(4) 絮凝沉淀技術(shù)

沉淀技術(shù)趙林12生物分離過程的一般流程原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(沉淀/超過濾/萃取)純化(層析、離子交換、吸附)脫鹽(凝膠過濾、超濾)濃縮(超濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性4破碎方法介紹1.機(jī)械破碎法2.物理破碎法3.化學(xué)破碎法4.酶學(xué)破碎法1機(jī)械破碎51.高壓勻漿破碎2.珠磨破碎3.噴霧撞擊破碎4.超聲波破碎機(jī)械破碎（1）高壓勻漿6m/s50-70MPa剪切力（2）珠磨7（3）噴霧撞擊破碎高速凍結(jié)、微小粒子、高速載氣8（4）超聲波由于對冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，主要用于實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。9在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation），空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。2物理破碎（1）溫度差破碎法凍結(jié)（液氮）-融化（50-60℃）

低溫冷凍一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)斷裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度發(fā)生變化，引起細(xì)胞突然膨脹而破裂。10（2）壓力差破碎法滲透壓沖擊將細(xì)胞先放入高滲透壓的介質(zhì)中，如高濃度的甘油或蔗糖溶液，在達(dá)到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水中或緩沖液中，水就會迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，致使細(xì)胞膨脹，引起細(xì)胞壁的破裂.此法適用于細(xì)胞壁比較脆弱的，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理過的，或細(xì)胞壁合成受到抑制的微生物。

在各種細(xì)胞破碎法種是最為溫和的一種。11(3)干燥破碎

干燥破碎可采用空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。

干燥過程能使細(xì)胞膜滲透性改變，再用丙酮、丁醇或緩沖液等處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。123化學(xué)破碎法原理：化學(xué)試劑改變或破壞細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)常用試劑：堿液、有機(jī)溶劑、表面活性劑13有鮮明的優(yōu)缺點4酶學(xué)破碎法外加酶制劑或自溶法（1）釋放出克隆的胞內(nèi)蛋白（2）制取特殊的壁葡聚糖聚合物（3）與機(jī)械細(xì)胞破碎法協(xié)同使用（4）從細(xì)胞內(nèi)不同位置選擇性地釋放產(chǎn)物14沉淀precipitation

是利用沉淀劑使目標(biāo)產(chǎn)物或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體凝聚物（aggregates）的過程。15沉淀操作常在發(fā)酵液經(jīng)離心或過濾除去不溶性雜質(zhì)及細(xì)胞碎片以后進(jìn)行，得到的沉淀物可直接干燥制得成品或經(jīng)進(jìn)一步提純，如透析、超濾、層析或結(jié)晶等。一、沉淀技術(shù)概述沉淀技術(shù)的特點16沉淀過程中析出的固相成分較復(fù)雜：除含有目標(biāo)分子外，還夾雜共存的雜質(zhì)、鹽和溶劑。沉淀屬于粗分離操作。沉淀技術(shù)具有簡單、經(jīng)濟(jì)和濃縮倍數(shù)高的優(yōu)點。沉淀分離具有選擇性，可以有選擇地沉淀雜質(zhì)或目標(biāo)產(chǎn)物。沉淀生物活性物質(zhì)時需注意沉淀劑或沉淀條件是否會破壞活性；是否有毒；是否易除去。沉淀技術(shù)的應(yīng)用17沉淀分離技術(shù)廣泛應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸等小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)、多糖、核酸等大分子物質(zhì)的分離。通過沉淀技術(shù)可以達(dá)到產(chǎn)物濃縮的目的。沉淀可以將已經(jīng)純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)加以保存或進(jìn)一步處理。沉淀可以進(jìn)行間歇或連續(xù)操作。應(yīng)用沉淀技術(shù)應(yīng)考慮的因素沉淀的方法和技術(shù)應(yīng)具有一定的選擇性，以使要分離的目標(biāo)成分得以很好的分離。（選擇性越好，純度越高）對于酶類和蛋白質(zhì)，除了選擇性之外，還需要注意沉淀方法對目標(biāo)成分活性和結(jié)構(gòu)的破壞作用。對用于食品和醫(yī)藥中的目標(biāo)成分，還需要考慮沉淀劑殘留對人體是否有害。18沉淀技術(shù)的分類金屬鹽沉淀法鹽析法等電點法有機(jī)溶劑法選擇變性法非離子多聚體法生成鹽復(fù)合物法其它方法19沉淀操作的基本步驟20待處理溶液加入沉淀劑沉淀物的陳化（沉淀析出）收集沉淀離心或過濾收集上清一金屬鹽沉淀法原理：利用金屬離子與酸根在形成鹽類時溶解度低而進(jìn)行的分離操作。檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)檸檬酸有溫和爽快的酸味，普遍用于各種飲料、汽水、葡萄酒、糖果、點心、餅干、罐頭果汁、乳制品等食品的制造。檸檬酸屬于果酸的一種，主要作用是加快角質(zhì)更新，常用于乳液、乳霜、洗發(fā)精、美白用品、抗老化用品、青春痘用品等?；?、紡織醫(yī)藥環(huán)保禽畜生產(chǎn)2122中和酸解沉淀法從發(fā)酵液中提取檸檬酸2C6H8O7?H2O+3CaCO3------Ca3(C6H5O7)2?4H2O+3CO2+H2OCa3(C6H5O7)2?4H2O+3H2SO4+H2O-----2C6H8O7?H2O+3CaSO4?H2O谷氨酸+Zn+鋅鹽法鈣鹽法谷氨酸+Ca2+谷氨酸23二鹽析沉淀技術(shù)鹽析salting-out

指生物大分子等物質(zhì)在高濃度中性鹽的水溶液中溶解度降低而發(fā)生沉淀。24鹽析法的優(yōu)點：

成本低；操作簡單、安全；對許多生物活性物質(zhì)穩(wěn)定。許多物質(zhì)都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離，如蛋白質(zhì)、多肽、多糖、核酸等。25蛋白質(zhì)的各級結(jié)構(gòu)氨基酸一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)血紅蛋白2627疏水作用力氫鍵作用力離子鍵作用力二硫鍵Cys-SH-----HS-CysCys-S—S-Cys1、蛋白質(zhì)鹽析的原理分子直徑：1—30nm相對分子量：5×103—1×106u28蛋白質(zhì)分子以親水膠體形式存在于水溶液中。（1）蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，在一定pH下帶一定電荷，靜電斥力使分子相互排斥。（2）蛋白質(zhì)分子周圍的水化層防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀。29雙電層30蛋白質(zhì)分子雙電層緊密層分散層帶電粒子的靜電相互作用取決于ζ電位的大小。分散層厚度越小，ζ電位越小蛋白質(zhì)外圍結(jié)構(gòu)：雙電層、水化層。31ζ電位是一個表征分散體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。

由于帶電微粒吸引分散系中帶相反電荷的粒子，離顆粒表面近的離子被強(qiáng)烈束縛著，而那些距離較遠(yuǎn)的離子形成一個松散的電子云，電子云的內(nèi)外電位差就叫作ζ電位。ζ電位鹽析法機(jī)理（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質(zhì)分子因熱運動碰撞聚集。（2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域，由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，靜電斥力降低，導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。溶解度和離子強(qiáng)度的關(guān)系水溶液中蛋白質(zhì)的溶解度一般在生理離子強(qiáng)度范圍（0.15~0.2mol/kg）時最大。當(dāng)離子強(qiáng)度較高時，溶解度的對數(shù)與離子強(qiáng)度之間呈線性關(guān)系。33Cohn方程：logS=β-ksIS

蛋白質(zhì)溶解度g/L

β

常數(shù)，取決于溶質(zhì)的性質(zhì)，多為經(jīng)驗數(shù)據(jù)。

ks鹽析常數(shù)

I離子強(qiáng)度

mol/Lks鹽析常數(shù)主要取決于加鹽的性質(zhì)，ks大小與各種離子價數(shù)成正比，與離子半徑及溶液的介電常數(shù)有關(guān)。多價陰離子，如硫酸根和磷酸根有較高的ks蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)會受到溶液pH和溫度的影響。34蛋白質(zhì)NaClMgSO4(NH4)2SO4Na2SO4磷酸鹽檸檬酸鈉β-乳球蛋白0.63馬血紅蛋白0.330.710.761.000.69人血紅蛋白2.00馬肌紅蛋白0.94卵清蛋白1.22纖維蛋白原1.071.46一些蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)2、鹽析方法的分類在一定pH和溫度下，改變離子強(qiáng)度的鹽析叫ks分段鹽析法；適用于早期粗分離。在一定離子強(qiáng)度下改變pH和溫度的鹽析叫β分段鹽析法；適用于后期的進(jìn)一步分離提純。353、影響鹽析的因素（1）蛋白質(zhì)濃度的影響

logC1=β-ksI1logC2=β-ksI2logC1/C2=ks（I2-I1）36幾點結(jié)論不同濃度的蛋白質(zhì)鹽析所需鹽濃度不同，高濃度蛋白質(zhì)可以節(jié)約鹽的用量。蛋白質(zhì)濃度太高時，由于一些蛋白質(zhì)的β、ks常數(shù)相近，會發(fā)生嚴(yán)重的共沉作用。蛋白質(zhì)濃度太低時，所用鹽的量較多，但發(fā)生共沉作用少。分步分離提純過程中，寧可控制蛋白質(zhì)濃度低一些，多用一些鹽，以取得好的分離效果。蛋白質(zhì)濃度一般控制在2.5-3.0%較合適。37（2）離子類型和離子強(qiáng)度的影響38常見陰離子鹽析作用順序：PO43-〉SO42-〉CH3COO-〉Cl-〉NO3-〉ClO4-〉I-〉SCN-常見陽離子鹽析作用順序：Al3+〉H+〉Ba2+〉Ca2+〉NH4+〉K+〉Na+〉Mg2+分步鹽析不同蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析時所需求的離子強(qiáng)度是不同的。一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順序進(jìn)行分步沉淀。39纖維蛋白原假球蛋白血清白蛋白C血紅蛋白肌紅蛋白鹽析用鹽的基本要求40溶解度大，能配制高離子強(qiáng)度的鹽溶液；鹽析作用強(qiáng)，一般多價陰離子較強(qiáng)，而多價陽離子容易使鹽析作用降低；溶解度受溫度影響小，便于在低溫下操作在生物學(xué)上惰性，不能影響蛋白質(zhì)的分子活性，而且盡量不引入分離和測定的新雜質(zhì)。鹽溶液的密度不高，便于蛋白質(zhì)沉淀的沉降和離心分離。來源豐富、經(jīng)濟(jì)，常用鹽有硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。（3）pH對鹽析的影響一般而言，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度越大。改變pH可以改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，即可改變蛋白質(zhì)溶解度。414243（4）溫度對鹽析的影響

在低離子強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)一般隨著溫度增加而增加。在高離子強(qiáng)度下，蛋白質(zhì)類生物大分子隨溫度的升高溶解度常常降低。一般情況下，蛋白質(zhì)鹽析對溫度的要求不嚴(yán)格，在室溫下進(jìn)行即可；對溫度敏感的酶，要在0-4度下操作，以免失活。44COHbTCIC454、鹽析沉淀技術(shù)的操作鹽析常用鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂；磷酸鈉、磷酸鉀；氯化鈉、氯化鉀；醋酸鈉、檸檬酸鈉、硫氰化鉀等。硫酸銨優(yōu)點是溶解度比較大，而且受溫度影響較小；缺點是緩沖能力弱，含氮原子對蛋白質(zhì)分析有影響。硫酸鈉是不含氮原子對蛋白質(zhì)分析沒有影響；缺點是30度以下溶解度較低，30度以上效果較好。鹽的種類鹽析作用溶解度溶解度受T影響緩沖能力其他性質(zhì)硫酸銨大大小小含氮、便宜硫酸鈉大較小大小不含氮、較貴磷酸鹽小較小大大不含氮、貴硫酸銨鹽析操作（1）硫酸銨使用前的預(yù)處理46選擇硫酸銨純度級別：粗分離采用三級純度的生化工業(yè)用的硫酸銨；對于蛋白質(zhì)或酶的分離，要用純度較高或經(jīng)過重結(jié)晶的硫酸銨。除去重金屬離子：將硫酸銨配成溶液，通入硫化氫至飽和，放置過夜，過濾除去重金屬離子，濾液蒸發(fā)濃縮結(jié)晶，在100度下烘干。調(diào)pH：高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（pH約為5），適用前用氨水或硫酸調(diào)至所需的值。47（2）飽和硫酸銨的配制及調(diào)整固體加入法：將硫酸銨磨碎成細(xì)粒，在攪拌下分批緩慢加入溶液中。當(dāng)鹽析要求飽和度較高而又不增大溶液的體積時，多用此法。飽和液法：取過量硫酸銨加熱（50度）攪拌溶解，保溫10分鐘，趁熱濾去不溶物，放置過夜，第二天有少量硫酸銨析出即達(dá)到100%的飽和度。鹽析時所需加飽和液的體積V=V0（S2-S1）/（1-S2）透析平衡法：先將待鹽析的樣品裝于透析袋內(nèi)，然后進(jìn)入飽和硫酸銨溶液中進(jìn)行透析，硫酸銨逐步進(jìn)入袋內(nèi)達(dá)到鹽析飽和度，產(chǎn)生沉淀。4849鹽析所需飽和度的試驗確定：如圖所示，沉淀目標(biāo)蛋白的用鹽飽和度范圍為35%-55%具體值應(yīng)根據(jù)同時得到較大純化倍數(shù)和回收率而定。5051目標(biāo)蛋白來源硫酸銨飽和濃度收率純化倍數(shù)一次沉淀二次沉淀人干擾素細(xì)胞培養(yǎng)液30（上清液）80（沉淀）991.7白細(xì)胞介素2細(xì)胞培養(yǎng)液35（上清液）85（沉淀）73.57.0組織纖溶酶原激活物豬心抽提液50（沉淀）751.8蛋白質(zhì)鹽析沉淀實例52（3）硫酸銨鹽析需注意的問題加固體硫酸銨時，要看清表上的溫度要求。分段鹽析時，要考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化，以調(diào)整不同的鹽析飽和度。鹽析后一般需要放置半小時至1小時，待沉淀完全后再進(jìn)行過濾或離心，過早的分離會影響收率。低濃度的硫酸銨溶液鹽析后固液分離常采用離心，高濃度的硫酸氨常采用過濾。為獲得試驗的可重復(fù)性，鹽析條件，如溫度，pH，硫酸銨的純度都要嚴(yán)加控制。53100ml血清+100mlPBS滴加200ml飽和硫酸銨pH7.2上清液含清蛋白（Ab）沉淀溶于PBS，定容100ml沉淀含纖維蛋白質(zhì)上清液上清液沉淀主要含γ-球蛋白和少量β-球蛋白上清液為α-球蛋白及小量清蛋白及β球蛋白沉淀主要為β-球蛋白溶于PBS中定容100ml上清液為β-球蛋白沉淀主要為γ球蛋白溶于PBS中定容100ml上清液沉淀主要為γ-球蛋白滴加飽和硫酸銨至45%飽和度上清液為α-球蛋白及小量清蛋白及β-球蛋白沉淀主要為β-球蛋白滴加飽和硫酸銨至20%飽和度滴加飽和硫酸銨至30-33%飽和度滴加飽和硫酸銨至45%飽和度滴加飽和硫酸銨至30-33%飽和度滴加飽和硫酸銨至30-33%飽和度等電點（PI）：溶液中蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時的pH值。蛋白質(zhì)顆粒在溶液中所帶的電荷，既取決于其分子組成中堿性和酸性氨基酸的含量，又受所處溶液的pH影響。54三、等電點沉淀技術(shù)穩(wěn)定穩(wěn)定55StructureofthepentapeptideSer-Gly-Tyr-Ala-Leu.NterminusCterminusProteinstructure56“Acidic”aminoacids

:containingadditionalcarboxylgroupswhichareusuallyionizedasparticacid

(Asp,D，天冬氨酸)glutamicacid(Glu,E，谷氨酸)57“Basic”aminoacids:

containingpositivelychargedgroupsLysine(Lys,K,賴氨酸)Aimidazolegroup(咪唑基)Arginine

(arg,R,精氨酸)deaguanidinogroup(胍基）Histidine

(His,H，組氨酸)58--------++++++++pH=pIpH>pIpH<pI等電點沉淀法是利用兩性電解質(zhì)分子在等電點時溶解度最低，而各種兩性電解質(zhì)具有不同的等電點來進(jìn)行分離的一種方法。蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子和氨基酸、核苷酸等生物小分子可以用等電點沉淀法分離。等電點沉淀法的應(yīng)用等電點沉淀需要在低離子強(qiáng)度下調(diào)整溶液的pH至等電點，可用鹽酸、磷酸、硫酸等。在等電點的pH值下利用透析等方法降低離子強(qiáng)度，也可使蛋白質(zhì)沉淀。等電點法常需要和其它沉淀法聯(lián)合使用。常用于除去雜蛋白。如果沉淀操作時pH過低或過高，容易破壞目標(biāo)產(chǎn)物的活性。59生物大分子的等電點易受鹽離子的影響而發(fā)生變化：（1）若蛋白質(zhì)結(jié)合鈣鎂鋅等陽離子多，則等電點升高；（2）若蛋白質(zhì)結(jié)合HPO42-

、SO42-

、Cl-等陰離子多，則等電點降低；（3）自然界中許多蛋白質(zhì)較易結(jié)合陰離子，使等電點向酸側(cè)移動。例如，胰島素等電點為5.3，與鋅離子結(jié)合后，形成胰島素鋅鹽，其等電點變?yōu)?.2。60概念：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。原理：（1）加入親水性有機(jī)溶劑后介質(zhì)的介電常數(shù)降低

根據(jù)庫侖定律：k:庫倫常數(shù)q:粒子所帶電量r:粒子間距離F：作用力

ε:介電常數(shù)61四、有機(jī)溶劑沉淀技術(shù)溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加。62（2）親水性有機(jī)溶劑本身的水和作用，降低了水活度，使溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度減小，導(dǎo)致脫水凝集。脫水作用較靜電作用占更主要的地位。水的活度：食品中自由水,可利用水,或者說活性水的含量。近似等于食品在密封容器內(nèi)的水蒸汽壓（P）與在相同溫度下的純水蒸汽壓（Po）之比。A：水的活度值；P:溶劑的蒸汽壓；P0：純水的蒸汽壓大多數(shù)細(xì)菌在水活度低于0.91的條件下無法繁殖,而霉菌就可以耐受比較低的水活度環(huán)境,大致在0.61-0.94之間有機(jī)溶劑沉淀技術(shù)的優(yōu)缺點：優(yōu)點（1）分辨率高于鹽析，即一種生物大分子溶質(zhì)只有在一個比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。（2）沉淀產(chǎn)品不需要脫鹽，采用過濾和揮發(fā)的方法可以去除有機(jī)溶劑，而且有機(jī)溶劑，沸點較低，便于回收。缺點容易造成生物活性分子的變性失活，常需在低溫下操作。63有機(jī)溶劑沉淀的影響因素1、溫度（1）蛋白質(zhì)、核酸類生物活性大分子在有機(jī)溶劑中對溫度特別敏感，加入的有機(jī)溶劑需預(yù)冷至較低溫度（-10~-20度）。（2）核苷酸、氨基酸、生物堿、糖類等分子對溫度要求不太苛刻，但低溫有助于提高沉淀效果。64652、樣品濃度（1）低濃度的樣品使用有機(jī)溶劑的量大，但是共沉作用小，分離效果好。樣品損失較大（即回收率小），具有生理活性的樣品容易產(chǎn)生稀釋變性。（2）高濃度的樣品使用有機(jī)溶劑的量小，但是共沉作用大，分離效果差。樣品損失較?。椿厥章矢撸哂猩砘钚缘臉悠纷冃晕ｋU小。（3）一般而言，蛋白質(zhì)的相對分子量越大，有機(jī)溶劑沉淀越容易，所需的有機(jī)溶劑量越少。（4）樣品濃度經(jīng)驗值，蛋白質(zhì)：5-25mg/mL

粘多糖：1-2%66pH值（1）在樣品結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的前提下，選擇溶解度最低處的ph值（pI），有利于提高分離效果。（2）適宜的pH可以提高分離的分辨率。例如：糖蛋白絨膜激素（HCG）的提取蛋白質(zhì)（濃度1%）加乙醇至濃度55%加乙醇至濃度66%部分HCG沉淀加入一定醋酸銨調(diào)整pH=5.7

HCG67離子強(qiáng)度對于蛋白質(zhì)和多糖，在有機(jī)溶劑中鹽的濃度一般為0.01-0.05mol/L，不超過5%比較合適。使用乙醇的量不超過兩倍體積為宜。金屬離子的影響一些鋅鈣等陽離子可以在一定PH下，使呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，既不影響活性，還可以提高沉淀程度，在工業(yè)上有很實用的價值。

注意：事先除雜蛋白；避免形成磷酸鋅沉淀。68有機(jī)溶劑的選擇介電常數(shù)小，如丙酮（22）、乙醇（24）、甲醇（33）對生物分子的變性作用小毒性小，揮發(fā)度適中一般需要與水無限混溶。69乙醇：具有沉淀作用強(qiáng)，沸點適中，無毒等優(yōu)點，廣泛用于沉淀蛋白質(zhì)、核酸、多糖及核苷酸、氨基酸等。丙酮：沉淀作用大于乙醇，但具有沸點較低，揮發(fā)大，對肝臟有毒性，易燃等缺點。甲醇：沉淀作用與乙醇相當(dāng)，但對蛋白質(zhì)的變性作用比乙醇，丙酮都小，由于毒性大，也沒于廣泛使用。沉淀有機(jī)物分子沉淀金屬離子常見的螯合劑和絡(luò)合劑：具有—C=N-OH結(jié)構(gòu)，能與二價金屬離子形成螯合物。如水楊酸肟。如鄰氨基苯甲酸等芳香族化合物能與Cu2+、Zn2+、Cd2+、Fe3+等形成絡(luò)合物而沉淀。其他螯合劑或絡(luò)合劑有偶氮類化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉、聯(lián)苯胺、吡啶等，由于其具有強(qiáng)毒性甚至致癌性，并且具有異味，不能使用。羥基肟類：氨基酸類：70有機(jī)溶劑濃度的計算：

v

加入100%濃度有機(jī)溶劑的體積

V0原溶液體積

S1原溶液中有機(jī)溶劑的濃度

S2所要求達(dá)到的有機(jī)溶劑濃度71有機(jī)溶劑添加量計算公式：7212%右旋糖酐上清液37.5-38.5%乙醇沉淀分子量18萬以上右旋糖酐上清液上清液上清液沉淀沉淀沉淀分子量4.5-7萬以上右旋糖酐分子量2.5-4.5萬右旋糖酐分子量1-2.5萬右旋糖酐38.5-42.5%乙醇45%乙醇60%乙醇右旋糖酐的有機(jī)溶劑沉淀分離73２、有機(jī)沉淀劑根據(jù)形成沉淀反應(yīng)機(jī)理的不同，一般可將有機(jī)沉淀劑分為

螯合物型離子締合物型三元絡(luò)合物型。7475Ⅰ．類型：（1）螯合物型有機(jī)沉淀劑螯合物型的沉淀劑種類最多，8一羥基喹啉及其衍生物、丁二酮肟、銅鐵靈、新銅鐵靈、銅試劑、苯肼酸及其衍生物，芳香族氨基酸、苯異三唑等。8一羥基喹啉-M丁二酮肟-Ni銅鐵靈、新銅鐵靈銅試劑（DDTC)與二價金屬離子生成螯合物77（2）離子締合型有機(jī)沉淀劑締合型有機(jī)沉淀劑有：苦杏仁酸及其衍生物，二苦胺，四苯硼酸鈉及聯(lián)苯胺，氯化四苯肼等。78（3）三元絡(luò)合物有機(jī)沉淀劑能形成三元絡(luò)合物沉淀的有機(jī)沉淀劑較少，例如：吡啶在SCN－存在下，可與Ca2+、Co2+、Mn2+、Cd2+、Zn2+等離子形成三元絡(luò)合物沉淀；在Cl-存在下，1,10—鄰二氮雜菲與Pd2+形成三元絡(luò)合物沉淀。79Ⅱ．常用有機(jī)沉淀劑沉淀劑沉淀介質(zhì)適用性與沉淀的離子草酸pH=1~2.5稀土金屬離子

pH=4~5+EDTACa2+，Sr2+，Ba2+銅試劑(二乙基胺二硫代甲酸鈉，簡稱DDTC)pH=5~6Ag+、Pb2+、Cu2+、Cd2+、Bi3+、Fe3+、Co2+

、Ni2+

、Zn2+、Sn（IV）、Sb（III）、Tl（III）pH=5~6+EDTAAg+、Pb2+、Cu2+、Cd2+、Bi3+、Sb（III）、Tl（III）銅鐵試劑(N-亞硝基苯胲銨鹽)3mol/LH2SO4Cu2+、Fe3+、Ti（IV）、Nb（IV）、Ta（IV）、Ce4+

、Sn（IV）、Zr（IV）、V(V)

80五、選擇變性沉淀技術(shù)指利用蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子在某些理化條件的敏感性不同，有選擇的使之變性沉淀，達(dá)到分離提純的目的。這一方法主要用于破壞雜質(zhì)，保存目標(biāo)產(chǎn)物。81方法分類：（1）利用表面活性劑，或者有機(jī)溶劑引起變性。如核酸提取時加入氯仿、苯酚使蛋白質(zhì)變性沉淀。（2）熱變性沉淀分離。利用蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性差異進(jìn)行分離。如黑曲霉發(fā)酵液40℃處理2.5小時，可去除90%淀粉酶，用于制備純度較高的脂肪酶。（3）選擇性酸堿變性。如大豆蛋白酶在pH

2.2以下或12以上發(fā)生變性，溶解度降低。（4）利用酶作用選擇性變性。如凝乳酶催化牛乳酪蛋白沉淀。82六、非離子多聚物沉淀技術(shù)水溶性非離子多聚物沉淀劑：聚乙二醇（PEG），壬苯乙稀化氧（NPEO），葡聚糖，右旋糖酐硫酸鈉。這一方法主要用于提純蛋白、核酸和沉淀一些細(xì)菌及病毒。近年廣泛用于酶的分離純化。83可能機(jī)制：①聚合物與生物大分子爭奪水分，導(dǎo)致大分子脫水沉淀。②聚合物對生物大分子的排斥作用使大分子聚集沉淀。③聚合物與生物大分子共沉淀。④聚合物與生物大分子以氫鍵形式形成復(fù)合物沉淀。非離子多聚物沉淀優(yōu)點：⑴條件溫和，不引起大分子變性；⑵分離效果好，成本低；⑶沉淀分離的選擇性好；⑷多聚物容易去除，可回收。8485七、生成鹽類復(fù)合物沉淀技術(shù)生物大分子和小分子都可以生成鹽類復(fù)合物沉淀。（1）金屬復(fù)合鹽（2）有機(jī)鹽（3）無機(jī)鹽（1）金屬復(fù)合鹽Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+等可以與羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物作用成鹽沉淀（2）有機(jī)鹽法苦味酸、苦酮酸、單寧、茶多酚等可以與蛋白質(zhì)形成復(fù)合鹽并沉淀。（3）無機(jī)鹽法磷鎢酸與磷鉬酸與氨基酸作用形成鹽類復(fù)合物沉淀。8687銅鹽沉淀法制備谷胱甘肽100公斤面包酵母，加入硫酸、乙醇乙醚混合液10L，30℃抽提30min抽濾濾液用濃硫酸調(diào)節(jié)到0.5當(dāng)量酸度40℃攪拌加入4g氧化亞銅，靜置20min過濾硫酸洗滌沉淀；蒸餾水洗滌多次除去硫酸加水溶解谷胱甘肽銅鹽通入硫化氫3h，還原通入氮氣去除硫化氫抽濾加入丙酮，冷庫靜置2天丙酮洗2次，得谷胱甘肽8889八、其它沉淀技術(shù)氨基酸類物質(zhì)的特殊沉淀劑：苯偶氮苯磺酸，2，4-二硝基苯酚-7-磺酸，二氨和硫氰化鉻銨.大分子核酸類物質(zhì)的沉淀劑：多價陽離子魚精蛋白、硫酸鏈霉素.粘多糖類物質(zhì)的沉淀劑：十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物（CTAB），十六烷基氯化吡啶（CPC）。90共沉淀分離所謂共沉淀是指在一種難溶化合物（載體）從溶液析出的同時，由于表面吸附等原因，溶液中某些可溶性雜質(zhì)被沉淀下來而混雜于沉淀中的現(xiàn)象。利用共沉淀作用，可以對痕量組份主要是無機(jī)離子進(jìn)行分離富集。這種富集方法具有快速、簡便、富集倍數(shù)高等特點。因而廣泛用于各種樣品中痕量元素的分離、富集及分析。共沉淀劑可分為無機(jī)共沉淀劑和有機(jī)共沉淀劑兩大類。9192（1）分類：無機(jī)共沉淀劑可分為：吸附共沉淀,混晶共沉淀用得較多的是具有吸附作用的氫氧化物、硫化物的沉淀。如Fe(OH)3、AI(OH)3、Mn(OH)2、PbS、CdS、SnS2、CuS等，都是常用的無機(jī)共沉淀劑。（2）特點：無機(jī)共沉淀劑，比表面積大，因而吸附富集效率高。選擇性不高，但由于痕量組份經(jīng)富集后可用原子光譜法分析，因而不影響測定效果。１、無機(jī)共沉淀劑93（3）常用無機(jī)共沉淀劑共沉淀方式載體共沉淀的離子或化合物吸附共沉淀氫氧化物Fe（OH）3或Al（OH）3Be2+、Ti（IV）、Zr（IV）、Sn（IV）、Cr3+、Co2+

、Ni2+

、Zn2+、Mn2+、ASO43-、PO43-硫化物CuSPb2+、Ni2+

、Cd2+、Ag+、Bi3+、Zn2+、Hg2+PbSCu2+、Ni2+

、Hg2+、Cd2+、Ag+、Bi3+、Zn2+氧化物MnO2Sb（III）、Sb（V）、Sn（IV）、Bi3+、Fe3+

單質(zhì)Te或SeAu（III）、Pd（II）、Pt（IV）、Ag+、Hg2+混晶共沉淀BaSO4Ra2+

、Sr2+、Pb2+

SrCO3Cd2+

MgNH4PO4(MgNH4AsO4)AsO43-LaF3

Th（IV）942、有機(jī)共沉淀劑（1）分類：有機(jī)共沉淀劑可分為：離子締合物

惰性共沉淀膠體的凝聚（2）特點：①富集效率高．可富集PPb級的痕量元素②選擇性高。③有機(jī)載體可借灼燒而揮發(fā)除去，因而不存在基體元素對痕量元素測定的干擾問題。95共沉淀方式載體共沉淀的離子或化合物離子締合物甲基紫（甲基橙、結(jié)晶紫、酚酞）的NH4SCN溶液Zn2+、Co2+

、Hg2+、Cd2+、Mo（VI）

惰性共沉淀8-羥基喹啉+酚酞的乙醇溶液Ag+、Co2+

、Cd2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+

膠體的凝聚動物膠辛可寧單寧硅膠鎢酸鈮酸、鉭酸（3）常用有機(jī)共沉淀劑96甲基紫的NH4SCN溶液沉淀Zn2+（離子締合物）97凝聚和絮凝是兩種方法，兩個概念。凝聚：指在投加的化學(xué)物質(zhì)（鋁、鐵的鹽類）作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成１mm大小塊狀凝聚體的過程。絮凝：指使用絮凝劑（天然的和合成的大分子量聚電解質(zhì)）將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用。凝聚和絮凝98凝聚：膠體粒子在中性鹽促進(jìn)下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（1mm）

機(jī)理：

1）中和粒子表面電荷

2）消除雙電層結(jié)構(gòu)3）破壞水化膜

（一）凝聚Coagulation99發(fā)酵液中菌體表面帶有負(fù)電荷，由于靜電引力使溶液中反離子被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電層。正離子同時受到使它們均勻分布的熱運動影響，具有離開膠粒表面的趨勢。膠體雙電層結(jié)構(gòu)100兩種相反作用力下，雙電層分裂成兩部：1）吸附層或stern層；2）擴(kuò)散層。形成了擴(kuò)散雙電層的結(jié)構(gòu)模型(Gouy-Chapman-Sternmodel)。膠體雙電層結(jié)構(gòu)101雙電層與凝聚ζ電位與擴(kuò)散層厚度δ和電動電荷密度q成正比，而擴(kuò)散層厚度又與溶液中反離子強(qiáng)度和電荷成反比。對帶負(fù)電性菌體的發(fā)酵液，高價陽離子的存在，可壓縮擴(kuò)散層的厚度，促使ζ電位迅速降低，而且化合價越高，這種影響越顯著。102凝聚價或凝聚值在發(fā)酵液中加入具有高價陽離子的電解質(zhì)，能脫除膠粒表面的水化膜，降低ζ電位，使雙電層的排斥力減少，當(dāng)不足以抗衡膠粒間的范德華引力時，由于熱運動的結(jié)果導(dǎo)致膠粒的互相碰撞而聚集起來。電解質(zhì)的凝聚能力可用凝聚價或凝聚值來表示，使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（毫摩爾／升），稱為凝聚價或凝聚值。103Schulze－Hardy法則：反離子的價數(shù)越高，凝聚價越小，即凝聚能力越強(qiáng)。陽離子對帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力受化合價、水化半徑、離子運動能力的影響，次序為Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+104常用的凝聚劑電解質(zhì)有：硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O（明礬）；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3絮凝分離技術(shù)膠體和懸浮物顆粒在絮凝劑作用下橋連成粗大絮凝體的過程稱為絮凝作用。105絮凝沉淀法是在混懸的提取液或提取濃縮液中加入一種絮凝沉淀劑以吸附架橋和電中和方式與懸浮物發(fā)生分子間作用，使之沉降，除去溶液中的粗粒子，以達(dá)到精制和提高成品質(zhì)量目的的一項新技術(shù)。絮凝劑的種類很多，有鞣酸、明膠、蛋清、101果汁澄清劑、ZTC澄清劑、殼聚糖等。106真溶劑分子：1×10-7cm膠體顆粒：1×10-4cm-1×10-7cm懸浮物顆粒：1×10-4cm-1×10-2cm溶解狀態(tài)、穩(wěn)定，可透過濾紙，擴(kuò)散很快，可滲析、不沉淀。膠體狀態(tài)、較穩(wěn)定，能透過濾紙，擴(kuò)散極慢，不能滲析、不易沉淀。不能透過濾紙、不擴(kuò)散、不滲析、短時間內(nèi)不沉淀。膠體和懸浮物的特點：①均為不溶物。②均具有布朗運動，碰撞使小顆粒聚集，進(jìn)而絮凝。③均帶有電荷，這也是膠體和懸浮物顆粒在液體中穩(wěn)定存在的原因。107108絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)，包括離子基團(tuán)以及非離子型基團(tuán)。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生架橋聯(lián)結(jié)時，就形成較大絮團(tuán)，產(chǎn)生絮凝作用。

絮凝109高分子絮凝劑的吸附架橋作用絮凝作用機(jī)理1、顆粒凝集2、雙電層的壓縮和電荷的中和作用3、橋連作用4、沉淀的網(wǎng)捕機(jī)理110膠體由于所帶電荷的斥力大于顆粒布朗運動的動能，所以能夠在液體中穩(wěn)定存在。當(dāng)平衡被打破，即出現(xiàn)脫穩(wěn)狀態(tài)。幾種脫穩(wěn)狀態(tài)：（1）膠體顆粒水化膜具有粘滯力，顆粒間范德華力不足以把顆粒間夾層水化膜完全排斥，此時顆粒雖能夠集結(jié)，但不能直接接觸，稱之為凝聚。（2）當(dāng)顆粒的水化膜粘滯較弱時，顆粒間的范德華力足以把水夾層排擠出去，顆粒間直接接觸，這樣的過程成為凝結(jié)。（3）顆粒的凝聚和凝結(jié)都是膠體脫穩(wěn)并形成細(xì)小凝聚體的過程，這些細(xì)小的凝聚體在絮凝劑的作用下生成體積較大的絮凝體，從水中分離出來，稱之為絮凝過程。1、顆粒凝集111112雙電層的壓縮和電荷的中和作用電解質(zhì)可以中和顆粒表面的電荷而壓縮膠體中的雙電層。膠體的電荷中和作用指由于膠體顆粒表面對帶相反電荷的異電吸附而中和了膠粒的部分電荷，是膠體的ζ點位降低到足以克服斥力產(chǎn)生絮凝沉淀。雙電層的壓縮橋連作用是指溶液中膠體和懸浮顆粒通過有機(jī)或無機(jī)高分子絮凝劑吸附，形成橋架式空間結(jié)構(gòu)的絮凝體的過程。網(wǎng)捕機(jī)理是利用金屬鹽或氧化物沉淀包被膠體或懸浮物形成沉淀。113絮凝值：使膠體溶液產(chǎn)生絮狀沉淀所需的最小電解質(zhì)濃度。絮凝劑的分類：絮凝劑無機(jī)絮凝劑有機(jī)絮凝劑無機(jī)低分子絮凝劑無機(jī)高分子絮凝劑天然有機(jī)高分子絮凝劑人工合成有機(jī)高分子絮凝劑無機(jī)陽離子絮凝劑無機(jī)陰離子絮凝劑鋁鹽無機(jī)高分子絮凝劑鐵鹽無機(jī)高分子絮凝劑人工合成陽離子有機(jī)高分子絮凝劑人工合成陰離子有機(jī)高分子絮凝劑人工合成非離子有機(jī)高分子絮凝劑114115可分為三類：人工合成有機(jī)高分子聚合物、天然有機(jī)高分子聚合物、無機(jī)高分子聚合物1）目前常用的是人工合成有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚乙烯亞胺衍生物；聚丙烯酸類和聚苯乙烯類衍生物。工業(yè)上使用的絮凝劑116

高分子聚合物絮凝劑根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為三類：陰離子型（含有羧基)、陽離子型（含有胺基）、非離子型117聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點用量少，一般以mg/L計量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點：存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)謹(jǐn)慎。目前最常見：聚丙烯酰胺類絮凝劑1182）天然有機(jī)高分子絮凝劑人工合成有機(jī)高分子絮凝劑雖然發(fā)展很快，但還存在著殘留單體有毒，生物降解難等問題，所以其應(yīng)用受到了限制。天然有機(jī)高分子絮凝劑具有無毒，易生物降解，原料來源廣等優(yōu)點。天然有機(jī)高分子改性絮凝劑根據(jù)其原料來源不同可分為淀粉類、纖維素類、植物膠類和聚多糖類。其中淀粉改性絮凝劑的研究開發(fā)最引人注目。1193）無機(jī)高分子聚合物有聚合鐵系和鋁系兩大類鐵系絮凝劑具有操作簡單、費用低，受溫度影響小，親和力強(qiáng)，能有效地去除懸浮物、表面活性劑、破壞油水乳狀液的能力很強(qiáng)等優(yōu)點，缺點腐蝕性強(qiáng)、穩(wěn)定性差。鋁系是目前應(yīng)用廣、工藝較成熟的一類無機(jī)金屬鹽絮凝劑，絮凝效果好，缺點具毒性等。120微生物絮凝劑微生物絮凝劑是近年來研究和開發(fā)的新型絮凝劑，一類由微生物或其分泌物產(chǎn)生的具有絮凝細(xì)胞功能的代謝產(chǎn)物。包括直接利用微生物細(xì)胞的絮凝劑、利用微生物細(xì)胞壁代謝產(chǎn)物的絮凝劑和克隆技術(shù)所獲得的絮凝劑主要成分是糖蛋白、粘多糖、纖維素及核酸等高分子物質(zhì)。微生物絮凝劑和天然絮凝劑與化學(xué)合成的絮凝劑相比，最大的優(yōu)點是安全，無毒和不污染環(huán)境。121微生物絮凝劑1、微生物絮凝劑的商業(yè)化生產(chǎn)始于20世紀(jì)90年代，如紅平紅球菌及由此制成的NOC-1是目前發(fā)現(xiàn)的最佳微生物絮凝劑

2、微生物絮凝劑或?qū)⒋蟛糠痔娲胀ㄐ跄齽?、浮游藻類、草分枝桿茵、硅酸鹽芽孢桿菌。122絮凝的影響因素發(fā)酵液的性質(zhì)（細(xì)胞濃度，表面電荷）；絮凝劑的濃度，最佳用量為粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋；絮凝劑的分子量；pH控制；攪拌速度。影響絮凝效果的幾個因素1、pH對絮凝作用的影響;2、溫度對絮凝作用的影響，一般選擇20-30℃;3、攪拌速度和時間，一般40-80r/min;4、高分子絮凝劑的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)對絮凝作用的影響，線形﹥環(huán)形;5、有機(jī)高分子絮凝劑的相對分子量對絮凝作用的影響，一般在25000以上；6、絮凝劑的用量;123本章內(nèi)容回顧1.機(jī)械破碎法2.物理破碎法3.化學(xué)破碎法4.酶學(xué)破碎法1.高壓勻漿破碎2.珠磨破碎3.噴霧撞擊破碎4.超聲波破碎1.溫度差破碎法（凍融破碎）2.壓力差破碎法124沉淀precipitation

是利用沉淀劑使目標(biāo)產(chǎn)物或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體凝聚物的過程。沉淀技術(shù)的特點沉淀屬于粗分離操作。沉淀技術(shù)具有簡單、經(jīng)濟(jì)和濃縮倍數(shù)高的優(yōu)點。沉淀分離具有選擇性;沉淀生物活性物質(zhì)時需注意沉淀劑或沉淀條件是否會破壞活性；是否有毒；是否易除去。125沉淀技術(shù)的分類鹽析法等電點法有機(jī)溶劑法選擇變性法非離子多聚體法生成鹽復(fù)合物法其它方法126鹽析沉淀技術(shù)鹽析salting-out