常用特殊染色技術(shù)及其質(zhì)量控制

常用特殊染色技術(shù)及其質(zhì)量控制徐開(kāi)軍云南省第三人民醫(yī)院病理科1雖然免疫組化及分子病理學(xué)等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使得臨床病理診斷不斷提高，但作為傳統(tǒng)的染色方法——特殊染色技術(shù)，仍在病理診斷中占有舉足輕重的地位。特殊染色之所以一直未被取代：第一，取決于特殊染色本身的染色方法。操作簡(jiǎn)單、快捷、試劑價(jià)格低廉，無(wú)論是大、小醫(yī)院病理科都是不可缺少的染色方法，相對(duì)于基層醫(yī)院而言更為實(shí)用。第二，很多重要的特殊染色方法是其他染色方法都不能替代的。2

染色

規(guī)范化操作

方法的選擇

質(zhì)量控制

責(zé)任心

最基本的要素

染色的先決條件

染色結(jié)果的保證

染色方法的保證

特殊

3特殊染色的概念、意義特殊染色概念：為了顯示組織或細(xì)胞內(nèi)特殊成分，用特定的染液和方法對(duì)組織進(jìn)行的染色。特殊染色意義：對(duì)于臨床病理診斷及其鑒別診斷具有重要作用，是HE染色的補(bǔ)充，是不可缺少的染色技術(shù)。4特殊染色的特點(diǎn)特異性高（定性、定位、定量）操作方法簡(jiǎn)便染色時(shí)間較短試劑價(jià)格相對(duì)很低廉一些染色不可被替代5HE染色特染大部分特染免疫組化雖然目前免疫組化技術(shù)應(yīng)用廣泛，但是許多特殊染色是不可被免疫組化替代的。細(xì)菌、含鐵血黃素、糖原、黏液……6

特殊染色多重的選擇性1、一種染色方法染不同物質(zhì)PAS染色：糖原、真菌、黏液……GMS染色：真菌、卡氏肺囊蟲、基底膜……維多利亞藍(lán)染色法：彈性纖維、乙肝表面抗原一種相同方法染不同物質(zhì)？因含有相同物質(zhì)，染色機(jī)制一致。真菌菌壁含多糖類物質(zhì)，糖原屬于多糖，所以PAS染色均呈紅色。72、一種物質(zhì)多種染色方法真菌：PAS染色法GMS染色法AB（pH2.5）染色法……神經(jīng)髓鞘：變色酸2R染色法砂羅鉻花青R染色法固綠染色法……83、一種染色方法多種復(fù)染方法含鐵血黃素：核固紅、中性紅、伊紅抗酸染色：美籃、蘇木素膠原纖維：苯胺藍(lán)、亮綠選擇不同的背景復(fù)染方法，對(duì)于染色結(jié)果的判斷會(huì)更加突出顯示。9對(duì)于特殊染色多重的選擇性，選擇特異性的染色方法極為重要，選擇的染色方法敏感性越高，對(duì)染色物質(zhì)更加突出，而背景復(fù)染則決定了染色陽(yáng)性結(jié)果對(duì)比的清晰度。含鐵血黃素染色10雖然特殊染色有多重選擇性，但也存在一定局限性。要能夠較好的保存組織和細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，才能使得被檢測(cè)物質(zhì)定位準(zhǔn)確。酸、堿性磷酸酶應(yīng)該在4°C冰箱內(nèi)固定，時(shí)間不超過(guò)24小時(shí)，否則酶活性就會(huì)減弱或消失，包埋的溫度過(guò)高也會(huì)使得酶被破壞而消失。（冰凍切片能夠較好保存酶）。證明組織中含有脂質(zhì)的方法是冰凍切片。福爾馬林在化學(xué)上能夠改變一些脂質(zhì)，特別是卵磷脂和縮醛磷脂，而且對(duì)中性脂肪沒(méi)有作用，況且石蠟切片的脂質(zhì)已經(jīng)被溶解，不能做脂質(zhì)染色。真正能固定脂質(zhì)的溶劑只有鋨酸。鋨酸為劇毒品11對(duì)于絕大多數(shù)特殊染色的組織，選擇10%緩沖福爾馬林液固定能夠達(dá)到很好效果。對(duì)于少數(shù)特殊染色組織需選擇特定固定液：脂質(zhì)（鋨酸染色）—鋨酸固定尿酸鹽結(jié)晶—無(wú)水酒精固定肥大細(xì)胞—AF液固定特殊染色固定液的選擇要求：1、固定液不能溶解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)2、使所顯示的物質(zhì)定位準(zhǔn)確，不會(huì)出現(xiàn)移位現(xiàn)象特殊染色固定液12關(guān)于糖原的固定：以往顯示糖原的組織常強(qiáng)調(diào)用無(wú)水酒精固定，主要是避免糖原溶解于水。個(gè)人見(jiàn)解，無(wú)水酒精對(duì)組織制片影響很大，組織會(huì)嚴(yán)重收縮、變形、變脆，及時(shí)固定在10%中性緩沖福爾馬林液中糖原的損耗不會(huì)影響它的檢測(cè)。但AFA液效果更佳。AFA液配制：95%酒精85ml，甲醛10ml，冰醋酸5ml固定兼脫水作用13

物理作用化學(xué)反應(yīng)化學(xué)反應(yīng)化學(xué)反應(yīng)在染色過(guò)程中，染料與被染物之間既存在物理作用，又存在化學(xué)作用，是兩者綜合作用的結(jié)果。兩者的結(jié)合著色過(guò)程非常復(fù)雜。特殊染色機(jī)制14常用特殊染色技術(shù)一、膠原纖維染色——Masson染色法二、網(wǎng)狀纖維染色——?dú)溲趸y氨法三、抗酸染色——苯酚堿性品紅法四、真菌染色——PAS法五、淀粉樣蛋白染色——?jiǎng)偣t法六、含鐵血黃素染色——亞鐵氰化鉀法七、糖原染色——PAS法八、黏液染色——AB-PAS法九、脫黑色素法15一、膠原纖維染色——Masson染色法染液配制：1、Weigert鐵蘇木素：甲液：蘇木素1g，無(wú)水酒精100ml；乙液：30%三氯化鐵液4ml，蒸餾水95ml，鹽酸1ml；使用前將兩液等量混合。2、麗春紅酸性品紅液：麗春紅0.7g，酸性品紅0.3g，1%冰醋酸水溶液100ml。3、1%磷鉬酸水溶液：磷鉬酸1g，蒸餾水100ml。4、2%醋酸苯胺藍(lán)液：苯胺藍(lán)2g，冰醋酸2ml，蒸餾水98ml。5、亮綠液：亮綠1g，1%冰醋酸水溶液100ml。16染色步驟：1、切片常規(guī)脫蠟至水。2、Weigert鐵蘇木素染5-10min。3、流水沖洗。4、1%鹽酸酒精分化數(shù)秒。5、流水沖洗10min。6、麗春紅酸性品紅液10min。7、蒸餾水稍洗。8、1%磷鉬酸水溶液處理10min。9、直接用2%醋酸苯胺藍(lán)液或1%亮綠液復(fù)染5min。10、1%冰醋酸水溶液處理2min。11、95%酒精脫水3次。12、無(wú)水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。17染色結(jié)果：苯胺藍(lán)復(fù)染時(shí)膠原纖維、軟骨、黏液呈藍(lán)色；以亮綠復(fù)染時(shí)膠原纖維、軟骨、黏液呈綠色；肌纖維、紅細(xì)胞、胞質(zhì)、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核呈黑藍(lán)色。18注意事項(xiàng)及個(gè)人見(jiàn)解：1、Masson三色染色及VG染色用Weigert鐵蘇木素染胞核，其配制比較麻煩，且鐵蘇木素為醇溶性，在滴染時(shí)因酒精張力小，容易在玻片擴(kuò)散，不易控制，可改用天青石藍(lán)及Mayer蘇木素代替，染色效果好，染色也可以保存較長(zhǎng)時(shí)間。2、Weigert鐵蘇木素甲、乙液應(yīng)于臨用前等份混合，防止其氧化產(chǎn)生沉淀，甲液不宜配置過(guò)多，以免存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響細(xì)胞核的著色。3、1%磷鉬酸處理切片時(shí)，應(yīng)在鏡下觀察控制染色時(shí)間，肌纖維呈紅色，膠原纖維呈淡紅色或無(wú)色為宜。其對(duì)膠原纖維有媒染作用，有助于膠原纖維與亮綠或醋酸苯胺藍(lán)的結(jié)合。4、1%冰醋酸作用在于分色，目的是除去附在原漿內(nèi)的顏色，使得染色鮮艷和清晰。濃度范圍為0.2%-1%。195、如在配制麗春紅酸性品紅液過(guò)程中沒(méi)有麗春紅，可直接用酸性品紅替代，酸性品紅0.3g改為1g即可。6、麗春紅酸性品紅染液和2%醋酸苯胺藍(lán)染液性能較穩(wěn)定，室溫下一般可保存2年。7、膠原纖維染色也可選擇方法較為簡(jiǎn)單的VanGieson染色法，但是VG染色因酸性品紅易溶于水、苦味酸易溶于酒精，因此，VG染色后，經(jīng)水、酒精都要迅速。但染色偏紅時(shí)，可在水洗時(shí)延長(zhǎng)時(shí)間，如果染色偏黃，可適當(dāng)延長(zhǎng)酒精脫水時(shí)間。8、為操作更簡(jiǎn)便，組織常規(guī)脫蠟至水后可直接滴加VG染液染色5-10min，染色后水速洗，烤干，封片。染色結(jié)果為細(xì)胞核不顯色，膠原纖維呈紅色，肌纖維呈黃色。9、VG染色因酸性品紅易褪色，可改用1%麗春紅S代替。20應(yīng)用：1、顯示器官損傷、修復(fù)、纖維化程度：胃、十二指腸潰瘍愈合時(shí)，膠原纖維染色潰瘍底部可見(jiàn)纖維構(gòu)成的瘢痕。2、作為判定某些腫瘤組織來(lái)源的依據(jù)：軟組織梭形細(xì)胞腫瘤，既可以是纖維性的，也可以是肌源性的。早期肝硬化時(shí)的假小葉的形成，膠原纖維染色可見(jiàn)假小葉周圍膠原纖維包繞。3、作為其他特殊染色的復(fù)染（VG）黑色素染色法、醛品紅彈力纖維染色法VG染色21二、網(wǎng)狀纖維染色——?dú)溲趸y氨法（Gomori法）染液配制：1、Gomori銀氨液：

用小量杯加10%硝酸銀水溶液3ml，再加入10%氫氧化鉀水溶液1ml，此時(shí)出現(xiàn)棕黑色顆粒沉淀，記下此時(shí)溶液的總量，加入10倍以上的蒸餾水洗滌沉淀物，然后吸去上層清液，再加入蒸餾水，如此反復(fù)洗滌3次，最后加蒸餾水至所記下的量。然后邊滴加氫氧化銨邊不斷搖蕩，直至沉淀物完全溶解。再加入10%硝酸銀水溶液數(shù)滴至溶液稍變渾濁，再加入氫氧化銨一至數(shù)滴，使溶液再次變清。最后按原總量加蒸餾水10-15倍稀釋，棕色玻璃瓶盛裝于4°C冰箱保存。2、0.25%高錳酸鉀液：高錳酸鉀0.25g+蒸餾水100ml3、2%草酸液：草酸2g+蒸餾水100ml4、2%硫酸鐵銨液：硫酸鐵銨2g+蒸餾水100ml5、4%中性甲醛液：甲醛（40%）10ml+蒸餾水90ml22染色步驟：1、切片常規(guī)脫蠟至水。2、0.25%高錳酸鉀液氧化5min。3、自來(lái)水稍洗。4、2%草酸液漂白1-2min。5、自來(lái)水充分洗，蒸餾水洗。6、2%硫酸鐵銨液媒染5min。7、自來(lái)水稍洗，蒸餾水洗。8、滴入Gomori銀氨液作用3-5min。9、蒸餾水稍洗。10、4%中性甲醛液還原1min。11、流水沖洗5-10min。12、常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。23染色結(jié)果：網(wǎng)狀纖維—黑色膠原纖維—黃色至棕黃色細(xì)胞核—褐色24注意事項(xiàng)及個(gè)人見(jiàn)解：1、配好后的銀氨液很敏感，受光或空氣作用后均易解離析出銀鹽，故應(yīng)用棕色玻璃瓶盛裝并密封避光保存，一般置于4°C冰箱可保存4-8周。如見(jiàn)銀鹽析出，則需要重新配制。2、切片經(jīng)4%甲醛液還原，流水沖洗后，放在顯微鏡下觀察。如浸銀過(guò)度，可用高錳酸鉀液水溶液稍處理，再經(jīng)流水沖洗；如浸銀不足，可在流水沖洗后，再滴入銀氨液染色1-2min，然后蒸餾水洗，4%中性甲醛還原，可獲得滿意效果。3、使用高錳酸鉀氧化及草酸漂白處理時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)容易引起脫片。4、切片在經(jīng)2%硫酸鐵銨和銀氨液染色后，水洗時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，一般以數(shù)秒為宜，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)減弱銀的還原性，網(wǎng)狀纖維不夠黑，時(shí)間過(guò)短，又會(huì)使得銀的還原性不夠均勻。255、關(guān)于4%中性甲醛還原后采用0.2%氯化金調(diào)色和5%硫代硫酸鈉固定以除去未還原的銀鹽，實(shí)際上省去這兩個(gè)步驟對(duì)染色效果沒(méi)有影響，長(zhǎng)期保存也不會(huì)退色。6、配制銀氨溶液時(shí)，氫氧化銨必須新鮮，用后及時(shí)密封保存。所滴加的氫氧化銨量必須嚴(yán)格控制，這是染色成敗的關(guān)鍵。需精心操作，注意不能過(guò)量，應(yīng)邊加邊搖動(dòng)，加1滴后搖動(dòng)片刻，一定要加至所形成沉淀物恰好溶解為止，不可多加。7、2%硫酸鐵銨媒染時(shí)間如短于5min，核著色會(huì)偏很淡。26應(yīng)用：1、癌與肉瘤的鑒別：癌：網(wǎng)狀纖維包繞癌巢周圍肉瘤：網(wǎng)狀纖維分散包繞單個(gè)肉瘤細(xì)胞2、鑒別原位癌或早期浸潤(rùn)癌：原位癌：基底膜完整早期浸潤(rùn)癌：基底膜斷裂崩解3、區(qū)分血管內(nèi)皮瘤及血管外皮瘤：血管內(nèi)皮瘤：網(wǎng)狀纖維包繞在瘤細(xì)胞巢血管外皮瘤：網(wǎng)狀纖維穿插在瘤細(xì)胞間淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性中-低分化鱗狀細(xì)胞癌27三、抗酸染色（苯酚堿性品紅法）染液配制：1、堿性品紅酒精液堿性品紅5g+95%酒精100ml取小口砂塞瓶盛裝，混合后輕輕搖動(dòng)多次使其徹底溶解2、5%苯酚水溶液取苯酚置入約50°C的溫箱使其溶解，量取5ml與蒸餾水95ml充分混溶。3、苯酚堿性品紅液堿性品紅酒精液10ml+5%苯酚水溶液90ml4、20%硫酸蒸餾水80ml+硫酸20ml5、汽油松節(jié)油混合液汽油+松節(jié)油=1:128染色步驟：1、切片在汽油松節(jié)油混合液中脫蠟2次，每次約5-10min。2、用吸水紙將切片周圍脫蠟液擦干，但切片應(yīng)保持濕潤(rùn)。3、溫水、自來(lái)水洗3min。4、將切片置于盛有苯酚堿性品紅液的立染缸內(nèi)，置60°C恒溫箱浸染30min。5、流水充分洗去多余染液。6、20%硫酸分化。7、流水沖洗5min。8、蘇木素淺染胞核，1%鹽酸分化。9、流水沖洗10min。10、50-60°C恒溫箱中烤干，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。29染色結(jié)果：抗酸桿菌（包括結(jié)核桿菌和麻風(fēng)桿菌）—紅色細(xì)胞核—淡藍(lán)色30注意事項(xiàng)及個(gè)人見(jiàn)解：1、染色時(shí)，應(yīng)選用陽(yáng)性切片作對(duì)照。2、分化可選擇鹽酸酒精，分化后切片經(jīng)水洗應(yīng)為淡粉色。3、復(fù)染可選擇美籃，復(fù)染數(shù)秒后，在95%酒精內(nèi)稍作脫色，否則會(huì)遮蓋抗酸桿菌，造成對(duì)比不清晰。4、苯酚俗稱石炭酸，為無(wú)色結(jié)晶。如呈紅色，則是受到氧化，不應(yīng)使用，配制5%苯酚水溶液時(shí)，先將整瓶苯酚置于60°C恒溫箱中加熱溶解，然后速取5ml加入95ml蒸餾水充分混合。5、染色后切片如果經(jīng)苯酚二甲苯，則抗酸菌易脫色。6、以往苯酚堿性品紅染色時(shí)都是用酒精燈直接加熱染色，加熱溫度不易控制，染色結(jié)果也相對(duì)不穩(wěn)定，切片上染液沉渣較多，易與抗酸桿菌混淆，加熱不當(dāng)切片易炸裂?？刹捎檬⒂腥疽旱牧⑹饺靖兹旧?，切片無(wú)污染，加熱

溫度均勻，染色結(jié)果清晰，也可在切片上滴加染液，放31入濕盒內(nèi)，置于恒溫箱中。染色時(shí)不能使切片干燥。7、采用汽油松節(jié)油混合液代替二甲苯和酒精，是為了保存菌體內(nèi)的類脂質(zhì)不受到高濃度酒精的破壞，使染色后出現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量多及染色深，這對(duì)細(xì)菌少的標(biāo)本更加有利。汽油松節(jié)油混合液要經(jīng)常更換，確保脫蠟干凈。8、因抗酸桿菌菌體內(nèi)含有蠟質(zhì)并形成完整的蠟樣包膜，蠟質(zhì)具有抗酸性，對(duì)酸、堿都有較強(qiáng)的抵抗力，一般染料難以滲入菌體內(nèi)，可在苯酚堿性品紅液內(nèi)加入適當(dāng)?shù)?%-10%的TritonX-100或5%-10%的Tween-20表面活性劑，來(lái)增加一定的滲透力。9、表面活性劑的量為：堿性品紅酒精液10ml+5%苯酚水溶液85ml+活性劑5ml，用前過(guò)濾，其染色切片置于盛有染液的立式染色缸內(nèi)，60°C恒溫箱中30min。10、用強(qiáng)酸進(jìn)行脫鈣可能會(huì)破壞抗酸性，最好使用甲酸脫鈣。32應(yīng)用：結(jié)核病與類結(jié)核病及麻風(fēng)病的診斷與鑒別診斷：結(jié)核病：抗酸染色（+）麻風(fēng)?。嚎顾崛旧?）瘤型麻風(fēng)：找到大量麻風(fēng)桿菌類結(jié)核型麻風(fēng)：找不到麻風(fēng)桿菌結(jié)核桿菌：細(xì)長(zhǎng)、稍彎曲，長(zhǎng)短不一，常單條散在分布麻風(fēng)桿菌：較粗短、筆直，常呈束狀排列或聚集成堆肺結(jié)核33四、真菌染色（PAS法）染液配制：1、0.5%高碘酸水溶液：高碘酸0.5g+蒸餾水100ml2、無(wú)色品紅（Shiff試劑）：先將1g堿性品紅溶于80°C的200ml蒸餾水，再加熱沸騰片刻，并充分?jǐn)嚢?min，冷卻至50°C時(shí)過(guò)濾，將20ml1mol/L鹽酸加入濾液內(nèi)。冷卻至25°C時(shí)加入偏重亞硫酸鈉1-1.5g，立即用塞緊瓶口。將溶液存放在暗處或冰箱內(nèi)12-24小時(shí)后，此時(shí)溶液呈淡土黃色，再加入2g活性炭，震蕩溶液1min后過(guò)濾。溶液呈無(wú)色、清澈、透明狀態(tài)。用棕色瓶盛裝于4°C冰箱保存。3、0.5%偏重亞硫酸鈉液：偏重亞硫酸鈉0.5g+蒸餾水100ml4、亮綠水溶液：亮綠0.2g+蒸餾水99.8ml+冰醋酸0.2ml34染色步驟：1、切片常規(guī)脫蠟至水。2、0.5%高碘酸氧化5-8min。3、流水沖洗2min，再用蒸餾水洗。4、入無(wú)色品紅液于暗處并加蓋作用10-20min。5、0.5%偏重亞硫酸鈉滴洗3次，每次2min。6、再流水沖洗5min。7、亮綠水溶液復(fù)染數(shù)秒。8、流水稍洗。9、常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。35染色結(jié)果：真菌—紅色組織—綠色36注意事項(xiàng)及個(gè)人見(jiàn)解：1、在配制過(guò)程中所用的玻璃器皿要求十分干凈，一般要用硫酸洗液浸泡過(guò)。2、不能在蒸餾水沸騰的時(shí)候加入堿性品紅，防止沸騰的水蒸氣把堿性品紅液噴濺出來(lái)3、無(wú)色品紅液要放在4°C冰箱保存，臨用前半小時(shí)取出恢復(fù)到室溫，用后可倒回原瓶?jī)?nèi)放回放冰箱內(nèi)保存，可如此反復(fù)使用多次，至溶液出現(xiàn)淡紅色時(shí)才倒棄。4、無(wú)色品紅染色時(shí)需加蓋暗處染色，染色時(shí)間隨室溫而定。室溫高一般作用10min已足夠；室溫低，可延長(zhǎng)作用時(shí)間至20min左右或者在25°C左右水浴箱中染色，但不可超過(guò)30°C。5、高碘酸水溶液和偏重亞硫酸鈉于4°C冰箱保存，可使用數(shù)月，臨用前取出恢復(fù)至室溫，高碘酸的氧化力度比其他氧化劑優(yōu)越，它不把所形成的醛基進(jìn)一步氧化。376、無(wú)色品紅染色后用偏重亞硫酸鈉漂洗以減少背景的著色，實(shí)際上用流水充分洗滌也能得到很好的效果，可以省略偏重亞硫酸鈉漂洗的步驟。7、高碘酸的濃度一般在0.5%-1%之間，pH多在3-5之間。另外其作用的溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，溫度以不高于20°C為宜，時(shí)間以5-10min為妥。8、無(wú)色品紅液染色過(guò)程中，加入5%的次氯酸鈉溶液可以減少污染。9、無(wú)色品紅在使用一段時(shí)間后，顏色漸漸變成淡紅色，染色力度下降，一般應(yīng)該倒棄重新配制新液，不過(guò)，在每100ml變?yōu)榈t色的液體中加入0.7-0.9g偏重亞硫酸鈉，染色力度即可增加，效果很好。10、0.5%偏重亞硫酸鈉漂洗后可用蘇木素或者亮綠復(fù)染，實(shí)際上不行復(fù)染也可以。38應(yīng)用：致病性真菌常見(jiàn)有毛霉菌、曲霉菌、新型隱球菌、白色念珠菌、馬爾尼菲青霉菌等，特殊染色對(duì)其病理診斷有非常重要的作用。鼻竇真菌病39五、淀粉樣蛋白染色（剛果紅法）染液配制：1、剛果紅染液：剛果紅0.2g+50%酒精100ml2、堿性酒精分化液：氫氧化鉀0.2g+80%酒精100ml40染色步驟：1、切片常規(guī)脫蠟至水。2、剛果紅染液染10min。3、自來(lái)水稍洗。4、用堿性酒精分化1-2min；5、蘇木素淺染胞核。6、鹽酸酒精稍分化。7、流水沖洗10min。8、常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。41染色結(jié)果：淀粉樣蛋白—橘紅色細(xì)胞核—藍(lán)色42注意事項(xiàng)及個(gè)人見(jiàn)解：1、堿性酒精分化是染色的關(guān)鍵，若分化不足，膠原纖維也被著染，分化過(guò)度，淀粉樣蛋白也被脫色。如果分化過(guò)度，可將切片水洗后再加剛果紅染液重新染色。最好在顯微鏡下觀察分化。2、凡是用剛果紅染淀粉樣蛋白，不管用哪個(gè)方法，都能把甲狀腺膠質(zhì)、彈力纖維染成紅色，根據(jù)形態(tài)上的不同，應(yīng)該注意區(qū)別。3、最好用浸染法，因在滴染時(shí)溶液容易擴(kuò)散，若滴染放入濕盒內(nèi)為佳，避免溶液揮發(fā)、擴(kuò)散引起切片干燥。4、也可使用甲醇剛果紅法染色，因?yàn)榧状寄芨玫娜芙鈩偣t，甘油則可防止甲醇的揮發(fā)，同時(shí)使剛果紅染液穩(wěn)定，能保存使用較長(zhǎng)時(shí)間。43應(yīng)用：1、區(qū)分淀粉樣變性與其他變性：膠原纖維和網(wǎng)狀纖維周圍、小動(dòng)脈、血管外膜等出現(xiàn)病變時(shí)，淀粉樣物質(zhì)染色可顯示和區(qū)分其病變的性質(zhì)。2、為某些疾病的診斷與鑒別診斷提供依據(jù)：鈣化上皮瘤、聲帶息肉、前列腺常出現(xiàn)淀粉樣變性，可為診斷提供依據(jù)。3、用于腫瘤的診斷和鑒別：特別是內(nèi)分泌性腫瘤，間質(zhì)內(nèi)常出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì)沉著，如甲狀腺髓樣癌、胰島細(xì)胞瘤、肺小細(xì)胞癌等，淀粉樣物質(zhì)染色陽(yáng)性可作為診斷的依據(jù)。聲帶息肉44六、含鐵血黃素染色（亞鐵氰化鉀法）染液配制：1、2%亞鐵氰化鉀水溶液：亞鐵氰化鉀2g+蒸餾水100ml2、2%鹽酸水溶液：純鹽酸2ml+蒸餾水98ml臨用前將2%亞鐵氰化鉀與2%鹽酸等量混合即為工作液，即配即用。3、核固紅染液：核固紅0.1g+硫酸鋁5g+蒸餾水100ml+麝香草酚50mg。45染色步驟：1、切片常規(guī)脫蠟至水。2、蒸餾水充分洗。3、亞鐵氰化鉀工作液滴染15-20min。4、蒸餾水洗。5、核固紅復(fù)染細(xì)胞核5-10min。6、稍水洗。7、常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。46染色結(jié)果：含鐵血黃素—藍(lán)色細(xì)胞核—紅色47注意事項(xiàng)及個(gè)人見(jiàn)解：1、鹽酸以分析純較好，因?yàn)榇种汽}酸含鐵較多，可導(dǎo)致染色出現(xiàn)假陽(yáng)性。2、鐵反應(yīng)前各步驟均用蒸餾水洗，防止自來(lái)水中的鐵離子與組織中的鈣鹽結(jié)合產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。3、2%亞鐵氰化鉀水溶液和2%鹽酸水溶液用前混合，只能使用一次。4、含鐵血黃素不溶于堿和有機(jī)溶劑，而可溶于酸。在5%的草酸中2-6小時(shí)可將含鐵血黃素溶解。5、應(yīng)避免使用酸性固定劑及鉻酸鹽固定液，選用中性緩沖福爾馬林固定為佳。6、每次配制染液時(shí)盡可能少配制，新配制的染液呈無(wú)色清液，當(dāng)變?yōu)榈{(lán)色時(shí)重新配制為佳。48應(yīng)用：1、證明和鑒別含鐵血黃素與其他色素：與黑色素、脂褐素等鑒別。2、顯示組織內(nèi)各種出血性病變：長(zhǎng)期的肺淤血和出血（在肺泡內(nèi)可見(jiàn)到含有大量含鐵血黃素的所謂心衰細(xì)胞）、出血性病灶等。肩部真皮纖維瘤49七、糖原染色（PAS法）染液配制：1、0.5%高碘酸水溶液：2、0.5%偏重亞硫酸鈉水溶液：3、無(wú)色品紅液（Schiff試劑）：均同“真菌染色”4、1%淀粉酶（或唾液）：淀粉酶1g+蒸餾水100ml50染色步驟：1、取兩張連續(xù)切片，分別標(biāo)記待測(cè)及消化對(duì)照。2、將消化對(duì)照切片脫蠟至水。3、把消化對(duì)照切片放入預(yù)熱至37°C的1%淀粉酶液，于37°C溫箱內(nèi)消化1小時(shí)，或用預(yù)熱至37°C的唾液在37°C溫箱消化30min，取出切片稍水洗。4、在消化對(duì)照切片處理過(guò)程中，將待測(cè)切片脫蠟至水，將兩張切片同時(shí)滴入0.5%高碘酸水溶液氧化10min，蒸餾水充分洗。5、入無(wú)色品紅液于暗處并加蓋作用10-30min。6、用0.5%偏重亞硫酸鈉液滴洗3次，每次約2min，流水沖洗5-10min。7、蘇木素復(fù)染胞核，鹽酸酒精稍分化，自來(lái)水洗。8、常規(guī)脫水、透明，中性樹(shù)膠封固。51染色結(jié)果：糖原—紅色-紫紅色細(xì)胞核—淺藍(lán)色經(jīng)過(guò)消化糖原—無(wú)色52注意事項(xiàng)及個(gè)人見(jiàn)解：1、糖原染色必須做消化對(duì)照，這是關(guān)鍵的前提條件。2、PAS陽(yáng)性物質(zhì)主要有糖原、甲狀腺濾泡膠質(zhì)、消化道、呼吸道和唾液腺的上皮分泌的黏液、真菌、纖維蛋白等，均呈紫紅色。3、糖原消化物質(zhì)為：淀粉酶與唾液，淀粉酶存放過(guò)久，容易失效，唾液的消化作用效果較好。4、唾液的制備：收集自己的唾液約1ml，加蒸餾水稀釋，混勻。也可直接用不稀釋的唾液。5、著色深淺在一定程度上依賴于高碘酸及無(wú)色品紅試劑作用時(shí)間的長(zhǎng)短。對(duì)于基底膜，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，高碘酸

10min，無(wú)色品紅作用20min結(jié)果會(huì)更好。6、偏重亞硫酸鈉或鉀鹽均可使用，但質(zhì)量要純。537、用高碘酸氧化，無(wú)色品紅反應(yīng)，天青石藍(lán)和Mayer蘇木素染胞核，再用橙黃G復(fù)染，稱為PAS三色法，也特別適用于鑒別腦垂體的三種細(xì)胞（嗜堿細(xì)胞顆粒呈紫紅色，嗜酸細(xì)胞顆粒呈橙黃色，嫌色細(xì)胞淺灰藍(lán)色或無(wú)色）。關(guān)于PAS染色：PAS染色是一種常用而很有價(jià)值的特殊染色方法。通過(guò)檢測(cè)黏蛋白或糖原對(duì)腫瘤的鑒別診斷有很大幫助。無(wú)色品紅染液對(duì)基底膜內(nèi)糖蛋白的反應(yīng)使PAS染色成為評(píng)估基底膜厚度的重要方法?；啄ず穸龋ㄓ绕涫悄I小球毛細(xì)血管內(nèi)）增加表明存在病變。PAS染色也是顯示組織中真菌的一種敏感而相對(duì)快速的方法，因?yàn)樵S多真菌的莢膜或細(xì)胞壁上存在高碘酸反應(yīng)性多糖。常見(jiàn)的PAS反應(yīng)性真菌包括：白色念珠菌、組織胞漿菌、隱球菌等。54應(yīng)用：1、證明空亮的胞漿為糖原還是脂質(zhì)。2、糖原貯積病和糖尿病的診斷：糖尿病時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量糖原（也可見(jiàn)于核內(nèi)，稱為核糖原）。3、某些腫瘤的診斷與鑒別診斷：骨尤文氏肉瘤（+）骨惡性淋巴瘤（-）……肝臟低分化腺癌55八、黏液染色（AB-PAS法）染液配制：1、愛(ài)爾新藍(lán)染液：愛(ài)爾新藍(lán)8GX1g+蒸餾水97ml+冰醋酸3ml2、0.5%高碘酸水溶液：3、0.5%偏重亞硫酸鈉水溶液：4、無(wú)色品紅液（Schiff試劑）：均同“真菌染色”56染色步驟：1、切片常規(guī)脫蠟至水。2、3%醋酸液3min。3、愛(ài)爾新藍(lán)液染10-30min，蒸餾水充分洗。4、0.5%高碘酸液氧化5-10min。5、蒸餾水充分洗滌。6、入無(wú)色品紅液于暗處并加蓋作用15-20min。7、0.5%偏重亞硫酸鈉滴洗3次，每次2min。8、流水洗5-10min。9、蘇木精染核，鹽酸酒精稍分化，自來(lái)水洗。10、酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。57染色結(jié)果：酸性黏液物質(zhì)—藍(lán)色中性粘液物質(zhì)—紅色中性和酸性粘液混合物—紫色細(xì)胞核—淺藍(lán)色58注意事項(xiàng)及個(gè)人見(jiàn)解：1、在愛(ài)爾新藍(lán)染液前用3%冰醋酸水溶液浸泡切片是為了保證愛(ài)爾新藍(lán)染液pH的穩(wěn)定性。此步驟可以省略。2、愛(ài)爾新藍(lán)染色含有3%冰醋酸，以使其pH為2.5?？杉尤?0mg麝香草酚防止真菌的生長(zhǎng)，配制后放入冰箱可保存使用約1年。3、蘇木素淡染非常重要，目的是防止胞漿或黏蛋白著色而掩蓋愛(ài)爾新藍(lán)的顏色，或者可省去不染核。59應(yīng)用：1、胃黏膜腸上皮化生：AB-PAS染色胃黏膜表面上皮（分泌中性黏液）呈紅色，而腸杯狀細(xì)胞和腸腺（分泌酸性黏液）呈藍(lán)色。2、腸癌肝轉(zhuǎn)移與原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌鑒別診斷：腸癌肝轉(zhuǎn)移AB-PAS染色呈陽(yáng)性（PAS染色時(shí)須對(duì)照鑒別），原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌PAS陽(yáng)性、AB染色陰性。肝臟轉(zhuǎn)移性低分化腺癌603、Barrett食管胃黏膜異位，AB-PAS染色呈紅色4、胃黏膜癌變時(shí)，細(xì)胞黏液變?yōu)樗嵝缘头只侔⒂〗浼?xì)胞癌胃印戒細(xì)胞癌61九、脫黑色素法1、酒精氨水法：70%酒精50ml，濃氨水1ml將石蠟切片脫蠟至水，放入此液中5min，再用自來(lái)水沖洗10min即可。2、酒精氫氧化鉀法：70%酒精50ml，1%氫氧化鉀2ml將石蠟切片脫蠟至水，放入此液中5min，再用自來(lái)水沖洗10min即可。3、高錳酸鉀草酸法：0.5%高錳酸鉀水溶液，2%草酸水溶液將石蠟切片片脫蠟至水，0.5%高錳酸鉀水溶液浸泡10-20min，水洗后用1%草酸水溶液漂白。62染色結(jié)果：黑色素被脫色63注意事項(xiàng)及個(gè)人見(jiàn)解：1、高錳酸鉀水溶液以新配為佳，太陳舊的氧化力弱，脫色效果也隨之欠佳。2、酸化高錳酸鉀水溶液脫色效果較好，但是高錳酸鉀氧化及草酸漂白處理時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)可使切片脫落。切片在4-5um為佳，過(guò)厚也容易脫片。64關(guān)于免疫組化染色之前脫黑色素的方法：可按照處理常規(guī)染色方法進(jìn)行處理，時(shí)間應(yīng)該調(diào)節(jié)好，須細(xì)心操作，防止切片在免疫組化染色抗原修復(fù)過(guò)程中脫片。千萬(wàn)不可在DAB顯色復(fù)染之后進(jìn)行高錳酸鉀脫黑色素及草酸漂白關(guān)于免疫組化染色后區(qū)別黑色素的復(fù)染方法：1、按照免疫組化染色步驟操作，至DAB顯色后，水洗。2、滴加Giemsa工作液，20-30min，自來(lái)水洗。3、1:500（1ml冰醋酸+500ml蒸餾水）冰醋酸分化，至黑色素呈綠色為止，顯微鏡觀察4、水洗后常規(guī)脫水、透明及封固。65特殊染色結(jié)果判讀所選擇染色方法表達(dá)結(jié)果、對(duì)照染色的結(jié)果、生物學(xué)形態(tài)。結(jié)合三者判斷，才是可靠的結(jié)果。1、特殊染色方法多重選擇性，所選擇染色方法結(jié)果陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果，定位清晰準(zhǔn)確。2、染色結(jié)果必須建立在組織陽(yáng)性對(duì)照或內(nèi)對(duì)照有效的基礎(chǔ)上。3、判斷染色結(jié)果時(shí)，應(yīng)準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)生物學(xué)形態(tài)。66肝糖原染色：所選擇方法：PAS法對(duì)照：糖原陰性生物學(xué)形態(tài)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，顆粒狀內(nèi)對(duì)照67真皮纖維瘤含鐵血黃素染色：所選擇方法：亞鐵氰化鉀法對(duì)照：陽(yáng)性生物學(xué)形態(tài)：金黃色或黃棕色大小不等顆粒陽(yáng)性對(duì)照68特殊染色質(zhì)量控制1、陽(yáng)性對(duì)照2、陰性對(duì)照3、內(nèi)對(duì)照1、方法的選擇2、染液配制后的驗(yàn)證3、染液的保存1、染色掌握2、染色性質(zhì)了解染色控制染色液配制、保存對(duì)照的設(shè)立結(jié)果質(zhì)量控制69一、對(duì)照的設(shè)立對(duì)照是首要條件可確保染色試劑的有效、染色方法的可靠、操作的規(guī)范最終證實(shí)染色結(jié)果的可靠701、陽(yáng)性對(duì)照已知含有所染色物質(zhì)的標(biāo)本病原微生物的染色中，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照是非常有必要的，原則上缺陽(yáng)性對(duì)照的染色結(jié)果不能作為診斷結(jié)果。712、陰性對(duì)照已知不含有所染色物質(zhì)的標(biāo)本一般來(lái)講，特殊染色陽(yáng)性結(jié)果比陰性結(jié)果更有意義。陰性結(jié)果可能緣于許多因素，可能源于固定液對(duì)組織的影響、物質(zhì)含量低、組織處理時(shí)的影響、染色方法不敏感或操作有誤等引起的。723、內(nèi)對(duì)照阻斷或消化的方法組織自身物質(zhì)消化對(duì)照糖原：?jiǎn)渭兌嗵?，功能結(jié)構(gòu)與植物淀粉相似，故又稱動(dòng)物淀粉。PAS染色，淀粉酶或唾液消化處理。對(duì)照片經(jīng)消化后PAS染色陰性是糖原。73自身對(duì)照真菌鼻竇真菌病PAS染色，組織腺體分泌黏液物質(zhì)呈紅色作為最佳對(duì)照。74二、染色液配制、保存染色液的配制對(duì)于染色至關(guān)重要網(wǎng)狀纖維染色銀