第1講 基因工程導(dǎo)論 應(yīng)用和安全性管理 2012

基因工程

geneticengineering生物工程微生物工程基因工程細(xì)胞工程酶工程緒論學(xué)科誕生的理論和技術(shù)基礎(chǔ)基因工程的概念和研究內(nèi)容基因工程的應(yīng)用和發(fā)展基因工程的研究動(dòng)態(tài)基因工程技術(shù)誕生的3大理論基礎(chǔ)▼

20世紀(jì)40年代，O.T.Avery發(fā)現(xiàn)生物遺傳信息的化學(xué)本質(zhì)是DNA而非protein(肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn))

▼20世紀(jì)50年代，Watson-Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型；半保留復(fù)制機(jī)理；解決了基因的自我復(fù)制和傳遞問題

▼20世紀(jì)60年代，相繼提出“中心法則”和操縱子學(xué)說,成功破譯遺傳密碼43，闡明遺傳信息的流向和表達(dá)問題20世紀(jì)40-60年代的3大理論發(fā)現(xiàn)，從理論上確立了基因工程的可能性，但在進(jìn)行基因工程技術(shù)操作時(shí)，

科學(xué)家仍面臨3個(gè)基本技術(shù)問題：①如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需要的基因片段切割下來；②如何將所切割下來的DNA片段進(jìn)行繁殖擴(kuò)增；③如何將所獲得的基因片段重新進(jìn)行連接。

▼“基因剪刀”－限制性內(nèi)切酶

1970年H.O.Smith和K.W.Khorana在流感嗜血桿菌(Haemophilusinffuenzae)中分離純化了第1個(gè)核酸限制性內(nèi)切酶HindⅡ1972年H.W.Boyer實(shí)驗(yàn)室首先發(fā)現(xiàn)EcoRI核酸內(nèi)切酶

基因工程技術(shù)誕生的5大技術(shù)基礎(chǔ)

1970年Baltimove和Temin等同時(shí)各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，完善了遺傳學(xué)中心法則，使真核基因的制備成為可能▼逆轉(zhuǎn)錄酶1、真核基因組龐大而復(fù)雜，基因圖譜不易制得，2、基因多有內(nèi)含子，不能在原核表達(dá)系統(tǒng)剪接出成熟的mRNA，難以獲得相應(yīng)的產(chǎn)物，逆轉(zhuǎn)錄酶的用途：mRNA→cDNA(complementoryDNA）→構(gòu)建文庫、分離目的基因▼連接酶

1967年世界上5個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DNA連接酶：該酶參與DNA單鏈裂口(gap)或缺口(nick)的修復(fù)，連接DNA分子的自由末端

1970年Wisconsin大學(xué)H.G.Khorana實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)T4DNA連接酶活性更高，能催化完全分離的兩段DNA分子進(jìn)行平末端的連接▼載體

早期載體工作的研究對(duì)象：噬菌體；側(cè)重于研究病毒和寄主細(xì)菌間的關(guān)系1946年L.Berg研究細(xì)菌性因子(F因子),50-60年代相繼發(fā)現(xiàn)抗藥性R因子：分子量小，具有抗藥性選擇標(biāo)記和易于操作等優(yōu)點(diǎn)1973年S.Cohen將質(zhì)粒作為基因工程載體使用20世紀(jì)40年代Avery發(fā)現(xiàn)外源DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(肺炎鏈球菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DNA是遺傳信息的攜帶者而非蛋白質(zhì))▼受體1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的細(xì)胞經(jīng)過氯化鈣的適當(dāng)處理后，便能夠吸收λ噬菌體的DNA1972年以后，大腸桿菌成為分子克隆的良好受體20世紀(jì)70年代的上述發(fā)現(xiàn)，從技術(shù)層面上解決了用基因工程改良生物的實(shí)際問題，最終促成了基因工程學(xué)科的誕生第一個(gè)重組體的構(gòu)建

1972年，美國斯坦福大學(xué)P.Berg等在PNAS上發(fā)表了題為∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”，標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生2個(gè)重大歷史事件1972年，美國斯坦福大學(xué)

P.Berg博士等用E.coRⅠ酶切猿猴病毒SV40DNA和λphageDNA后，用T4DNA連接酶將兩種消化片段連接成重組體分子

意義：世界上第一次成功的DNA體外重組實(shí)驗(yàn)

P.Berg的貢獻(xiàn)：

第一個(gè)有功能的重組體的構(gòu)建◆雖然Berg的工作具有劃時(shí)代的意義，但是他們并沒有證明體外重組的DNA分子具有生物學(xué)功能◆1973年，S.N.Cohen等在PNAS上發(fā)表文章“ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,andR.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973）宣布體外構(gòu)建的細(xì)菌質(zhì)粒能夠在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，完善了Berg開創(chuàng)的基因重組技術(shù)Cohen的貢獻(xiàn)：

1973年,斯坦福大學(xué)

S.N.Cohen等將E.coli的R6-5質(zhì)粒DNA：編碼卡那霉素（kanamycin）抗性基因pSC101質(zhì)粒：編碼四環(huán)素（tetracycline）抗性基因

體外切割并連接成重組體分子，轉(zhuǎn)化E.coli，篩選出了具雙抗抗性的菌落,實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移中國的胰島素生產(chǎn)之路：1998年，中國成功研發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因重組人胰島素。世界上三個(gè)能生產(chǎn)基因重組人胰島素的國家：美國、丹麥和中國1982年，第一個(gè)基因工程藥物在美國批準(zhǔn)上市：基因重組人胰島素

（通化東寶-甘舒霖：95年開始研發(fā)，98年成功，2008年規(guī)模生產(chǎn)，亞洲最大）徐州萬邦？BoyerandCohen

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研究策略基因和基因工程的概念

基因（gene）是遺傳學(xué)家約翰（W.Johannsen）在1909年提出來的，他用基因這一名詞來表示遺傳的獨(dú)立單位，相當(dāng)于孟德爾在豌豆試驗(yàn)中提出的遺傳因子孟德爾的遺傳因子階段；摩爾根的基因階段；順反子階段；現(xiàn)代基因階段（操縱子、移動(dòng)、假、斷裂、重疊基因）基因(gene)核酸分子中儲(chǔ)存遺傳信息的遺傳單位，包括編碼功能蛋白質(zhì)或RNA序列信息及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列基因工程(geneticengineering)：“重組DNA技術(shù)”

將外源基因通過體外重組后，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使該基因在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的現(xiàn)代生物技術(shù)目的：獲得由外源基因所編碼的蛋白質(zhì)

改變受體生物的遺傳性狀,創(chuàng)造新的生命特點(diǎn):分子水平操作，細(xì)胞水平表達(dá)基因工程實(shí)施的4個(gè)要素：

工具酶載體基因受體細(xì)胞載體目的基因構(gòu)造DNA重組分子(載體+目的基因)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)(使重組DNA分子進(jìn)入寄主細(xì)胞)表達(dá)(外源基因在寄主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá))基因工程產(chǎn)品的分離純化基因工程的操作流程或促使生物體遺傳性狀發(fā)生改變基因工程研究的主要內(nèi)容基礎(chǔ)研究：針對(duì)基因工程技術(shù)的操作流程應(yīng)用研究：基因工程藥物、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、酶制劑工業(yè)、食品工業(yè)、化學(xué)與能源工業(yè)及環(huán)境保護(hù)等?；蚬こ痰陌踩匝芯?、基因工程載體：核心環(huán)節(jié)；適于高等動(dòng)植物基因的表達(dá)載體和定位整合載體有待大力開發(fā)；2、基因工程工具酶：DNA的體外合成、切割、修飾和連接等一系列過程中需要的酶；3、基因工程新技術(shù)：特殊用途的PCR技術(shù)、電泳技術(shù)、轉(zhuǎn)化技術(shù)（如基因槍和電激儀）；4、基因工程受體系統(tǒng)：原核生物大腸桿菌、藍(lán)細(xì)菌、酵母菌、高等植物的部分組織和器官、動(dòng)物的生殖細(xì)胞或胚細(xì)胞-體細(xì)胞、人的體細(xì)胞-異