructureofProtein若讓你研究一個(gè)未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，你最先想弄清什么？隨后你該如何由簡(jiǎn)單到復(fù)雜地研究？一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象一、一級(jí)結(jié)構(gòu)1.定義蛋白質(zhì)分子中氨基酸的連接方式、排列順序和二硫鍵所在的位置2.維系鍵肽鍵,有些包括二硫鍵3.肽鍵(peptidebond)

由一個(gè)氨基酸的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵4.肽(peptide)由氨基酸通過(guò)肽鍵縮合而形成的化合物兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……十個(gè)以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)肽鏈中的氨基酸分子因?yàn)槊撍s合而基團(tuán)不全，被稱為氨基酸殘基(residue)多肽鏈的書(shū)寫(xiě)與命名書(shū)寫(xiě)：一般叢N末端向C末端書(shū)寫(xiě)，書(shū)寫(xiě)多肽鏈時(shí)可用略號(hào)，N端寫(xiě)于左側(cè)，用H做標(biāo)幟，C端于右側(cè)用OH表示。肽詳細(xì)命名：某某酰某某?！衬乘帷?/p>

蘇氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸

Ala-Gly-Pro-His和His-Pro-Gly-Ala是否為同一物質(zhì)？

5.一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定氨基酸的組成氨基酸的排列順序氨基酸組成的分析樣品純化（均一）確定多肽鏈數(shù)N末端分析C末端分析完全水解氨基酸測(cè)定

N末端分析方法二硝基氟苯法（DNFB）二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）Edman降解法氨肽酶法

DNFB法蛋白質(zhì)（多肽）A+DNFBDNP蛋白質(zhì)（多肽）A氨基酸DNPA

Edman

降解法蛋白質(zhì)（多肽）A+PITCPTC蛋白質(zhì)（多肽）APTHA蛋白質(zhì)（多肽）

C末端分析方法肼解法羧肽酶法A:脂肪族或芳香族B:堿性氨基酸C:ProY:各種C端氨基酸氨基酸順序的測(cè)定蛋白質(zhì)（多肽）裂解酶解法化學(xué)法肽譜重疊分析酶解法（內(nèi)肽酶）LysArg

aa

Phe

Trp

Tyr疏水a(chǎn)a

疏水a(chǎn)a

胰蛋白酶

糜蛋白酶胰凝乳蛋白酶

胃蛋白酶

化學(xué)法溴化氰Met（羧基肽鍵）羥胺Asn—Gly（Leu；Ala）例題今有一個(gè)七肽，經(jīng)分析氨基酸組成為L(zhǎng)ys

、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未經(jīng)糜蛋白酶處理時(shí)，與FDNB反應(yīng)不產(chǎn)生-DNP-氨基酸。經(jīng)糜蛋白酶作用后為兩個(gè)肽段，分別為Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。此肽段分別與FDNB反應(yīng)，可分別產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys。若與胰蛋白酶反應(yīng)也生成兩段肽，分別為Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。試問(wèn)此七肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)怎樣？氨基酸序列分析分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測(cè)定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析測(cè)定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過(guò)組合排列對(duì)比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。通過(guò)核酸來(lái)推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列分離編碼蛋白質(zhì)的基因測(cè)定DNA序列排列出mRNA序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列二、空間構(gòu)象（一）定義蛋白質(zhì)分子中原子和基團(tuán)在三維空間

上的排列。主鏈構(gòu)象側(cè)鏈構(gòu)象二、空間構(gòu)象（二）維系鍵：次級(jí)鍵氫鍵范德華力疏水鍵離子鍵二硫鍵二、空間構(gòu)象空間構(gòu)象按的范圍及復(fù)雜度分為二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)

（三）二級(jí)結(jié)構(gòu)1.定義指蛋白質(zhì)分子中某段肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象2.維系鍵氫鍵肽平面肽平面成為肽鏈盤(pán)曲折疊的基本單位

肽鏈以肽平面為單位可形成幾種構(gòu)型?α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角無(wú)規(guī)則卷曲

-螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)右手螺旋每3.6個(gè)氨基酸殘基上升一圈，相當(dāng)于0.54nm每一個(gè)氨基酸殘基中的NH和前面相隔三個(gè)殘基的C＝O之間形成氫鍵側(cè)鏈R分布在螺旋外側(cè)，其形狀、大小及電荷影響α－螺旋的形成-折疊-折疊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)肽鏈相當(dāng)伸展，肽平面之間折疊成鋸齒狀，相鄰肽平面間呈110°角。氨基酸殘基的R側(cè)鏈伸出在鋸齒的上方或下方。兩條肽鏈或一條肽鏈內(nèi)的兩段肽鏈間的C＝O與H形成氫鍵兩段肽鏈可以是平行的，也可以是反平行的.正、反平行能相互交替,平行的結(jié)構(gòu)中，兩個(gè)殘基的間距為0.65nm；反平行的結(jié)構(gòu)，則間距為0.7nm。

β-轉(zhuǎn)角四個(gè)AA殘基的1位-CO-與4位-NH-形成氫鍵,造成180°回折,其封閉環(huán)含10個(gè)原子無(wú)規(guī)卷曲是用來(lái)闡述沒(méi)有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。

(四)超二級(jí)結(jié)構(gòu)（基序）1.定義在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個(gè)有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合2.組合形式

；；

(四)超二級(jí)結(jié)構(gòu)3.模體(motif)是具有特殊功能的超二級(jí)結(jié)構(gòu)，它是由兩個(gè)或三個(gè)具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個(gè)特殊的空間構(gòu)象。鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體鋅指結(jié)構(gòu)

（五）三級(jí)結(jié)構(gòu)1.定義整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置.2.維系鍵次級(jí)鍵肌紅蛋白(Mb)N端

C端

3.結(jié)構(gòu)域(domain)在分子量較大的蛋白質(zhì)分子中，多肽鏈上相鄰的超二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系，進(jìn)一步折疊成一個(gè)或多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的致密區(qū)域，并各行使功能。

（六）四級(jí)結(jié)構(gòu)1.亞基(subunit)有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈每一條多肽鏈都有完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)，稱為亞基

。2.四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為四級(jí)結(jié)構(gòu)。3.維系鍵氫鍵和離子鍵

血紅蛋白(Hb)第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系TheRelationofStructureandFunctionofProtein

一、一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無(wú)活性去除尿素、β-巰基乙醇

2.一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，生物學(xué)功能各異加壓素Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly

縮宮素Cys-Tyr-Leu-Gln-Asn-Cys-Pro-Ile-Gly

收縮血管，升高血壓，抗利尿子宮收縮，催產(chǎn)功能

3.一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，其基本構(gòu)象及功能也相似垂體前葉分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和促黑激素(α-MSH,β-MSH)共有一段相同的氨基酸序列，因此，ACTH也可促進(jìn)皮下黑色素生成，但作用較弱-甲硫-谷氨-組氨-苯丙氨-精氨-色氨-甘氨4.在蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，參與功能活性部位的殘基或處于特定構(gòu)象關(guān)鍵部位的殘基，即使在整個(gè)分子中發(fā)生一個(gè)殘基的異常，那么該蛋白質(zhì)的功能也會(huì)受到明顯的影響。鐮刀形紅細(xì)胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbS

β肽鏈HbA

β肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)

二、空間構(gòu)象與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)多種多樣的功能與各種蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象密切相關(guān)，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象是其功能活性的基礎(chǔ)，構(gòu)象發(fā)生變化，其功能活性也隨之改變。

1.蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)變性時(shí)，由于其空間構(gòu)象被破壞，故引起功能活性喪失，變性蛋白質(zhì)在復(fù)性后，構(gòu)象復(fù)原，活性即能恢復(fù)。天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無(wú)活性

2.變構(gòu)效應(yīng)(allostery)小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象改變，并伴隨其功能的變化，稱為變構(gòu)效應(yīng)或別構(gòu)作用。蛋白激酶PKARRCC

無(wú)活性

cAMP

有活性

3.蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤，盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。有些蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。

瘋牛病朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)正常PrPc瘋牛病PrPsc第四節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)TheCharactersofProtein

一、蛋白質(zhì)分子大小、形狀和

分子量的測(cè)定分子大小：1×104～106

Da形狀：分子量測(cè)定方法不對(duì)稱常數(shù)≈

1球形＞

1纖維狀之間橢圓形分子篩層析法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳生物質(zhì)譜

二、蛋白質(zhì)變性(denaturation)1.定義在某些物理和化學(xué)因素作用下，特定的空間構(gòu)象被破壞,從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。2.本質(zhì)次級(jí)鍵破壞，不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化3.因素加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等

4.應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來(lái)消毒及滅菌高溫蒸煮、照射紫外線、噴灑苯酚溶液、在傷口處涂抹酒精溶液等化驗(yàn)室，用加熱凝固的方法檢查尿中的蛋白質(zhì)，如有，尿液變渾濁有機(jī)汞等重金屬離子中毒時(shí)，可喝牛奶解其毒性保存蛋白質(zhì)制劑（防止變性）:酶，疫苗，免疫血清，避免蛋白質(zhì)變性，以防失活

5.變性蛋白改變的理化性質(zhì)溶解度降低粘度增加結(jié)晶性破壞生物學(xué)活性喪失易被蛋白酶分解

6.復(fù)性(renaturation)變性并非是不可逆的變化，當(dāng)變性程度較輕時(shí)，如去除變性因素，有的蛋白質(zhì)仍能恢復(fù)或部分恢復(fù)其原來(lái)的構(gòu)象及功能，變性的可逆變化稱為復(fù)性。

三、蛋白質(zhì)的兩性電離和等

電點(diǎn)CHNH3+COO-RCHNH3+COO-R+H++OH-CHNH2COO-RCHNH2COO-RpH>pI陰離子pH=pI氨基酸的兼性離子

+OH-+H+CHCOOHRNH3+CHCOOHRNH3+pH<pI陽(yáng)離子1.氨基酸的兩性解離2.蛋白質(zhì)可解離部分兩端的游離氨基和羧基側(cè)鏈中一些解離基(Glu、Asp、

Lys、

Arg和His)

3.蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)4.判斷依據(jù)

pH＞pI

負(fù)

pH＝pI

零

pH＜pI

正凡堿性氨基酸含量較多的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)就偏堿性凡酸性氨基酸含量較多的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)就偏酸性思考

?一多肽為Ala-Arg-Gly-His-Arg-His-Ala-Arg-His,問(wèn)當(dāng)溶液pH值為7.0時(shí).此多肽向電場(chǎng)哪極移動(dòng)?答案:負(fù)Glu-His-Arg-Val-Lys-Asp肽段電泳時(shí),在哪種pH下移向負(fù)極?()A.12B.3C.11D.5E.9

答:BD

四、膠體性質(zhì)分子量頗大，介于一萬(wàn)到百萬(wàn)之間分子的大小已達(dá)到膠粒1～100nm范圍之內(nèi)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜

五、蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)1.定義蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象本質(zhì)水化膜和電荷因素被去除3.與蛋白質(zhì)變性區(qū)別變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)水化膜酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿溶液中蛋白質(zhì)的聚沉

4.蛋白質(zhì)沉淀方法中性鹽沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法加熱沉淀法重金屬鹽沉淀法生物堿沉淀法中性鹽沉淀法鹽溶作用低鹽濃度可使蛋白溶解度增加的現(xiàn)象。鹽析作用高鹽濃度時(shí)，因破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化膜并中和電荷，而使蛋白質(zhì)分子相互聚集從溶液中析出的現(xiàn)象。特點(diǎn):沉淀蛋白不變性。有機(jī)溶劑沉淀機(jī)理破壞水化膜特點(diǎn)可引起蛋白變性丙酮沉淀而不變性的條件0～4℃低溫，10倍體積，立即分離

六、呈色反應(yīng)茚三酮反應(yīng)(NinhydrinReaction)加熱時(shí)，產(chǎn)生藍(lán)紫色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)(BiuretReaction)肽鍵反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅色酚試劑反應(yīng)酪氨酸，產(chǎn)生藍(lán)色第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化TheSeparationandPurificationofProtein提取分離純化分析鑒定蛋白質(zhì)分離純化的方法（一）依據(jù)溶解度不同等電點(diǎn)沉淀鹽析沉淀低溫有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)分離純化的方法（二）依據(jù)分子大小不同透析與超濾密度梯度離心凝膠過(guò)濾

1.透析與超濾透析利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法超濾應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的思考題將分子量分別為a（90000）、b（45000）和c（110000）的3種蛋白混合液過(guò)凝膠柱，洗脫順序是

cab

3.超速離心既可以用來(lái)分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，但對(duì)分子