分析CGRP參與LHb對痛覺的調(diào)節(jié)作用,免疫學論文

分析CGRP參與LHb對痛覺的調(diào)節(jié)作用,免疫學論文降鈣素基因相關(guān)肽是一種由37個氨基酸殘基組成的神經(jīng)肽,屬于降鈣素基因相關(guān)肽家族[1].它是和降鈣素(Calcitonin,CT)在不同組織中由同一基因在進行基因重組后構(gòu)成,在心臟和神經(jīng)系統(tǒng)中主要轉(zhuǎn)錄表示出成CGRP,而在甲狀腺主要轉(zhuǎn)錄表示出成CT.人類的CGRP有和兩種分子形式,且都有生物活性.CGRP廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中,并通過激活細胞膜上的CGRP受體的結(jié)合位點進而激活腺苷酸環(huán)化酶,促使細胞內(nèi)cAMP水平升高而產(chǎn)生多種生理作用,如感覺、心血管活動、運動、睡眠、呼吸、體溫調(diào)節(jié)等[2-5].同時,利用免疫組織化學觀察到在硬腦膜上有大量的CGRP免疫反響性的神經(jīng)纖維存在[6].有研究表示清楚,側(cè)腦室注射CGRP能明顯抑制壓力的感受性反射[7],表示清楚CGRP在大鼠側(cè)腦室內(nèi)具有鎮(zhèn)痛作用.脊髓以上水平,在多個與痛覺密切相關(guān)的腦區(qū)內(nèi),如中腦導水管周圍灰質(zhì)(Periaqueductalgray,PAG)、中縫大核(Nucleusraphemagnus,NRM)、伏核(NAc)和杏仁核(Centralnucleusofamygdale,CeA)等都發(fā)現(xiàn)過CGRP及其受體[8-10].韁核(Habenularcomplexes,Hb)是在鎮(zhèn)痛作用中非常重要的核團,存在于脊椎動物的背側(cè)間腦,可分為內(nèi)側(cè)韁核(Medialhabenularcomplex,MHb)和外側(cè)韁核(Lateralhabenularcomplex,LHb)[11-13],而且LHb是杏仁核、海馬、視前區(qū)等邊緣系統(tǒng)到中腦的樞紐.有關(guān)CGRP在LHb內(nèi)對大鼠痛覺調(diào)節(jié)的影響國內(nèi)外尚未見報道,因而本實驗通過對大鼠的LHb微量注射CGRP,采用熱板和壓板測痛儀來測量大鼠對傷害性熱刺激和機械刺激所引起的HWL,并將其作為衡量大鼠痛覺的指標,進而分析CGRP介入LHb對痛覺的調(diào)節(jié)作用,能夠為揭示CGRP在脊髓水平以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)鎮(zhèn)痛作用的機制提供新的位點,并為CGRP受體沖動劑和拮抗劑的臨床應(yīng)用提供根據(jù).1材料與方式方法1.1實驗材料1.1.1動物實驗動物選用成年雄性Wistar大鼠(由吉林大學白求恩醫(yī)學院動物中心提供)8只,體重均在180~250g之間,實驗期間分籠飼養(yǎng),自然光照,自由飲水與進食,飼養(yǎng)溫度16~24℃.1.1.2試劑與藥品降鈣素基因相關(guān)肽(上海強耀生物科技有限公司提供)用生理鹽水配置成濃度為0.875、1.75、3.5和7nmol/l,10%水合氯醛,醫(yī)用酒精,H2O2,亞甲基藍,牙托粉和牙脫水等.1.1.3實驗器材智能熱板儀(YLS-6B),電子壓痛儀(LYS-3E),均由安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn).手術(shù)器械、注射器、腦立體定位儀(深圳瑞沃德公司生產(chǎn)).1.2實驗方式方法1.2.1實驗前期工作為了使大鼠熟悉測試環(huán)境,并減小實驗誤差,在實驗開場之前需要對大鼠進行熱板和壓力測試訓練.根據(jù)孫衍剛等[13]給出的實驗方式方法,訓練進行5d,天天5輪,每輪3次.經(jīng)過訓練后大鼠的HWL會維持在一個比擬穩(wěn)定的范圍,熱板測試大約為3~5s之間,壓力測試大約為5~7s之間.1.2.2核團微量注射用水合氯醛腹腔麻醉,將大鼠的頭部水平固定在腦立體定位儀上,暴露頭骨,參考Watson鼠圖譜在外側(cè)韁核定位,將不銹鋼套管插入,用牙托粉和牙脫水固定,封住套管和顱骨之間的縫隙.手術(shù)后恢復2~3d后進行行為痛覺測試.進行核團微量注射前,將注射器插入套管,緩慢注射藥物,每次注射后應(yīng)讓注射針在管里停留片刻再將之取出.1.2.3行為痛覺測試熱板測試:熱板的溫度維持在52℃(51.7℃~52.3℃),將大鼠的待測后爪緊貼于熱板上,并開場計時,待大鼠后爪感覺到疼痛,主動回縮離開熱板時停止計時.記錄注射CGRP和注射生理鹽水對照組大鼠的HWL.壓力測試:使用壓力測痛儀對大鼠進行壓力測試,用腳踩住開關(guān),使小楔形有機玻璃壓在鼠爪的跗跖關(guān)節(jié)處,待大鼠后爪感覺到疼痛時,會往回收縮,此時停止計時,記錄注射CGRP和注射生理鹽水對照組大鼠的HWL.1.3統(tǒng)計學數(shù)據(jù)處理實驗所得的數(shù)據(jù)均以x-s形式表示,組間比照用獨立樣本t檢驗的方式方法進行統(tǒng)計處理.P0.05,P0.01,P0.001表示統(tǒng)計結(jié)果具有顯著差異性.2結(jié)果2.1LHb內(nèi)微量濃度為0.875、1.75、3.5和7nmol/l的CGRP的結(jié)果見表1~4.實驗結(jié)果表示清楚,LHb內(nèi)微量注射0.875nmol/lCGRP組與對照組相比大鼠左爪熱刺激HWL有差異(P0.05),對大鼠右爪熱刺激HWL有顯著差異(P0.001),見表1;微量注射濃度為1.75、3.5和7nmol/lCGRP與對照組相比引起大鼠左、右爪熱刺激HWL有顯著性差異(P0.001),見表2~4.LHb內(nèi)微量注射0.875nmol/lCGRP與對照組相比大鼠左爪機械刺激HWL有顯著差異(P0.001),而對大鼠右爪機械刺激HWL無差異(P0.05)見表1;微量注射濃度為1.75、3.5和7nmol/lCGRP組與對照組相比引起大鼠左、右爪機械刺激HWL有顯著性差異(P0.001),見表2~4.即LHb內(nèi)微量注射CGRP能夠引起明顯的鎮(zhèn)痛作用.2.2CGRP對正常大鼠的鎮(zhèn)痛作用具有劑量依靠性,且在20min時鎮(zhèn)痛效果最為明顯,如此圖1所示.3討論當前應(yīng)用于臨床的鎮(zhèn)痛藥物多為嗎啡、杜冷丁等阿片類藥物,在讓病人忘記疼痛的同時,也會產(chǎn)生耐藥性以及成癮性[14-16].因而,研究新型鎮(zhèn)痛藥物具有重要的生理學意義.而CGRP作為一種新型的神經(jīng)肽,在體內(nèi)分布廣,功能多,并且能夠避免阿片類藥物的成癮性等副作用,研究其在中樞水平的鎮(zhèn)痛作用,在臨床具有特別廣闊的意義.本實驗采用對大鼠LHb分別微量注射CGRP(用生理鹽水配置)和生理鹽水的方式方法,來討論CGRP對大鼠痛覺的調(diào)節(jié)作用.結(jié)果表示清楚,注射CGRP組的大鼠與注射生理鹽水組的大鼠相比,HWL明顯增加,講明CGRP在大鼠的LHb起到了鎮(zhèn)痛作用,并且這種鎮(zhèn)痛效果在20min左右最為明顯,具有時間上的規(guī)律性.除此之外,有學者研究CGRP在大鼠扣帶束及周圍皮質(zhì)對傷害性刺激反響的作用,結(jié)果表示清楚注射一定劑量的CGRP能顯著降低大鼠對機械刺激的HWL,使大鼠對熱板和機械壓力刺激產(chǎn)生痛敏反響,同樣有研究表示清楚,在腦內(nèi)某些核團微量注射CGRP均能延長大鼠的HWL值,如中腦導水管周圍灰質(zhì)、側(cè)腦室等[7,8,17].這是由于降鈣素基因相關(guān)肽所在部位不同,與其不同受體結(jié)合導致的作用結(jié)果可能會不一樣所致.在實驗中還發(fā)現(xiàn),對大鼠LHb微量注射4個不同濃度(0.875、1.75、3.5和7nmol/l)的CGRP作用效果不同,大鼠的后爪縮爪反響潛伏期也有顯著差異.通過觀察圖表,能夠得出結(jié)論,隨著注射CGRP濃度的逐步增加,大鼠的HWL也逐步增加,講明CGRP具有鎮(zhèn)痛作用且具有劑量依靠性.根據(jù)不同的藥理學特征,能夠?qū)GRP受體分為兩類,即CGRP1受體和CGRP2受體.有研究表示清楚,CGRP2受體可被CGRP所激動[3-8],但是對CGRP8-37的拮抗作用不明顯;而相反的CGRP1受體對CGRP8-37的阻斷效應(yīng)較為敏感,但是高劑量的GGRP8-37可以以成為受體的沖動劑[17].同時,Bartho等[18]也發(fā)現(xiàn)CGRP受體的阻斷劑CGRP8-37能夠部分逆轉(zhuǎn)由辣椒素所誘導的痛覺過敏及異常疼痛[19].但CGRP在LHb對大鼠的鎮(zhèn)痛作用機制尚不特別清楚,有待于一步的討論研究.以下為參考文獻:[1]于龍川主編.神經(jīng)生物學[M].北京:北京大學出版社,2020:141-147.[2]DobolyiA,IrwinS,MakaraG,etal.Calcitoningene-relatedpep-tide-containingpathwaysintheratforebrain[J].JCompNeurol,2005,489(1):92-199.[3]PoynerDR.Pharmacologyofreceptorsforcalcitoningene-relatedpeptideandamylin[J].TrendsPharmacolSci,1995,16:424-428.[4]王福莊,丁愛石,陳嘉,等.降鈣素基因相關(guān)肽增加大鼠腦血流量[J].生理科學,1989,9(5):50-51.[5]SmithFL,WelchSP,DombrowskiDS,etal.Theroleofendoge-nousopioidsasmediatorsofthehypothermiceffectsofintrathecallyadministeredcalciumandcalcitoningene-relayedpeptidinmice[J].JPharmacolExpTher,1993,266:1407-1415.[6]SaurabhGuptal,DipakVasantraoAmrutkar,etal.EvidenceforCGRPre-uptakeinratduramaterencephali[J].BrJPharmacol,2018,8(161):1885-1898.[7]張繼峰,唐朝樞.腦室內(nèi)注射降鈣素基因相關(guān)肽對壓力感受性反射的抑制[J].中國應(yīng)用生理學雜志,1995,12(3):280.[8]徐世蓮.炎癥大鼠中腦導水管周圍灰質(zhì)注射降鈣素基因相關(guān)肽對痛覺的影響[J].昆明醫(yī)學院學報,2006,27(2):23-27.[9]HuangYH,Brodda-JansenG,LundebergT,etal.Anti-nociceptiveeffectsofcalcitoningene-relatedpeptideinnucleusraphemagnusofrats:aneffectattenuatedbynaloxone[J].BrainRes,2000,873:54-59.[10]XuW,LundebergT,LiY,etal.Antinociceptioneffectofcalcito-ningene-relatedpeptideincentralnucleusofamygdale:activatingopioidreceptorsthoughamgdala-periaqueductalgraypathway[J].Neurosciecne,2003,118:1015-1022.[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