【課件】動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體課件-高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

2.2.2動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體“生物導(dǎo)彈”追蹤癌細(xì)胞抗體植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)溫故而知新：有沒(méi)有技術(shù)讓不同種動(dòng)物的體細(xì)胞雜交，培育出集不同細(xì)胞優(yōu)勢(shì)于一身的動(dòng)物細(xì)胞呢？實(shí)例1：自然條件受精作用1970年人工條件下的人-鼠細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)實(shí)例2：人工誘導(dǎo)一、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)一、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)1、概念：指兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。3、結(jié)果：形成雜交細(xì)胞。即融合后形成的原來(lái)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞。2、原理：細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性4、誘導(dǎo)方式物理法：電融合法化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒細(xì)胞融合成功的標(biāo)志：細(xì)胞核的融合仙臺(tái)病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）（1）“滅活病毒”中滅活的具體含義是什么？滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。病毒表面的糖蛋白和一些酶與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。（2）滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理是什么？正在融合的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞

正在融合的雞血細(xì)胞5.實(shí)例：6.意義：突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能

7.應(yīng)用：（1）細(xì)胞融合技術(shù)已經(jīng)成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。（2）利用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來(lái)的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。處理方法誘導(dǎo)手段結(jié)果原理請(qǐng)同學(xué)們看圖對(duì)比動(dòng)物和植物細(xì)胞融合的異同：植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞電融合法、離心法；PEG融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能動(dòng)物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交的比較抗體概念：特性：分布：漿細(xì)胞產(chǎn)生的專門應(yīng)對(duì)抗原的蛋白質(zhì)特異性即一種抗體只能與一種抗原結(jié)合主要分布于血清中，也分布于組織液及外分泌液（乳汁）中。注意:抗體的化學(xué)本質(zhì)一定是蛋白質(zhì)！二、單克隆抗體的制備1.傳統(tǒng)抗體制備方法及缺陷向動(dòng)物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原從動(dòng)物血清中分離所需抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差（2）缺點(diǎn)：（1）方法：如何解決這個(gè)問(wèn)題呢？2.單克隆抗體制備思路：每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體選

擇B淋巴細(xì)胞不可能無(wú)限增殖一個(gè)B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞群

單克隆抗體產(chǎn)生克隆化培養(yǎng)單克隆抗體癌細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合思考１：我們所學(xué)的哪種細(xì)胞是可以無(wú)限增殖的思考２：有什么方法能使B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力和無(wú)限增殖能力同時(shí)具備思考：一個(gè)極富創(chuàng)造力的方案：動(dòng)物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無(wú)限增殖一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體1975年，米爾斯坦和科勒1984年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)用特定抗原注射小鼠從患骨髓瘤的小鼠體內(nèi)取骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合多種雜交細(xì)胞3.單克隆抗體制備的過(guò)程：PEG融合法電融合法滅活病毒誘導(dǎo)法能產(chǎn)生抗體能大量增殖脾臟中獲取2雜交瘤細(xì)胞13第一次篩選多種雜交瘤細(xì)胞多種雜交細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞自身融合B細(xì)胞自身融合雜交細(xì)胞132未融合的B淋巴細(xì)胞未融合的骨髓瘤細(xì)胞B-骨、骨-骨、B-B、用特定的選擇培養(yǎng)基（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）克隆化培養(yǎng)抗體檢測(cè)第二次篩選：(抗原-抗體雜交技術(shù))多種雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)原理：抗原和抗體能夠特異性結(jié)合(分子水平的鑒定）分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性孔第二次篩選：抗體檢測(cè)的方法——抗原-抗體雜交法在單克隆抗體制備過(guò)程中，兩次篩選的目的和方法是不相同的。將雜交瘤細(xì)胞群稀釋，約每孔1個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)（克隆化培養(yǎng)）一段時(shí)間后，檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔多孔細(xì)胞培養(yǎng)板分泌抗體能跟特定抗原結(jié)合的細(xì)胞即為所需雜交瘤細(xì)胞多次篩選第一次篩選第二次篩選原因方法目的誘導(dǎo)融合后得到的細(xì)胞中，除雜交瘤細(xì)胞之外，還有未融合的親本細(xì)胞，也有融合的具有同種核的細(xì)胞由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)第一次篩選之后獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選用96孔板培養(yǎng)，在每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下，進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)（進(jìn)行多次篩選）篩選獲得雜交瘤細(xì)胞獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞兩次篩選的比較注射到小鼠體內(nèi)體外培養(yǎng)分離、提純單克隆抗體體內(nèi)或體外培養(yǎng)能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取從小鼠腹水中提取不需要配制培養(yǎng)液，不需要控制培養(yǎng)液無(wú)菌、無(wú)毒、溫度、PH、滲透壓、氣體環(huán)境等條件。雜交瘤細(xì)胞體內(nèi)培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：

補(bǔ)充資料：第一次篩選獲得雜交瘤細(xì)胞①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。②人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒(méi)有S途徑，但能不斷分裂增殖。篩選出雜交瘤細(xì)胞方法？培養(yǎng)基中加入氨基喋呤B淋巴細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能無(wú)限增殖，死亡骨髓瘤細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能無(wú)限增殖，死亡雜交瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖，生長(zhǎng)AB1、AB2、AB3……專一抗體檢驗(yàn)陽(yáng)性：有限稀釋法、抗原-抗體雜交法單克隆抗體的制備過(guò)程——第二次篩選【原理】將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋后滴入多孔板，如果稀釋度足夠高，多孔板的一個(gè)孔里就可能只有1個(gè)雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)之后(即克隆化培養(yǎng))，用標(biāo)記的抗原檢測(cè)每個(gè)小孔上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體（抗原抗體能結(jié)合即為陽(yáng)性孔）。這樣經(jīng)過(guò)多次克隆化培養(yǎng)以及有限稀釋法的篩選，就能選出需要的那種雜交瘤細(xì)胞（AB3）。多孔細(xì)胞培養(yǎng)板抗體檢測(cè)板陽(yáng)性孔單克隆抗體及其應(yīng)用二

【課堂小結(jié)】單克隆抗體篩選二雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)培養(yǎng)篩選一骨髓瘤細(xì)胞

誘導(dǎo)融合分泌特異抗體的雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞群提取已免疫的B淋巴細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體的制備既能大量繁殖又能產(chǎn)生專一抗體特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備注射抗原用特定的選擇性培養(yǎng)基克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(cè)應(yīng)用到的技術(shù)：原理：

細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、細(xì)胞增殖動(dòng)物細(xì)胞融合、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)1.(1)若A細(xì)胞是小鼠骨髓瘤細(xì)胞，則B細(xì)胞是取自小鼠體內(nèi)的

細(xì)胞，從小鼠體內(nèi)提取分離該細(xì)胞之前，應(yīng)給小鼠注射____________類物質(zhì)。（2）d過(guò)程是一個(gè)

的過(guò)程，該過(guò)程的進(jìn)行常用_____________或_____________誘導(dǎo)。(3)假設(shè)僅考慮某兩個(gè)細(xì)胞的融合，則可形成

種類型的C細(xì)胞，因此需用__________培養(yǎng)基篩選出D細(xì)胞用于培養(yǎng)，D細(xì)胞的名稱是

，其特點(diǎn)是_________________________________________。B淋巴

抗原

動(dòng)物細(xì)胞融合

聚乙二醇滅活病毒

選擇性3既能無(wú)限增殖又能產(chǎn)生特異性抗體

雜交瘤細(xì)胞(4)在培養(yǎng)時(shí)通過(guò)________分裂方式大量繁殖。D細(xì)胞體外培養(yǎng)需要注意的條件是（要求答4項(xiàng)）

（5）單克隆抗體在疾病的診斷、治療和預(yù)防方面，與常規(guī)抗體相比，其特點(diǎn)是

。特異性強(qiáng)、靈敏度高，可大量制備有絲無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境；充足的營(yíng)養(yǎng)；適宜的溫度和pH；適宜的氣體環(huán)境

小試牛刀單克隆抗體能準(zhǔn)確地識(shí)別抗原的細(xì)微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，并且可以大量制備。三、單克隆抗體的應(yīng)用1.單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：資料1用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來(lái)的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對(duì)胎兒造成不利影響。該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確率在90%以上。具有準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速特點(diǎn)。診斷優(yōu)點(diǎn)：（1）廣泛用作診斷試劑資料2使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。但細(xì)胞毒素沒(méi)有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會(huì)對(duì)健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用?？贵w-藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugates,ADC）通過(guò)將細(xì)胞毒素與能特異性識(shí)別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細(xì)胞毒素)三部分組成，它的作用機(jī)制如下圖所示。(2)用于治療疾病和運(yùn)載藥物抗體藥物接頭ADC被細(xì)胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細(xì)胞凋亡1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？討論抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過(guò)特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞；藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細(xì)胞2.除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢(shì)？①可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療；②一些作用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物（PD-1抗體或PD-L1抗體）可以通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路來(lái)抑制其生長(zhǎng)，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測(cè)的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒；②ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識(shí)別的靶向作用和細(xì)胞毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)主要用于癌癥治療，如：?jiǎn)慰寺】贵w+藥物=“生物導(dǎo)彈”優(yōu)點(diǎn)：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用小結(jié)合同位素的單抗(“生物導(dǎo)彈”—單抗導(dǎo)向，藥物為彈頭)(2)用于治療疾病和運(yùn)載藥物課堂小結(jié)兩個(gè)過(guò)程動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程單克隆抗體制備過(guò)程三個(gè)“一”一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法

－－滅活病毒一個(gè)新細(xì)胞－－雜交瘤細(xì)胞一個(gè)優(yōu)勢(shì)－－單克隆抗體特異性強(qiáng)、靈敏度高、可大量制備的優(yōu)勢(shì)

4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應(yīng)用？你可以課后搜集資料，然后以“單克隆抗體在臨床上的應(yīng)