疫苗制備工藝

疫苗制備工藝

在發(fā)展中國家，死亡總?cè)藬?shù)的30%～50%死于傳染病。

在發(fā)達國家，傳染病死亡人數(shù)僅占死亡總?cè)藬?shù)的4%～8%，主要得益于疫苗的廣泛應(yīng)用。第一部分

疫苗概述

疫苗與藥物的不同點一般藥物疫苗對象年齡目的種類結(jié)果病人健康人群不同年齡段的患者嬰幼兒和兒童治療疾病/減輕病人的癥狀通過免疫機制使健康人預(yù)防疾病天然藥物、化學(xué)合成藥物、生物藥品等生物制品減輕病痛徹底控制消滅某一種疾?。ㄈ纾禾旎ā⒓顾杌屹|(zhì)炎）第一節(jié)

疫苗概念的產(chǎn)生及其背景一、疫苗的產(chǎn)生及其背景"12世紀(jì)，中國開始用人痘接種預(yù)防天花"

----《疫苗可預(yù)防疾病的流行病學(xué)與預(yù)防學(xué)》

第6版（2000年）

美國疾病控制與預(yù)防中心出版天花（Smallpox）臨床表現(xiàn)：主要為嚴重毒血癥狀（寒戰(zhàn)、高熱、乏力、頭痛、四肢及腰背部酸痛，體溫急劇升高時可出現(xiàn)驚厥、昏迷）、皮膚成批依次出現(xiàn)斑疹、丘疹、皰疹、膿皰，最后結(jié)痂、脫痂，遺留痘疤。傳播途徑：飛沫吸入或直接接觸；來勢兇猛，發(fā)展迅速，對未免疫人群感染后15-20天內(nèi)致死率高達30％。天花（Smallpox）由天花病毒引起的一種烈性傳染病，患者在痊愈后臉上會留有麻子，故名“天花”。天花病毒：外觀：呈磚形（200納米×300納米）抵抗力較強：能對抗干燥和低溫，在痂皮、塵土和被服上，可生存數(shù)月至一年半之久天花的防治----中國宋真宗時期(998-1023年)

：人痘法--預(yù)防天花醫(yī)者從癥狀輕微的天花病人身上進行人工接染到健康兒童，使其通過產(chǎn)生輕微癥狀的感染獲得免疫力，避免天花引起的嚴重疾病甚至死亡明朝隆慶年間(1567-1572年)：人痘法--趨于完善人痘衣法、痘漿法、旱痘法和水苗法等多種接種方法人痘法的缺點：有時也會引起嚴重的天花天花的防治----歐洲1721年，人癥接種法傳入英國英國醫(yī)生E.Jenner(1749-1823)1796年，利用牛痘防治天花1798年，醫(yī)學(xué)界正式承認"疫苗接種確實是一種行之有效的免疫方法"。1980年，世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布:全球消滅了天花疫苗之父---法國免疫學(xué)家LouisPasteur細菌的分離培養(yǎng)技術(shù)減毒菌株的獲得連續(xù)傳代培養(yǎng)法（1870年）雞霍亂弧菌減毒株（第一個細菌減毒活疫苗）高溫培養(yǎng)法（1881年）炭疸菌苗異體傳代法：將狂犬病毒在兔體內(nèi)經(jīng)連續(xù)傳代，獲得了減毒株

巴氏減毒菌苗的發(fā)明：為實驗免疫學(xué)建立了基礎(chǔ)疫苗的定義一切通過注射或黏膜途徑接種，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對特定致病原的特異性抗體或細胞免疫，從而使機體獲得保護或消滅該致病原能力的生物制品，統(tǒng)稱為疫苗包括:蛋白質(zhì)、多糖、核酸、活載體或感染因子等二、疫苗的種類1.按所用材料分類：細菌性疫苗（舊稱：菌苗）病毒性疫苗（舊稱：疫苗）類毒素2

.按疫苗研制技術(shù)分類：傳統(tǒng)疫苗滅活疫苗減毒活疫苗亞單位疫苗：用天然微生物的某些成分制成新型疫苗項目減毒活疫苗滅活疫苗亞單位疫苗抗原用減毒或無毒的全病原體作為抗原用化學(xué)或物理方法將病原體殺死以化學(xué)方法獲得病原體的某些具免疫原性的成分免疫機理接種后病原體在體內(nèi)有一定生長繁殖能力，類似隱性感染，產(chǎn)生細胞、體液和局部免疫病原體失去毒力但保持免疫原性，接種后產(chǎn)生特異抗體或致敏淋巴細胞接種后能刺激機體產(chǎn)生特異性免疫效果優(yōu)缺點接種次數(shù)少，反應(yīng)小，免疫效果持久。穩(wěn)定性較差，并應(yīng)考慮減毒株毒力返祖問題一般要接種2-3次，反應(yīng)較大，維持時間較短。穩(wěn)定性好，較安全制品純度較高，副反應(yīng)小，需多次接種常用疫苗卡介苗、麻疹、鼠疫、脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗傷寒、霍亂、百日咳、乙腦、脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗白喉、破傷風(fēng)類毒素，A群腦膜炎球菌多糖疫苗新型疫苗基因工程亞單位疫苗基因工程載體疫苗核酸疫苗基因缺失活疫苗重組疫苗合成肽疫苗抗獨特型抗體疫苗新型疫苗基因工程亞單位疫苗----滅活疫苗基因工程載體疫苗--------活疫苗核酸疫苗-------------------------------特殊的疫苗基因缺失活疫苗----------滅活疫苗重組疫苗--------------------滅活疫苗合成肽疫苗-----------------滅活疫苗抗獨特型抗體疫苗--------滅活疫苗疫苗的發(fā)展經(jīng)典的病毒疫苗和細菌疫苗

寄生蟲疫苗、腫瘤疫苗、避孕疫苗等;預(yù)防性疫苗

治療性疫苗。三、疫苗的基本成分、性質(zhì)和特征1.疫苗的基本成分抗原佐劑防腐劑穩(wěn)定劑滅活劑緩沖液、鹽類等非活性成分（1）抗原:疫苗最主要的有效活性成分基本條件異物性一定的理化特性特異性滅活病毒或細菌活病毒或細菌/減毒株病毒或菌體提純物有效蛋白成分類毒素細菌多糖合成多肽DNA。（2）佐

劑理想的佐劑：增強抗原免疫應(yīng)答無毒、安全在非冷藏條件下保持穩(wěn)定作用機制改變抗原的物理形狀，延長抗原在機體內(nèi)保留時間；刺激單核吞噬細胞對抗原的提呈能力；刺激淋巴細胞分化，增加擴大免疫應(yīng)答能力。常規(guī)免疫佐劑：常規(guī)免疫佐劑：鋁鹽類佐劑、蜂膠佐劑、油水乳劑。新型免疫佐劑：新型免疫佐劑：細胞因子、CpGDNA、基因工程減毒素、免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)、脂質(zhì)體。按物理性質(zhì)生物學(xué)性質(zhì)佐劑在體內(nèi)的存留時間顆粒性佐劑非顆粒性佐劑微生物及其組分非微生物物質(zhì)貯存型佐劑非貯存型佐劑其他分類：鋁鹽類佐劑蜂膠佐劑油水乳劑（一）常規(guī)免疫佐劑常規(guī)佐劑1：鋁鹽類佐劑1）氫氧化鋁膠：鋁膠。

2）明礬：硫酸鋁鉀制成10%溶液，高壓滅菌；調(diào)菌液pH至8±0.1，加入明礬液1~2%，充分混勻。

3）磷酸三鈣：在疫苗中加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，使在疫苗中化合成磷酸三鈣，吸附抗原后沉淀。常規(guī)佐劑2：蜂膠(propolis)

蜜蜂采自柳樹、楊樹、栗樹和其它植物幼芽分泌的樹脂，并混入蜜蜂上顎腺分泌物，以及蜂蠟、花粉、其它一些有機和無機物的一種天然物質(zhì)。是一種天然的免疫增強劑。常規(guī)佐劑3：油水乳劑佐劑

由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑，是制備獸用滅活疫苗時廣泛運用的另一種佐劑。免疫刺激復(fù)合物細胞因子類CpGDNA（二）新型免疫佐劑（3）防腐劑目的：防止外來微生物的污染大多數(shù)的滅活疫苗都使用防腐劑硫柳汞硫柳汞副作用：接觸性皮炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、耳毒性（4）穩(wěn)定劑保證作為抗原的病毒或其他微生物存活，并保持免疫原性；凍干疫苗中常用的乳糖、明膠、山梨醇等。

滅活（inactivation）：破壞微生物的生物學(xué)活性、繁殖能力和致病性，但不損害其免疫原性，用以制備滅活疫苗。滅活方法：物理方法：加熱、紫外線和射線照射化學(xué)方法：化學(xué)試劑，如甲醛，β-丙內(nèi)酯等。甲醛是最常用的滅活劑。

滅活劑（inactivator）：用于滅活微生物的化學(xué)試劑如甲醛溶液、烷化劑、苯酚、結(jié)晶紫、β-丙酰內(nèi)脂等。（5）滅活劑(一)甲醛溶液(Formaldehydesolution)

甲醛為無色氣體，有強烈的刺激性，對眼、鼻黏膜和上呼吸道有刺激性。易溶于水合乙醇。其水溶液（36%～40%）稱為福爾馬林(Formalin)。甲醛最古典的滅活劑，但也是目前最主要的滅活劑。

滅活機理：甲醛的醛基與蛋白質(zhì)的氨基、羧基、羥基和巰基反應(yīng)，分別形成羥甲基胺、亞甲基二醇單酯、羥甲基酚和硫代亞甲基二醇等，使病毒、細菌等微生物的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，從而使其失活。但對其免疫原性無明顯影響。另外，甲醛還可以與核酸中的堿基（A、G和C）上的氨基反應(yīng)，與核糖體蛋白的氨基反應(yīng)，從而影響核酸和核糖體的功能。無囊膜的二十面體對稱病毒有囊膜的二十面體對稱病毒有囊膜的螺旋對稱病毒甲醛與蛋白的氨基結(jié)合形成羥甲基或二羥甲基衍生物，后者與酰胺或胍基團反應(yīng)導(dǎo)致蛋白變性。甲醛與核酸中含氨基的A、G、C反應(yīng)使核酸變性。滅活用甲醛濃度：

基本原則：濃度隨不同微生物而異。

1）需氧菌：0.1%～0.2%。

2）厭氧菌：0.4%～

0.5%。

3）病毒：0.05%～0.4%

。其他滅活條件：37℃，24～48hrs。有時滅活時間會更長，如破傷風(fēng)類毒素用0.4%的甲醛，37℃需滅活21～

23天。（二）烷化劑(alkylatingagent)AEI：N-乙?；蚁﹣啺稡EI：二乙烯亞胺GDA：縮水甘油醛烷化劑的滅活機制：1）烷化DNA分子中的G或A，引起單鏈斷裂或雙鏈交聯(lián)，改變DNA的結(jié)構(gòu)而破壞其功能。

2）可與酶系統(tǒng)和核蛋白起作用而干擾核酸代謝。這類滅活劑能破壞病毒的核心，使病毒完全喪失感染力，一般不損害其衣殼蛋白，故能維持其免疫原性。滅活機制：使微生物的蛋白質(zhì)變性，或抑制微生物的特異酶系統(tǒng)，使其失去活性。制備疫苗時的用量：0.3%～0.5%。（三）苯酚(phenol)（四）結(jié)晶紫(crystalviolet)

一種堿性染料。

滅活機制：其陽離子與微生物蛋白質(zhì)帶負電的羥基形成弱電性化合物，妨礙微生物的正常代謝。（五）β-丙內(nèi)酯(propiolactone,β-PL)

一種良好的病毒滅活劑，但具有致癌性

作用機理：可能是作用于病原體的DNA和RNA，而不直接作用于蛋白，有利于維持病毒的免疫原性。

1984年被選為狂犬病滅活苗的制備。篩選滅活劑的基本原則：

選擇合適的滅活劑，或研發(fā)更為優(yōu)良的滅活劑是生物制品行業(yè)的一項重要工作。目前，甲醛最常用，N-乙?；蚁﹣啺?AEI)和二乙烯亞胺(BEI)也被使用。篩選原則：

1）病原體完全滅活：安全性好

2）最大限度的保持病原體的抗原性：在消除病原體感染性的同時，維持其蛋白質(zhì)天然的三維結(jié)構(gòu)和抗原表位等。

3）滅活步驟更為簡單有效。（6）緩沖液、鹽類

緩沖液的種類、鹽類的含量都可影響疫苗的效力、純度和安全性，因此都有嚴格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第二部分疫苗制備工藝

菌種的選擇菌液培養(yǎng)滅活

配苗濃縮

菌種的選擇菌液培養(yǎng)滅活濃縮配苗細菌性滅活疫苗簡稱滅活菌苗，種類、苗型甚多，但制造的基本程序差別不大。一、細菌性疫苗制備工藝○細菌性滅活疫苗制造（一）菌種與種子

1.菌種

制苗用菌種多數(shù)為毒力強、免疫原性優(yōu)良的菌株，通常使用1-3個品系，均由中國藥品生物制品檢定所或中國獸藥監(jiān)察所傳代、鑒定、凍干保存和供應(yīng)。各種用于制造菌苗的菌種應(yīng)按規(guī)定定期復(fù)壯，并進行形態(tài)、培養(yǎng)特性、菌型、抗原性和免疫原性鑒定，合格菌種準(zhǔn)許用于制苗。2.種子培養(yǎng)將經(jīng)鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)的菌種接種于菌苗生產(chǎn)規(guī)程中所規(guī)定的培養(yǎng)基進行增殖培養(yǎng)，經(jīng)檢查、活菌計數(shù)達到標(biāo)準(zhǔn)后即為種子液，用于菌苗生產(chǎn)。種子液通常保存于2-8C冷暗處，不得超過規(guī)程規(guī)定的使用期限。菌種的選擇菌液培養(yǎng)滅活濃縮配苗（二）菌液培養(yǎng)

大量生產(chǎn)的細菌培養(yǎng)方法甚多，既有手工式的，也有機械化或自動化的培養(yǎng)方式。機械化或自動化的培養(yǎng)方式通稱為反應(yīng)缸培養(yǎng)法，可供選擇的菌液培養(yǎng)法有：液體靜置培養(yǎng)法、液體深層通氣培養(yǎng)法、透析培養(yǎng)法及連續(xù)培養(yǎng)法等。

菌液培養(yǎng)也可采用固體培養(yǎng)法，該方法易獲得高濃度的細菌懸液，易稀釋成不同濃度，且含培養(yǎng)基的成分較少，所以比較適用于制備診斷用的抗原。菌種的選擇菌液培養(yǎng)滅活濃縮配苗（三）滅活

滅活菌苗通常根據(jù)細菌的特性加入最有效的滅活劑，采取最適當(dāng)?shù)臏缁顥l件進行，幾種滅活菌苗的滅活方法如表所示。表幾種滅活菌苗的滅活方法

菌種的選擇菌液培養(yǎng)滅活濃縮配苗（四）濃縮

為提高某些滅活菌苗的免疫力，在培養(yǎng)過程中采取提高菌數(shù)的基礎(chǔ)上，再通過濃縮方法達到目的。常用的濃縮方法：氧化鋁膠吸附沉淀法離心沉降法羧甲基纖維沉淀法

以上方法可使菌液濃縮一倍以上。

菌種的選擇菌液培養(yǎng)滅活濃縮配苗

（五）配苗與分裝

由于滅活菌苗所用的佐劑不同，所以配苗方法也不相同。

氫氧化鋁菌苗：可在加入甲醛滅活的同時，按比例加入氫氧化鋁膠配制；也可在菌液經(jīng)甲醛滅活后再按比例加入氫氧化鋁膠配苗。有的廠油佐劑菌苗的配制程序為：于滅菌的油乳劑135m110號白油、11.4m1Span-85、3.6mlTween80混合液中，在邊攪拌下加入等量甲醛滅活菌液配制。配苗和分裝：應(yīng)充分混勻，及時塞塞、貼簽或印字。菌種的選擇菌液培養(yǎng)滅活濃縮配苗弱毒菌種多系凍干品，由中國藥品生物制品檢定所或中國獸藥監(jiān)察所傳代、鑒定、保存與分發(fā)，少數(shù)由國家指定單位鑒定、保存與供給。菌種使用前應(yīng)按規(guī)程規(guī)定進行復(fù)壯、挑選，并作形態(tài)、特性、抗原性和免疫原性鑒定，符合標(biāo)準(zhǔn)后方可用于制苗。將檢定合格的菌種接種于規(guī)定的培養(yǎng)基，按規(guī)定的條件增殖培養(yǎng)，經(jīng)檢查合格者即可作為種子液。種子液通常在0～4C可保存2個月，在保存期內(nèi)可作為菌苗生產(chǎn)的批量種子使用。

細菌性活疫苗多指弱毒菌苗，盡管種類與苗型甚多，但基本制造程序相同。（一）菌種與種子○細菌性活疫苗制造菌種的選擇菌液培養(yǎng)濃縮配苗按1%～3%量將種子液接種于培養(yǎng)基，然后依不同菌苗要求進行培養(yǎng)。如豬丹毒弱毒菌須在在深層通氣培養(yǎng)中加入適當(dāng)植物油作消泡劑，通入過濾除菌的熱空氣進行培養(yǎng)制造菌液如人用炭疽活疫苗、卡介苗經(jīng)固體表面培養(yǎng)完成后須按規(guī)定要求將菌苔洗下制成菌液菌液于0～4C暗處保存，待抽樣經(jīng)活菌數(shù)等檢查合格后使用。（二）菌液培養(yǎng)菌種的選擇菌液培養(yǎng)濃縮配苗

經(jīng)檢驗合格的菌液，按規(guī)定比例加入保護劑配苗，充分搖勻后隨即進行分裝，分裝量必須準(zhǔn)確。分裝好的菌苗迅速送入凍干柜進行預(yù)凍、真空干燥，凍于完畢后立即加塞、抽空、封口，移入冷庫保存，并由質(zhì)檢部門抽樣檢驗。（四）配苗與凍干

為提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可進行濃縮，以提高單位活菌數(shù)，常用的依縮方法有吸附劑吸附沉降法、離心沉降法等，如于豬丹毒菌液內(nèi)加入0.2%～0.25%羧甲基纖維素(CMC)進行濃縮，也可用離心沉淀濃縮。濃縮菌液應(yīng)抽樣作活菌數(shù)等檢查。（三）濃縮菌種的選擇菌液培養(yǎng)濃縮配苗流程圖1——細菌疫苗制造工藝流程蛋白質(zhì)、肉浸液等原料培養(yǎng)基細菌分離菌種弱毒菌種配置、滅菌鑒定減毒檢驗配制滅菌檢驗配制滅菌原料佐劑滅活菌液配苗、乳化滅活疫苗培養(yǎng)菌苗原液配苗活疫苗保護劑菌液分裝、凍干分裝滅活原料活化種子舉例白喉疫苗外毒素對神經(jīng)系統(tǒng)損害細菌產(chǎn)生的外毒素對心肌損害外毒素對腎臟損害白喉曾經(jīng)是對兒童威脅非常大的傳染病。它是由白喉棒狀桿菌引起的一種呼吸道傳染病主要臨床表現(xiàn)為上呼吸道發(fā)炎，常常表現(xiàn)在咽部，有時在鼻腔、喉部和氣管，白喉流行三個特點傳染原：白喉桿菌是嚴格寄生于人類的細菌沒有中間宿主，病人及帶菌者是一的傳染原。傳播途徑：主要是呼吸道飛沫傳播，也可通過被污的器具和食物傳播。易感人群：人對白喉普遍易感，新生兒1歲時白喉易感性達高峰。二、病原學(xué)白喉棒狀桿菌菌體一端或兩端膨大呈棒狀，有著色較深的異染顆粒，革蘭氏染色陽性，白喉桿菌無動力，無莢膜，不行成芽孢。白喉桿菌是需氧菌，最適溫度為34～35℃。能分解葡萄糖、麥芽糖和糊精，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚，不消化蛋白。白喉桿菌對抗生素有不同程度敏感，對青霉素和紅霉素極敏感；對消毒劑抵抗力弱，1％石碳酸1min或3％苯酚10min可將該菌殺死。不耐熱，58℃10min或100℃1min即可被殺死。白喉是由白喉桿菌產(chǎn)生毒性很強的外毒素引起的三、白喉毒素白喉毒素對人和動物都引起致死性毒性，如心臟、腎上腺、肝、腎、胰及神經(jīng)組織等均受到損害。白喉毒素是單一多肽，由560個氨基酸組成，分子量為62kDa,等電點pH4.1，在pH6時加熱55℃很快失活。通過物理和化學(xué)方法將其純化。四、白喉類毒素細菌毒素甲醛類毒素類毒素：用0.3%～0.4%甲醛溶液對外毒素進行脫毒處理后獲得的失去毒性但仍保留其免疫原性（抗原性）的生物制品。白喉和破傷風(fēng)疫苗是兩種常用的基于類毒素的疫苗制劑。在白喉毒素生產(chǎn)的最初階段需要培養(yǎng)白喉棒狀桿菌，然后處理產(chǎn)生的毒素來制備類毒素。破傷風(fēng)的生產(chǎn)工藝類似。影響脫毒因素甲醛濃度溫度PH脫毒溫度、pH和甲醛濃度等均影響脫毒效果溫度越高脫毒越快，超過40℃影響抗原性，一般37～38℃。在酸性時脫毒較慢，但游離甲醛含量高，可導(dǎo)致脫毒過甚；在堿性時脫毒快，但抗原性損失較大，一般采用弱堿性。甲醛濃度大則脫毒快，但抗原損失大。

五、白喉疫苗工藝流程示意圖

菌種（PW8株）

傳代擴增3～4代

發(fā)酵罐培養(yǎng)34～35℃培養(yǎng)40～48h對數(shù)生長末期收獲，甲苯殺菌。離心去菌體收集清液超濾濃縮3萬分子量超濾濃縮

硫酸銨鹽析兩段鹽析除鹽除菌氨離子及無菌檢查脫毒0.5％甲醛液37℃40～50天脫毒試驗（家兔）原液檢定（濃度、純度、安全等）

Al(OH)3吸附

成品檢定（安全、效價等）二、病毒疫苗制造

病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制造

病毒性細胞培養(yǎng)疫苗制造

病毒性動物組織疫苗制造病毒性禽胚培養(yǎng)疫苗制造

痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和皰疹病毒等一類生物制品，目前仍然利用禽胚特別是雞胚制備，如雞新城疫苗、禽流感疫苗、犬瘟熱雞胚弱毒疫苗等。禽胚疫苗生產(chǎn)的原材料來源方便、質(zhì)量比較容易控制，制造程序簡單，不需要過高的設(shè)備條件，生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量可靠。雞胚選擇種毒與毒種繼代接毒與收獲配苗（一）雞胚選擇

受精卵應(yīng)來自SPF雞群，至少源于未用抗生素藥物的非免疫雞群，以免受母源抗體的干擾和殘留抗生素的影響。從受精卵入孵開始至培養(yǎng)全過程都應(yīng)保持無菌，要求一定的溫度和濕度，且需不斷翻動，然后選擇。選擇一定日齡、發(fā)育正常的胚用于接毒培養(yǎng)。（二）種毒與毒種繼代

目前適應(yīng)于雞胚的種毒多系弱毒，包括自然弱毒與人工培育的弱毒兩類。各種制苗用的種毒多數(shù)由國家菌毒種保藏部門或指定單位保存，保存的種毒多為凍干毒。凍干毒種需按規(guī)定要求在雞胚繼代復(fù)壯，通常繼代3代以上，經(jīng)檢定符合標(biāo)準(zhǔn)后方可作為生產(chǎn)疫苗的毒種，毒種檢定內(nèi)容包括無菌檢驗、毒價測定和其他項目的檢定等。種毒與毒種繼代雞胚選擇接毒與收獲配苗（三）接毒與收獲

雞胚接毒涉及接毒途徑和接毒量兩方面。根據(jù)不同的病毒與不同疫苗生產(chǎn)程序，選擇最佳接種途徑和接種量。接種途徑：絨毛尿囊膜接種11~12日齡胚尿囊腔接種9~11日齡胚羊膜腔接種10~12日齡胚卵黃囊接種5~8日齡胚如雞新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接種10-3稀釋毒種0.1ml，后者接種10-4稀釋毒種0.1ml。鴨瘟雞胚化弱毒疫苗采用絨毛尿囊膜接種50-100倍稀釋毒0.2ml。1.接毒接毒與收獲雞胚選擇種毒與毒種繼代配苗

雞胚接毒后培養(yǎng)增殖的時間和溫度、濕度以及收獲的標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)容物依不同的病毒和不同的疫苗而異。如雞新城疫I系疫苗，接毒后于38.5~39C、相對濕度60%~70%條件培養(yǎng)增殖，收集接毒后24~48h內(nèi)死亡胚，置0~10C冷卻4~24h，收獲胚液，進行無菌檢驗，供制備濕苗用。也可收獲胚液、胎兒及絨毛尿囊膜混合制成乳劑制備凍干苗。鴨瘟雞胚化弱毒疫苗，則收集接毒后48~120h內(nèi)死亡的雞胚，冷卻后采取絨毛尿囊膜、尿囊液、胎兒制造凍干苗用。2.培養(yǎng)收獲

按規(guī)定收獲的胚液、胎兒和絨毛尿囊膜乳劑經(jīng)無菌檢驗合格后即可進行配苗。

1.濕苗通常于雞胚液內(nèi)，按每毫升加入青霉素和鏈霉素500~1000U，放置0~10C冷暗處處理后分裝。

2.凍干苗經(jīng)無菌檢驗后合格的胚液或胚液、胎兒、絨毛尿囊膜乳劑，按比例加入保護劑，充分混合后濾過，于濾液內(nèi)按每毫升加入青、鏈霉素500~1000U，混合后分裝凍干。

3.滅活苗

收獲雞胚液經(jīng)無菌檢驗及毒價測定合格后，按規(guī)定比例加入平衡液，按不同病毒的滅活溫度、時間進行滅活，加入相應(yīng)的佐劑，制備成滅活疫苗，放置4-10C保存。（四）配苗配苗雞胚選擇種毒與毒種繼代接毒與收獲流程圖2——病毒性禽胚疫苗制造工藝流程受精卵禽胚毒株種毒滅活病毒液鑒定培育檢驗檢驗配制原料佐劑配苗、乳化滅活疫苗含病毒尿囊液或禽胚組織含病毒懸液配苗活疫苗保護劑分裝、凍干分裝滅活原料種子擴增收獲配制純化病毒懸液接種病毒性細胞培養(yǎng)疫苗制造

細胞培養(yǎng)疫苗有細胞培養(yǎng)滅活疫苗和細胞培養(yǎng)活疫苗兩類，前者多以強毒毒株培養(yǎng)增殖制造，后者則用弱毒毒株增殖生產(chǎn)，兩者的制造程序既有相同之處，又有區(qū)別。由于病毒不同與疫苗性質(zhì)不同，所采用的細胞及細胞培養(yǎng)方法也有所不同接毒與收獲種毒與毒種繼代配苗細胞制備（一）種毒與毒種繼代

用于制苗用的種毒應(yīng)經(jīng)毒力、最小免疫量、安全性、無菌檢定合格，通常為凍干品，由國家指定的苗毒種保藏部門檢定分發(fā)。領(lǐng)取的種毒應(yīng)按規(guī)定在細胞繼代培養(yǎng)適應(yīng)后用作毒種，制苗用毒種應(yīng)按規(guī)定控制在一定代數(shù)以內(nèi)，或為濕毒毒種，或為凍干毒種。

制造疫苗用的細胞大體為原代細胞和傳代細胞兩類，根據(jù)病毒種類、疫苗性質(zhì)與工藝流程選擇不同的細胞。

選擇的依據(jù)包括：病毒的適應(yīng)性高、毒價高、細胞來源方便、制備簡單、生命力強。如豬瘟兔化弱毒牛睪丸細胞疫苗采用犢牛睪丸原代細胞；脊髓灰質(zhì)炎活疫苗選擇vero細胞；狂犬病弱毒細胞適應(yīng)疫苗采取BHK21細胞增殖病毒等。（三）細胞制備

接毒與收獲種毒與毒種繼代配苗細胞制備

培養(yǎng)細胞和增殖病毒用的營養(yǎng)液又稱培養(yǎng)液，通常分為細胞培養(yǎng)用的生長液和病毒增殖用的維持液，兩者不同的之處通常只是生長液內(nèi)含有5%-10%的血清；維持液血清濃度為2%-5%。不同細胞所需的營養(yǎng)成分和生長條件不盡相同。目前常用的細胞培養(yǎng)方法為靜止培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，至于微載體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)在我國尚處于試驗之中。（四）接毒與收獲

病毒接種培養(yǎng)有同步與異步之分，前者在細胞分裝同時或不久接種毒種，進行培養(yǎng)，如貓、犬傳染性腸炎疫苗(細小病毒)；后者在細胞形成單層后接種毒種，如流行性乙型腦炎細胞培養(yǎng)疫苗。通常在細胞形成單層后傾去培養(yǎng)液，按1%-2%量接種毒種，經(jīng)吸附后加入維持液繼續(xù)進行培養(yǎng)，待出現(xiàn)70%-85%以上細胞病變時即可收獲。病毒培養(yǎng)液收獲時間和方法依疫苗性質(zhì)而定，可將培養(yǎng)瓶凍融數(shù)次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取；或在病毒增殖培養(yǎng)過程中可收獲5-7次毒液，細胞毒液經(jīng)無菌檢驗、毒價測定合格后供配苗用。接毒與收獲種毒與毒種繼代配苗細胞制備（五）配苗1．滅活疫苗不同滅活劑對不同病毒的作用也不同。向細胞毒液內(nèi)按規(guī)定加入滅活劑，在一定的溫度下作用一定的時間，有的滅活劑還需加入阻斷劑中止滅活。滅活疫苗配置通常都需加入佐劑，充分混合、分裝，制成滅活疫苗。2．凍干苗細胞毒液內(nèi)按比例加入保護劑或穩(wěn)定劑，充分混合、分裝，進行冷凍真空干燥制成凍于疫苗。

接毒與收獲種毒與毒種繼代配苗細胞制備流程圖3——病毒性細胞疫苗制造工藝流程動物或胚胎組織毒株種毒滅活病毒消化鑒定培育培養(yǎng)檢驗檢驗配制原料佐劑傳代細胞配苗（混勻、乳化）滅活疫苗細胞懸液生長細胞配苗活疫苗保護劑原苗分裝、凍干分裝滅活原料原料細胞培養(yǎng)液配制剪碎種子鑒定擴增收獲配制滅菌病毒性動物組織疫苗制造

病毒在易感動物體內(nèi)可大量增殖，但在各器官組織、部位中增殖病毒的量卻有很大的差異，利用病毒增殖迅速、含毒量高的組織制造的疫苗稱為組織疫苗(tissuevaccine)。動物組織疫苗包括動物組織滅活疫苗和動物組織弱毒活苗兩類，前者多數(shù)由強毒株制造，如豬瘟結(jié)晶紫疫苗、狂犬病羊腦組織疫苗；后者均以弱毒株生產(chǎn)，如豬瘟兔化弱毒乳兔組織疫苗、牛瘟兔化弱毒組織疫苗等。觀察與收獲動物選擇配苗種毒與接種（一）動物選擇動物質(zhì)量直接影響到組織疫苗的質(zhì)量，特別是對疫苗的安全性和效力有著決定性的作用，動物必須符合下列標(biāo)準(zhǔn)：

(1)應(yīng)該是清潔級(二級)以上的等級實驗動物，即無規(guī)定的人獸共患性病原體動物；

(2)應(yīng)是對所接種病毒易感性高的動物，即在品種、年齡和體重方面合乎要求的實驗動物。

種毒既可用抗原性優(yōu)良、致死力強的自然毒株臟器組織毒或強毒株增殖培養(yǎng)物，也可用弱毒株組織毒種。無論何種種毒都須經(jīng)純粹、抗原性和免疫原性檢查合