基因表達(dá)研究技術(shù)

基因表達(dá)研究技術(shù)劉亞鵬朱瑞生物工程141班基因表達(dá)研究技術(shù)劉亞鵬朱瑞

生物工程141班轉(zhuǎn)錄組測序二.RNA選擇性剪接技術(shù)轉(zhuǎn)錄組：一個活細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)所有RNA的總和（包括mRNA、rRNA、tRNA及非編碼RNA）轉(zhuǎn)錄組學(xué)：是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。簡而言之，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況。一.什么是轉(zhuǎn)錄組及轉(zhuǎn)錄組學(xué)1.表達(dá)序列標(biāo)簽測序(EST)(1)原理

EST(ExpressedSequenceTag)是從一個隨機選擇的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單向一次測序獲得的短的cDNA部分序列，代表一個完整基因的一小部分，在數(shù)據(jù)庫中其長度一般從20到7000bp不等，平均長度為360±120bp。EST來源于一定環(huán)境下一個組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫，因此EST也能說明該組織中各基因的表達(dá)水平。二.研究轉(zhuǎn)錄組的方法（2）操作流程組織樣品mRNA的提取→逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA→構(gòu)建cDNA文庫→測序

通過對cDNA文庫EST分析可以揭示用以構(gòu)建cDNA文庫的相應(yīng)組織或細(xì)胞中mRNA的真正水平，因此可以通過大規(guī)模的EST分析研究表達(dá)圖譜，以此得出特定組織類型在特定生理狀態(tài)或是特定的發(fā)育階段下基因表達(dá)情況。（3）表達(dá)序列標(biāo)簽測序在轉(zhuǎn)錄組中的運用（1）原理

基因表達(dá)系列分析（SAGE）是通過快速和詳細(xì)分析成千上萬個EST來尋找出表達(dá)豐富度不同的SAGE標(biāo)簽序列。在此方法中，通過限制性酶切可以產(chǎn)生非常短的cDNA標(biāo)簽，并通過PCR擴增和連接，隨后對連接體進(jìn)行測序。2.基因表達(dá)系列分析（SAGE）a.以biotinylatedoligo(dT）為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以一種限制性內(nèi)切酶（錨定酶）酶切.b.將cDNA等分為A和B兩部分，分別連接接頭A或接頭B。每一種接頭都含有標(biāo)簽酶酶切位點序列.（2）操作程序c.用標(biāo)簽酶酶切產(chǎn)生連有接頭的短cDNA片段，混合并連接兩個cDNA池的短cDNA片段，構(gòu)成雙標(biāo)簽后，以引物A和B擴增d.用錨定酶切割擴增產(chǎn)物，抽提雙標(biāo)簽片段并克隆、測序.e.對標(biāo)簽數(shù)據(jù)進(jìn)行處理a.SAGE能夠快速、全范圍提取生物體基因表達(dá)信息，對已知基因進(jìn)行量化分析。b.SAGE也能應(yīng)用于尋找新基因。（3）.基因表達(dá)系列分析（SAGE）在轉(zhuǎn)錄組研究中的應(yīng)用c.SAGE可用于定量比較不同狀態(tài)下的組織細(xì)胞的特異基因表達(dá)。d.SAGE能夠接近完整地獲得基因組表達(dá)信息，能夠直接讀出任何一種類型細(xì)胞或組織的基因表達(dá)信息。（1）以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測序技術(shù)。3.高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)的誕生可以說是基因組學(xué)研究領(lǐng)域一個具有里程碑意義的事件。該技術(shù)使得核酸測序的單堿基成本與第一代測序技術(shù)相比急劇下降,以人類基因組測序為例,上世紀(jì)末進(jìn)行的人類基因組計劃花費30億美元解碼了人類生命密碼,而第二代測序使得人類基因組測序已進(jìn)入萬(美)元基因組時代。（1）原理

該技術(shù)系指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息.包括點陣列基因芯片和原位合成基因芯片。4.基因芯片技術(shù)a.芯片制備目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和點陣列的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。（2）操作流程b.樣品制備生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)，有時樣品的量很小。所以，必須將樣品進(jìn)行提取、擴增，獲取其中DNA或RNA，然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測的靈敏度。c.雜交反應(yīng)

雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行的反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過程。選擇合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。d.信號檢測和結(jié)果分析雜交反應(yīng)后的芯片上各個反應(yīng)點的熒光位置、熒光強弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關(guān)生物信息。

基因芯片以其可同時、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計基因組信息的本領(lǐng)而顯示出了巨大的威力。在基因表達(dá)檢測的研究上人們已比較成功地對多種生物包括擬南芥、酵母、人等的基因組表達(dá)情況進(jìn)行了研究，并且用該技術(shù)一次性檢測了酵母幾種不同株間數(shù)千個基因表達(dá)譜的差異（3）基因芯片在轉(zhuǎn)錄組研究中的運用如：通過研究酵母從無氧環(huán)境到有氧環(huán)境時的表達(dá)譜，以及通過不同方式處理過的酵母菌的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)約有5%的基因在表達(dá)量上有明顯的變化。阿爾茨海默病中，出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的大腦神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)譜就有別于正常神經(jīng)元，當(dāng)病理形態(tài)學(xué)尚未出現(xiàn)纖維纏結(jié)時，這種表達(dá)譜的差異即可以作為分子標(biāo)志直接對該病進(jìn)行診斷。

轉(zhuǎn)錄組的研究應(yīng)用于臨床的的另一個例子是可以將表面上看似相同的病癥分為多個亞型，尤其是對原發(fā)性惡性腫瘤，通過轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)譜的建立，可以詳細(xì)描繪出患者的生存期以及對藥物的反應(yīng)。選擇性剪接的分類一般將選擇性剪接分為：外顯子選擇內(nèi)含子選擇互斥外顯子內(nèi)部剪接位點大多數(shù)真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體是按一種方式剪接產(chǎn)生出一種成熟mRNA分子，因而只翻譯成一種蛋白質(zhì)。有些基因的一個mRNA前體通過不同的剪接方式(選擇不同的剪接位點)產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，這一過程稱為可變剪接。

可變剪接是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機制,是導(dǎo)致人類基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因。

RNA選擇性剪接的意義可變剪接被認(rèn)為是導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能多樣性的重要原因之一，它使一個基因可編碼多個不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白產(chǎn)物。已有實驗研究表明，可變剪接在產(chǎn)生受體多