第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程復(fù)習(xí)綱要第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

1.光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

2.電子顯微鏡技術(shù)(Electromicroscopy)

第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

1.離心分離技術(shù)

2.細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

3.特異蛋白抗原的定位與定性

4.細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

5.定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞工程1.光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)1.1普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)1.2熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）1.3激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)（LaserConfocalMicroscopy）1.4相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）1.5微分干涉差顯微鏡1.6倒置顯微鏡

倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。微分干涉顯微鏡(DIC)優(yōu)點(diǎn)：能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。

用途：DIC顯微鏡使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，特別是一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強(qiáng)，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。微分干涉顯微鏡(DIC)計(jì)算機(jī)輔助的微分干涉顯微鏡可以得到很高的反差，其分辨率比普通光鏡提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，這不僅填充了普通光鏡與電鏡之間分辨率的間隙，也為高分辨率下研究活細(xì)胞提供了必要工具。2.電子顯微鏡技術(shù)

2.1透射電子顯微鏡的基本知識(shí)2.1.1電鏡與光鏡的比較2.1.2電鏡與光鏡光路圖比較2.1.3電子顯微鏡的基本構(gòu)造

2.1.4主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)2.2掃描電子顯微鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

掃描電子顯微鏡作用：用來觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。工作原理：用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子由探測(cè)體收集，并被轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。

冰凍蝕刻技術(shù)冰凍蝕刻（freeze-etching）也稱冰凍斷裂（freeze-fracture）標(biāo)本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，進(jìn)行冰凍,然后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱為蝕刻（etching）。蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強(qiáng)反差和強(qiáng)度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)。負(fù)染色技術(shù)負(fù)染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達(dá)1.5nm左右超薄切片技術(shù)通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片厚20~50nm普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

分辨率是指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離N=介質(zhì)折射率；α=鏡口角，λ=入射光波長熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）1.2.1原理：高壓汞燈，激發(fā)濾片，阻斷濾片

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

免疫熒光標(biāo)記技術(shù)（間接標(biāo)記）1.2.2應(yīng)用

在光鏡水平用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

綠色熒光蛋白GFP是一個(gè)分子量較小的蛋白，易與其他一些目的基因產(chǎn)物形成融合蛋白，且不影響目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。GFP與目的基因融合，將目的基因產(chǎn)物標(biāo)記為綠色，可定量分析目的基因的表達(dá)水平，顯示其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置和量的變化，為探討該基因在細(xì)胞中的作用及其分子機(jī)制提供便利條件。

/view/957211.htm尼康E800熒光DIC顯微鏡熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）1.3激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）1.3.1原理:物鏡與聚光鏡聚焦于同一點(diǎn)上，排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。1.3.2應(yīng)用：可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量。

激光掃描共聚焦顯微境

LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管原理：將相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，從而提高各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度。結(jié)構(gòu)：環(huán)狀光瀾，相差物鏡用途：可用于觀察活細(xì)胞

相差顯微鏡電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造2.3掃描電鏡原理與應(yīng)用：電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。CO2臨界點(diǎn)干燥法可以消除引起樣品變形的表面張力問題1.離心分離技術(shù)

1.1用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物1.2種類:

差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器.

密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離，常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。2.細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些 特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

3.特異蛋白抗原的定位與定性

（免疫細(xì)胞化學(xué)）定義：根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對(duì)抗原進(jìn)行定位測(cè)定的技術(shù)。分為直接免疫熒光魚間接免疫熒光

。3.1免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限（圖）

3.2免疫電鏡技術(shù)：免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等直接免疫熒光魚間接免疫熒光4.細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

（原位分子雜交技術(shù)）用來檢測(cè)染色體上的特殊DNA序列。最初是使用帶放射性的DNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。后來又發(fā)明了免疫探針法，將探針核苷酸的側(cè)鏈加以改造，探針雜交后，其側(cè)鏈可被帶有熒光標(biāo)記的抗體所識(shí)別，從而顯示出位置。4.1光鏡水平的原位雜交技術(shù)

探針用同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記

4.2電鏡水平的原位雜交技術(shù)

探針用生物素標(biāo)記,檢測(cè)用與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記顯示

免疫探針法人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片5.定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)5.1

細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜的吸收，測(cè)定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。5.2流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）：流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；分離DNA含量不同的中期染色體。

1.細(xì)胞培養(yǎng)

活細(xì)胞離體后要在一定的生理?xiàng)l件下才能存活和進(jìn)行生理活動(dòng)，特別是高等動(dòng)植物細(xì)胞要求的生存條件極其嚴(yán)格，稍有不適就要死亡。所以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture）就是選用最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞的生存環(huán)境與植物細(xì)胞差別很大，因而二者的培養(yǎng)方法很不相同。1.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)1.2植物細(xì)胞培養(yǎng)1.3非細(xì)胞體系（cell-freesystem）1.2植物細(xì)胞培養(yǎng)1.2.1組織培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，如果條件適宜，可培養(yǎng)出再生植株。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和遺傳變異；進(jìn)行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。1.2.2懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：在愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種培養(yǎng)技術(shù)。適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。1.2.3原生質(zhì)體培養(yǎng)：脫壁后的植物細(xì)胞稱為原生質(zhì)體（protoplast），其特點(diǎn)是：①比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA；②便于進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞；③與完整細(xì)胞一樣具有全能性，仍可產(chǎn)生細(xì)胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株：1.2.4單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株，經(jīng)人為加倍后可得到完全純合的個(gè)體。植物細(xì)胞培養(yǎng)1.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（一）培養(yǎng)方式大致可分為兩種：1.1.1群體培養(yǎng)（massculture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層；1.1.2克隆培養(yǎng)（clonalculture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克隆（clone）。1.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（二）

原代培養(yǎng)（primaryculture）：從動(dòng)物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長比較緩慢，而且繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長，需要重新更換培養(yǎng)基。將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。

細(xì)胞株（cellstrain）：從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。細(xì)胞系（cellline）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖克?。╟lone）：亦稱無性繁殖系或簡稱無性系。對(duì)細(xì)胞來說，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）2.細(xì)胞工程即細(xì)胞水平的生物工程,使用的主要技術(shù)有細(xì)胞培養(yǎng)、定向誘導(dǎo)分化、細(xì)胞融合和顯微注射等。2.1細(xì)胞融合（cellfusion）技術(shù)2.2單克隆抗體（monocloneantibody）技術(shù)2.3顯微操作技術(shù)

細(xì)胞融合通過培養(yǎng)和誘導(dǎo)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合（cellfusion）或細(xì)胞雜交（cellhybridization）。基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞稱為同核體，來自不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體。誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有三種：生物方法（病毒）、化學(xué)方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電激和激光）。某些病毒如：仙臺(tái)病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合，也可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合，因此可以用紫外線滅活的此類病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合。化學(xué)和物理方法可造成膜脂分子排列的改變，去掉作用因素之后，質(zhì)膜恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)，在恢復(fù)過程中便可誘導(dǎo)相接觸的細(xì)胞發(fā)生融合。LightPathwayofMicroscopeDAPI染色顯示的前中期染色體明視場(chǎng)與相差的觀察效果比較DIC顯微鏡下的硅藻冰凍蝕刻電鏡照片