血清學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)

關(guān)于血清學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)第一頁，共三十三頁，2022年，8月28日血清學(xué)診斷：是指用已知細(xì)菌的特異性抗原檢測患者血清中相應(yīng)抗體的方法，以診斷感染性疾病。（用已知抗原檢測血清中的特異性抗體）血清學(xué)鑒定：即采用含有已知特異性抗體的免疫血清（診斷血清）與分離培養(yǎng)出的未知純種細(xì)菌或標(biāo)本中的抗原進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)，以確定病原菌的種或型。（用已知抗體鑒定未知的細(xì)菌或標(biāo)本中的抗原）第二頁，共三十三頁，2022年，8月28日微生物抗原成分-----細(xì)菌抗原成分菌體抗原:革蘭氏陰性菌的菌體抗原稱O抗原---脂多糖蛋白質(zhì)的復(fù)合物鞭毛抗原稱為H抗原表面抗原:不同細(xì)菌的表抗原名稱不同.大腸桿菌的表面抗原稱為封套抗原或K抗原,肺炎雙球菌的叫莢膜抗原,傷寒沙門氏菌的表面抗原稱為Vi抗原第三頁，共三十三頁，2022年，8月28日細(xì)菌抗原細(xì)菌的各種抗原第四頁，共三十三頁，2022年，8月28日

抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)（antigen-antibodyreaction）是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于體內(nèi)（invivo），也可發(fā)生于體外(invitro)。體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)則根據(jù)抗原的物理性狀、抗體的類型及參與反應(yīng)的介質(zhì)（例如電解質(zhì)、補(bǔ)體、固相載體等）不同，可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多采用血清作試驗(yàn)，所以體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清反應(yīng)（erologicreaction）。第五頁，共三十三頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)條件抗原抗體3.環(huán)境因素：（1）電介質(zhì)：0.85%NaCI；（2）溫度：37或56（3）pH值：7.0（4）振蕩：適當(dāng)?shù)臋C(jī)械振（5）反應(yīng)時(shí)間第六頁，共三十三頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性和交叉性若兩種抗原之間含有部分共同抗原時(shí)，則發(fā)生交叉反應(yīng)。親緣關(guān)系越近，交叉反應(yīng)的程度也越高。反應(yīng)的可逆性

抗原與抗體的結(jié)合為分子表面的結(jié)合，結(jié)合的適宜溫度為0～40℃、pH在4.0～9.0范圍內(nèi)。如溫度超過60℃或pH降到3.0以下，或加入解離劑臺(tái)硫氰化鉀、尿素等，則抗原抗體復(fù)合物又可重新解離，解離后的抗原或抗體性質(zhì)不改變。第七頁，共三十三頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)最適比和帶現(xiàn)象只有抗原與抗體呈適當(dāng)比例時(shí)，才可出現(xiàn)可見的結(jié)合反應(yīng)。當(dāng)抗原過多或抗體過多，則抗原抗體的結(jié)合不能形成大的復(fù)合物，因而抑制可見反應(yīng)的出現(xiàn)，這一現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象?？贵w過多出現(xiàn)的抑制現(xiàn)象稱前帶現(xiàn)象，而抗原過多出現(xiàn)的抑制現(xiàn)象稱后帶現(xiàn)象。為了克服帶現(xiàn)象，在進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)時(shí)，需將抗原或抗體作適當(dāng)稀釋。第八頁，共三十三頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)反應(yīng)的二階段性結(jié)合階段-----反應(yīng)發(fā)生快，幾秒鐘至幾分鐘。反應(yīng)階段-----較慢，需幾分鐘、幾十分鐘或更長時(shí)間。第九頁，共三十三頁，2022年，8月28日凝集反應(yīng)顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅血球等）或吸附在乳膠、白陶土、離子交換樹脂和紅細(xì)胞的抗原與其特異性抗體結(jié)合后，在有電介質(zhì)存在時(shí)，凝聚成肉眼可見的凝集小塊。凝集原——凝集素直接凝集反應(yīng)玻片法試管法抗原抗體反應(yīng)類型-----凝集反應(yīng)第十頁，共三十三頁，2022年，8月28日血清學(xué)鑒定

掌握細(xì)菌的血清學(xué)鑒定法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡谑豁?，共三十三頁?022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理

根據(jù)抗原抗體反應(yīng)具有高度特異性的特點(diǎn)，用已知抗體來檢測未知抗原（細(xì)菌）。第十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)材料1.菌種待檢細(xì)菌2.試劑多價(jià)沙門菌O(A-F)診斷血清3.其他載玻片第十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日沙門氏菌診斷血清（11種）O2O4O7O9HaHbHcHdHiViA-F群多價(jià)OA-F群多價(jià)O第十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日O抗原、H抗原和Vi抗原O抗原:是一種沙門氏菌細(xì)胞壁表面的耐熱多糖抗原，100℃，2.5h不被破壞，它的特異性依賴于細(xì)胞壁脂多糖側(cè)鏈多糖的組成。

H抗原:是一種蛋白質(zhì)性鞭毛抗原，共有63種，60℃加熱30～60min及酒精作用均可破壞其抗原性，但能抵抗甲醛。Vi抗原:是一種N-乙酰-D-半乳糖胺糖醛酸聚合物，60℃加熱1h即破壞其凝集性和免疫原性。第十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日沙門氏菌的主要抗原組成O抗原：至少58種,

含相同抗原組分歸為一組，引起人類疾病的沙門菌大多數(shù)在A~F組。H抗原：分為Ⅰ、Ⅱ相，Ⅰ相以a、b、c等表示，Ⅱ相以1、2、3等表示。Vi抗原：抗原性弱，不穩(wěn)定，可阻止O抗原與其相應(yīng)抗體的凝集反應(yīng)。第十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日沙門氏菌菌型的表示方法血清型以數(shù)字和字母表示.

例如:查考夫曼-懷特沙門氏菌屬抗原表.鼠傷寒沙門氏菌:O抗（1，4，[5]，12），第Ⅰ相H抗原（i）第Ⅱ相H抗原(1,2)。它的血清型應(yīng)表示為:鼠傷寒沙門氏菌（1，4，[5]，12：i：1，2）[]內(nèi)的O抗原可能存在或不存在。[]內(nèi)的H抗原可能是罕見的，正常情況下一般不存在。第十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日沙門氏菌的血清鑒定的方法用O、H和Vi因子血清與待檢的菌株作玻片凝聚試驗(yàn)。1.先用O因子血清確定菌株所屬的O群及O抗原的各種成分。2.再用H因子血清檢查其第1相和第2相的H抗原以確定血清型。3.必要時(shí)還要用Vi血清檢查(目前有3種)。第十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日1.先用A~F多價(jià)O血清檢查，確定菌株是否在A~F六個(gè)O群的范圍內(nèi)。2.再用代表六個(gè)O群的O因子血清檢查，即O2（A）、O4（B）、O7（C1）、O8（C2）、O9（D）、O3，10（E）、O11（F）。3.確定O群之后，分別用HA(a、b、c、d、i、z10、z29）HB、HC、HD四種多價(jià)H血清檢查。4.用3.所確定的多價(jià)H血清所包括的所有H因子血清逐一檢查定為第1相或第2相H抗原。5.檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原，或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的，要用位相變異的方法再檢查其另一個(gè)相。單相菌不必作位相變異檢查。6.綜合O和H因子血清以及Vi因子血清的檢查結(jié)果，按照考夫曼-懷特沙門氏菌屬抗原表解判定沙門氏菌的菌型。沙門氏菌的血清型鑒定步驟第十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)方法

50ul血清+待檢菌50ulNS+待檢菌

第二十頁，共三十三頁，2022年，8月28日

先用A－F和Vi血清檢測，根據(jù)結(jié)果再進(jìn)行其他鑒定。注意：第二十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日結(jié)果判斷均勻混濁顆粒狀凝集物＋－第二十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日組別菌型抗原oHA甲型副傷寒沙門菌1,2,12a:-B乙型副傷寒沙門菌德比沙門菌鼠傷寒沙門菌1,4,5,121,4,121,4,5,12b:1,2f,g:-i:1,2C

豬霍亂（或丙型副傷寒）沙門菌6,7,(Vi)c:1,5D傷寒沙門氏菌9,12,Vid:-E鴨沙門氏菌3,10e,h:1,6F阿伯丁沙門氏菌11i:1,2沙門氏菌屬國內(nèi)常見菌型診斷抗原表第二十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日注意事項(xiàng)1.生理鹽水端應(yīng)不出現(xiàn)凝集顆粒。2.沙門菌Vi抗原存在時(shí)可阻止O抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生凝集，故在做玻片凝集時(shí)應(yīng)加注意，需事先加熱破壞Vi抗原，O抗原才得以與相應(yīng)的O診斷血清發(fā)生凝集。第二十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程先鑒定A－F和Vi，根據(jù)結(jié)果再進(jìn)行其他鑒定。

A－F

Vi實(shí)驗(yàn)進(jìn)程--

為非沙門氏菌屬，不再繼續(xù)鑒定其他抗原成分。+-

初步判斷為沙門氏菌屬，繼續(xù)鑒定其他抗原成分。-+

初步判斷為沙門氏菌屬，但需去除菌體Vi莢膜后再繼續(xù)鑒定其他抗原成分。第二十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日群別菌型抗原oHA甲型副傷寒沙門菌1,2,12a:-B乙型副傷寒沙門菌德比沙門菌鼠傷寒沙門菌1,4,5,121,4,121,4,5,12b:1,2f,g:-i:1,2C豬霍亂（或丙型副傷寒）沙門菌6,7,(Vi)c:1,5D傷寒沙門氏菌9,12,Vid:-E鴨沙門氏菌3,10e,h:1,6F阿伯丁沙門氏菌11i:1,2沙門氏菌屬常見菌型診斷抗原表第二十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日位相變異的解釋將一個(gè)雙相沙門氏菌的菌株在瓊脂平板上劃線分離，所得的菌落中，有的有第1相H抗原，有的則有第2相H抗原。若任意挑取一個(gè)菌落在培養(yǎng)基上多次傳代，其后代又可出現(xiàn)部分是第1相而另一部分是第2相的菌落。這種兩個(gè)相的H抗原可以交相產(chǎn)生的現(xiàn)象稱為位相變異。雙相菌初次分離時(shí)，單個(gè)菌落的純培養(yǎng)往往只有一個(gè)相H抗原，鑒別時(shí)常只能檢出一個(gè)相，而測不出另一相。此時(shí)，可用已知相血清誘導(dǎo)的位相變異試驗(yàn)來獲得未知的另一個(gè)相H抗原。第二十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日位相變異試驗(yàn)的方法簡易平板法1.配制0.7~0.8%的半固體瓊脂培養(yǎng)基，然后傾注平板烘干表面水分。2.在平板內(nèi)滴上一滴已知的第1相或第2相血清因子，并作好標(biāo)記。3.待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在標(biāo)記部位的中間點(diǎn)種已知第1相或第2相的新鮮待檢菌株。4.培養(yǎng)后，其已知相細(xì)菌的動(dòng)力受到抑制，解離出另一相的細(xì)菌，并向周圍蔓延生長，形成一個(gè)大的菌落。5.檢查其菌落的邊緣部分，即可確定該菌株的另一相H抗原。6.該方法通常1~3天內(nèi)可以有結(jié)果。第二十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日位相變異試驗(yàn)的方法U形管法小玻管法小套管法軟瓊脂斜面法第二十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日59種沙門氏菌的血清列表

O1O2O4O5O7O8O9O10O11O14O15O19O20O27O34O46O3,19HaHbHcHdHfHgHhHiHkHmHnHpHrHsHtHuHvHwHxHyHzHz6Hz10Hz13Hz15Hz28Hz29H