焦磷酸光化測序技術(shù)的基本原理及運(yùn)用,人類學(xué)論文

焦磷酸光化測序技術(shù)的基本原理及運(yùn)用,人類學(xué)論文摘要：人類基因組計(jì)劃〔HumanGenomeProject,HGP〕不僅極大地提高了人類對基因組和相關(guān)遺傳信息的認(rèn)識水平，而且促進(jìn)了生命科學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。正是在這樣的歷史背景下，焦磷酸光化測序技術(shù)〔pyrosequencing〕由瑞典研究人員發(fā)明。焦磷酸光化測序技術(shù)的基礎(chǔ)原理是基于通過合成測序原理進(jìn)行酶促反響的DNA測序方式方法，通過基于釋放焦磷酸鹽時(shí)的鏈?zhǔn)椒错懙目梢姽鈾z測，即可獲得一個(gè)特異的檢測峰，峰值的高低和相匹配的堿基數(shù)成正比。該技術(shù)可應(yīng)用于DNA核苷酸序列和突變的檢測、單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定，以及DNA甲基化水平變化的分析等。近年來，隨著攝影器材和成像技術(shù)的快速發(fā)展，這項(xiàng)技術(shù)的原理是基于通過酶促反響而實(shí)時(shí)檢測可見光，因而，有望在檢測的敏感性方面得到更進(jìn)一步的發(fā)展。該文根據(jù)筆者在瑞典近三十年的工作經(jīng)歷體驗(yàn)和積累的文獻(xiàn)，首先說明焦磷酸光化測序的基本原理，然后介紹該技術(shù)的應(yīng)用，最后討論其發(fā)展前景。本文關(guān)鍵詞語：人類基因組計(jì)劃;焦磷酸光化測序;基因變異;基因型;DNA甲基化;Abstract：TheHumanGenomeProject〔HGP〕notonlygreatlyimprovedtheunderstandingofhumangenomeandrelatedgeneticinformation,butalsopromotedthedevelopmentoftechnologiesinlifescienceresearch.ItwasunderthishistoricalcontextthatpyrosequencingwasinventedbySwedishresearchers.PyrosequencingisamethodofDNAsequencingbasedonthesequencingbysynthesisprinciplewithenzymaticreactions,andreliesonlightdetectionbaseduponachainreactionwhenpyrophosphateisreleased.TheapplicationofthistechnologyinvolvedthedetectionofDNAnucleotidesequencesandmutations,theidentificationofgenotypesofsinglenucleotidepolymorphisms,theanalysisofchangesinDNAmethylationlevelsetc.Withtherecentrapiddevelopmentofphotographicequipmentandimagingtechnology,thistechnologyisexpectedtohaveanincreasingsensitivityinsignaldetection.BasedupontheworkingexperiencesinSwedenfornearly30yearsandaccumulatedliterature,thisreviewfirstclarifiedthebasicprinciplesofpyrosequencing,thenintroducedtheapplicationsofthistechnology,andfinallydiscusseditsdevelopmentprospectsinthenearfuture.Keyword：HumanGenomeProject;pyrosequencing;geneticvariation;genotype;DNAmethylation;1、引言本世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)。生命科學(xué)是研究生命現(xiàn)象，揭示生命活動(dòng)規(guī)律和本質(zhì)的一門學(xué)科。在本世紀(jì)所有的生命科學(xué)研究活動(dòng)中，規(guī)模最大、發(fā)展最快和影響最廣的科研項(xiàng)目是人類基因組計(jì)劃(HumanGenomeProject,HGP)。HGP旨在測定人類染色體(指單倍體)中所包含的60億(3000厘摩根，cM,centi-Morgen，參見講明)對核苷酸序列，繪制出載有完好基因及其序列生物學(xué)信息的人類基因組圖譜，為破譯人類遺傳信息，深切進(jìn)入開展疾病分子病理學(xué)研究和提高人類健康水平服務(wù)[1]。人類基因圖譜早期包括物理圖譜和遺傳圖譜，前者主要將序列標(biāo)簽位點(diǎn)在染色體的絕對位置上進(jìn)行線性排列，而后者主要根據(jù)遺傳學(xué)連鎖和重組的關(guān)系確定序列標(biāo)簽位點(diǎn)在染色體的相對位置。HGP于1990年正式啟動(dòng)，作為人類基因組組織(HumanGenomeOrganisation,HUGO)成員之一，作者有幸參加了早期基因圖譜制備的科研工作。至1994年9月，物理圖譜和遺傳圖譜已經(jīng)完成，基因組標(biāo)簽分辨率為1cM(即1%重組率)，為全基因組測序奠定了基礎(chǔ)，從此HGP進(jìn)入了大規(guī)模測序階段。1953年，英國劍橋大學(xué)科研技術(shù)工程師FrancisCrick和來自美國的JamesWaston博士共同發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋構(gòu)造以及相關(guān)基本特性[2]，鑒于他們在生命科學(xué)研究中的重大奉獻(xiàn)，這兩位科學(xué)家共享了1962年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。DNA堿基排列順序中存在生物的遺傳信息，測定其序列尤為重要。1977年，英國的生化學(xué)家FrederickSanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法測定DNA核苷酸序列，這項(xiàng)技術(shù)的原理是通過使用類似于正常dNTP的2,3-雙脫氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP，將延伸的DNA鏈特異性地終止。整個(gè)反響體系包括單鏈模板、引物、DNA聚合酶和4種dNTP。待測定樣本共分四組，每組按一定比例參加一種ddNTP，在引物與模板互補(bǔ)和延伸的經(jīng)過中，它能隨機(jī)摻入合成的DNA鏈，一旦摻入合成即終止，于是構(gòu)成各種不同大小的片段，其末端核苷酸必定為該種核苷酸，再通過電泳分離能夠讀取DNA的核苷酸序列。這項(xiàng)技術(shù)以其姓氏Sanger命名而沿用至今，盡管DNA片段的分離方式方法已改良為毛細(xì)管電泳法，標(biāo)記系統(tǒng)也從放射自顯影轉(zhuǎn)化為熒光素標(biāo)記，人工讀序的實(shí)驗(yàn)程序已成為全自動(dòng)測序技術(shù)，但基本原理沒有改變[3]。Sanger博士在1958年因發(fā)現(xiàn)胰島素的氨基酸序列而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，而于1980年因發(fā)明雙脫氧鏈終止法測定DNA核苷酸序列的技術(shù)而再次獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。因而，他像居里夫人那樣，成為兩次獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家。1994年，HGP進(jìn)入了大規(guī)模測序階段的關(guān)鍵時(shí)刻，迫切需要速度更快、原理更先進(jìn)的測定DNA核苷酸序列的技術(shù)。正是在這樣的歷史背景下，瑞典烏普薩拉大學(xué)和斯德哥爾摩皇家理工學(xué)院兩個(gè)科研小組分別開場研發(fā)DNA核苷酸序列測定自動(dòng)化和新型DNA焦磷酸光化測序法，其目的是為人類基因組DNA大規(guī)模序列檢測服務(wù)。然而，科學(xué)研究有時(shí)會出現(xiàn)正打歪著的現(xiàn)象，這兩個(gè)科研小組最終都沒有到達(dá)預(yù)期的目的。但是，前者相繼開發(fā)出墊鎖式探針(padlockprobe)[4]、滾環(huán)DNA擴(kuò)增技術(shù)(rollingcircleamplification)[5]、鄰位接合技術(shù)(proximityligationassay,PLA)[6]和鄰位接合延伸(proximityextensionassay,PEA)[7]等一系列先進(jìn)的核苷酸和蛋白質(zhì)檢測技術(shù),而后者發(fā)明了焦磷酸光化測序技術(shù)(pyrosequencing)。本文首先介紹焦磷酸光化測序技術(shù)的基本原理，然后說明這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范疇，最后討論其發(fā)展前景。2、焦磷酸光化測序技術(shù)的基本原理1993年，瑞典科研人員BertilPettersson、MathiasUhle和P?lNyren根據(jù)固相測序的基本方式方法，使用鏈霉抗生物素蛋白(strepavidin)包被的磁珠黏附待測序的生物素(biontin)標(biāo)記的單鏈DNA，然后添加三種酶(DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和熒光素酶)和核苷酸(dNTP)的混合物，通過摻入核苷酸產(chǎn)生的焦磷酸來測量發(fā)射的光。光的強(qiáng)度決定能否已摻入一個(gè)或更多個(gè)核苷酸，因而，能夠檢測模板鏈上存在多少個(gè)互補(bǔ)核苷酸以及哪一種核苷酸。把四種核苷酸逐一參加重復(fù)該經(jīng)過，就能夠確定單鏈模板的DNA序列，這是焦磷酸光化測序法發(fā)展的初級階段[8]。1998年，MostafaRonaghi、MathiasUhle和P?lNyren通過參加腺苷三磷酸雙磷酸酶(Apyrase)去除未被DNA聚合酶摻入的核苷酸和殘留的少量ATP，使得整個(gè)技術(shù)程序愈加完善，四種酶即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和腺苷三磷酸雙磷酸酶的混合物在整個(gè)經(jīng)過中保持化學(xué)反響，進(jìn)而合適于儀器自動(dòng)化檢測。他們的科研論文在Science上發(fā)表，標(biāo)志著pyrosequencing正式進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段[9]。次年，德國凱基(Qiagen)公司基于這項(xiàng)技術(shù)的原理將焦磷酸光化測序儀推向市場。當(dāng)前，在中國無論是在百度等網(wǎng)絡(luò)上，還是科研論文中，關(guān)于pyrose-quencing的中文翻譯主要是焦磷酸測序，這個(gè)專有名詞的中文翻譯既不全面也不準(zhǔn)確，不符合信達(dá)雅的要求。因而，根據(jù)這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本原理，作者建議pyrosequencing正確的中文譯名應(yīng)當(dāng)為焦磷酸光化測序法，由于焦磷酸發(fā)出的可見光才是這項(xiàng)技術(shù)的本質(zhì)和亮點(diǎn)。焦磷酸光化測序法主要基于四種酶的酶促反響。根據(jù)圖1所示，pyrosequencing的基本原理是以單鏈DNA(ssDNA)為模板，首先與以待測DNA核苷酸序列而設(shè)計(jì)的特異性引物雜交，并與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和腺苷三磷酸雙磷酸酶以及底物腺苷5-磷酰硫酸鹽(adenosine-5-phosphosulfat,APS)一起孵育。分別添加四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTPs)(注意不是雙脫氧的ddNTPs，與FrederickSanger博士發(fā)明了雙脫氧鏈終止法有根本的區(qū)別)。DNA聚合酶每將正確互補(bǔ)的一個(gè)dNTP整合到模板上，摻入互補(bǔ)的新鏈就釋放一個(gè)焦磷酸鹽(PPi)。未摻入的核苷酸和ATP被腺苷三磷酸雙磷酸酶降解，并且反響能夠用另一種核苷酸重新開場。ATP硫酸化酶在腺苷5磷酸硫酸鹽存在下將PPi轉(zhuǎn)化為ATP。該ATP充當(dāng)熒光素酶介導(dǎo)熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素的底物，進(jìn)而產(chǎn)生可見光。這個(gè)光的強(qiáng)度與ATP的量成比例，通過照相機(jī)檢測熒光素酶催化的反響中產(chǎn)生的光測定在程序中分析相對應(yīng)的DNA核苷酸序列。該技術(shù)不需要凝膠電泳，也不需要對DNA樣品進(jìn)行標(biāo)記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點(diǎn)。與Sanger測序法相比，焦磷酸光化測序技術(shù)有其特定的優(yōu)勢，已經(jīng)成為DNA分析研究的重要手段。圖1焦磷酸光化測序法的基本原理焦磷酸光化測序公司(PyrosequencingAB)位于瑞典烏普薩拉市，由HealthCap風(fēng)險(xiǎn)投資公司支持而成立，目的是使焦磷酸光化測序技術(shù)的儀器和實(shí)驗(yàn)試劑盒商業(yè)化。1999年，該公司在斯德哥爾摩證券交易所上市，2003年更名為Biotage公司。焦磷酸光化測序業(yè)務(wù)線于2008年被德國凱基(Qiagen)收購。該公司先后推出PyroQ96、Pyro24h和Pyro48儀器，當(dāng)前，在中國市場上可購買到Pyro48儀器。焦磷酸光化測序法已經(jīng)在基因組學(xué)、分子遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、臨床分子診斷、細(xì)菌與病毒分型及法醫(yī)鑒定等方面得到廣泛的應(yīng)用。近年來，焦磷酸光化測序技術(shù)進(jìn)一步被受權(quán)給454生命科學(xué)公司，旨在開發(fā)基于陣列的焦磷酸測序技術(shù)，該技術(shù)作為大規(guī)模DNA測序的平臺出現(xiàn)，包括基因組測序和宏基因組學(xué)[10]。3、焦磷酸光化測序技術(shù)的應(yīng)用開發(fā)焦磷酸光化測序技術(shù)的初衷是為了大規(guī)模測定DNA核苷酸序列而服務(wù)的，但是，令人尷尬的是由于這項(xiàng)技術(shù)的基本原理是通過酶化學(xué)反響而產(chǎn)生可見光來檢測實(shí)時(shí)互補(bǔ)的核苷酸，而酶化學(xué)反響的代謝產(chǎn)物不可避免地會改變反響條件，因而，當(dāng)焦磷酸光化測序反響到達(dá)150～400個(gè)堿基，整個(gè)實(shí)驗(yàn)由于準(zhǔn)確性和敏感性的要求不得不停止。除此之外，該技術(shù)檢測三個(gè)或者三個(gè)以上重復(fù)序列有困難，譬如根據(jù)光的峰值難以鑒別是GG，還是GGG，或者是AAA，還是AAAA。正當(dāng)焦磷酸光化測序技術(shù)應(yīng)可用之處于困惑的困難時(shí)刻，HGP開場施行單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)圖譜研究，SNP分析并不需要很長的序列，能夠采用焦磷酸光化測序法技術(shù)來檢測基因型。更為重要的是，2006年，AndrewZ.Fire和CraigC.Mello因發(fā)現(xiàn)小RNA干擾和基因沉默技術(shù)而獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，極大地促進(jìn)了與小RNA，如RNAi和miRNA等相關(guān)的研究[11]。小RNA片段的序列僅有20多個(gè)核苷酸，而焦磷酸光化測序法技術(shù)完全能夠知足小RNA序列的檢測。因而，能夠講小RNA的科研工作給了焦磷酸光化測序技術(shù)起死回生的發(fā)展時(shí)機(jī)。焦磷酸光化測序技術(shù)的應(yīng)用主要牽涉分子遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，下面就焦磷酸光化測序技術(shù)的應(yīng)用問題分三個(gè)方面敘述。3.1、遺傳基因突變的檢測基因突變(genemutation)是指基因在構(gòu)造上發(fā)生堿基對組成或者排列的改變?；蛲蛔兛煞譃閮煞N主要方式：一種是遺傳性突變，是從父母遺傳的，并且在人的一生中幾乎存在于身體的每個(gè)細(xì)胞中。另一種是獲得性(或體細(xì)胞)突變，發(fā)生在人的一生中的某個(gè)時(shí)間，并且僅存在于某些細(xì)胞中，而不存在于身體的每個(gè)細(xì)胞中。這些變化可能是由環(huán)境因素引起的，例如來自太陽的紫外線輻射，或者由于DNA在細(xì)胞分裂經(jīng)過中本身復(fù)制發(fā)生錯(cuò)誤而發(fā)生的。體細(xì)胞獲得的突變一般不能傳遞給下一代。人體具有DNA損傷修復(fù)等機(jī)制，可通過將突變序列恢復(fù)到原始狀態(tài)來預(yù)防或糾正突變。但是，假如沒有能夠修復(fù)，就會導(dǎo)致人體機(jī)能發(fā)生障礙，產(chǎn)生疾病。所有的癌癥都是由于癌細(xì)胞基因組DNA序列發(fā)生改變而產(chǎn)生的。過去我們已經(jīng)對基因突變在癌癥的病理發(fā)生中的作用有所了解。然而，我們?nèi)缃裾M(jìn)入一個(gè)能夠獲得大量癌癥基因組的完好DNA序列的時(shí)代。這些研究將為我們提供一個(gè)具體和全面的視角，了解個(gè)體癌癥是怎樣發(fā)展的[12]。譬如，現(xiàn)有的研究資料表示清楚，人群中約有12%的女性在其一生中的某個(gè)時(shí)候會患上乳腺癌。攜帶有BRCA1或BRCA2基因突變的女性，患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，可達(dá)70%[13,14]。盡管每年進(jìn)行磁共振成像(MRI)和乳腺X線攝影篩查有助于早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌，但通過檢測基因突變能夠早期和準(zhǔn)確地診斷乳腺癌，為提高人民的健康水平服務(wù)。檢測基因突變的最直接有效的方式方法就是DNA序列檢測。我們知道當(dāng)前有很多種分析DNA序列的技術(shù)，譬如前面所提及的Sanger雙脫氧鏈終止法就是最常用的DNA序列檢測技術(shù)的基本原理。盡管獲得了相當(dāng)大的進(jìn)展，DNA測序仍然有些耗時(shí)和昂貴，需要三個(gè)獨(dú)立的步驟從模板生成測序產(chǎn)物：擴(kuò)增目的序列、純化擴(kuò)增產(chǎn)物，以及測序反響。常規(guī)的方式方法是將PCR擴(kuò)增和循環(huán)測序結(jié)合成一個(gè)單一的反響，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因組DNA的直接測序。以大染料測序試劑(應(yīng)用生物系統(tǒng))為載體，參加不同量的正、反向引物、脫氧核苷酸三磷酸(dNTPs)和輸入DNA，建立了聯(lián)合擴(kuò)增和測序反響。反響被熱循環(huán)35～45個(gè)周期，然后用毛細(xì)管電泳對產(chǎn)物進(jìn)行分析，以檢測測序產(chǎn)物。人們利用這項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行了多種測序應(yīng)用，包括鑒定基因的種系突變/多態(tài)性，對腫瘤DNA進(jìn)行測序以鑒定靶基因的體細(xì)胞突變等[15]。與常規(guī)的Sanger測序技術(shù)相比，焦磷酸光化測序法盡管在測序閱讀長度具有約400個(gè)堿基的上限，但它更具有定量優(yōu)異的檢測限，能夠快速準(zhǔn)確定量地檢測小片段DNA序列變異，假如揚(yáng)長避短地采用焦磷酸光化測序法技術(shù)，能夠使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)具有很高的性價(jià)比。3.2、SNP等位基因分型的簽定單核苷酸多態(tài)性(SNP)是在DNA特定位置發(fā)生的單個(gè)核苷酸置換，是最常見的遺傳變異類型。在人類基因組中，每1000個(gè)核苷酸能夠出現(xiàn)一次或者屢次，這意味著一個(gè)人的基因組中大約有400萬～500萬個(gè)SNP。這些遺傳變異具有特異性，在世界各地的人群中已發(fā)現(xiàn)超過1億個(gè)SNP。更重要的是，SNP能夠作為生物標(biāo)志物，有助于科學(xué)家找到與復(fù)雜性疾病，如高血壓、糖尿病和腫瘤等相關(guān)的易感基因或者拮抗基因。當(dāng)SNP發(fā)生在基因內(nèi)或基因附近的調(diào)控區(qū)域內(nèi)時(shí)，它們可能通過影響基因的功能在疾病中發(fā)揮病理性作用，可以能引起個(gè)體對某些藥物或者環(huán)境的不同反響。因而，鑒定SNP等位基因型是分子遺傳學(xué)、遺傳病理學(xué)和遺傳藥理學(xué)等學(xué)科最常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。SNP通常由兩個(gè)等位基因組成，可以能由三個(gè)等位基因組成。圖2表示清楚在人類基因組中可能出現(xiàn)的各種SNP，圖中歸納了所有SNP的代碼均是由美國生物化學(xué)學(xué)會設(shè)計(jì)和命名的，最常見的SNP是Y=C/T。全世界科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的人類基因組中所有的SNP圖譜都匯總記錄在SNP數(shù)據(jù)庫，如dbSNP()，這些數(shù)據(jù)庫作為人類的共同信息資料，可公開免費(fèi)使用。當(dāng)前，世界上有很多種技術(shù)能夠用于SNP基因型等位基因分型，這些技術(shù)的設(shè)計(jì)一般是為了分析SNP兩個(gè)等位基因特有的核苷酸。但是，焦磷酸光化測序法與它們不同，具有獨(dú)特的技術(shù)原理和優(yōu)勢，不僅能夠分析由兩個(gè)等位基因組成的SNP，而且能夠鑒定用其他技術(shù)無法分析的由三個(gè)等位基因組成的SNP，還能夠發(fā)現(xiàn)已鑒定SNP的周邊有沒有其他DNA變異。作者所在的實(shí)驗(yàn)室曾用動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交技術(shù)(dynamicallelespecifichybridisation,DASH)研究ICAM-1(intercellularcelladhesionmolecule-1,即細(xì)胞間黏附分子-1)基因與糖尿病和糖尿病腎病的關(guān)聯(lián)性[16,17]。該基因有一個(gè)非同義的單核苷酸多態(tài)性，由19號染色體10285007位的E(Glu)密碼子GAG和K(Lys)密碼子AAG之間的替換引起(ContigIDNT＿011295.12,GRCCH38.p7)。結(jié)果表示清楚，在瑞典人群體，這個(gè)SNP多態(tài)性基因型分布中的雜合子頻率很高，Kristiansen等[18]和Nishimura等[19]兩個(gè)科研小組盡管都發(fā)表了這個(gè)SNP丹麥與和日本人1型糖尿病相關(guān)聯(lián)的文章，但是前者在論文中沒有表示清楚其基因型的分布結(jié)果。通過與作者溝通原始實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這個(gè)SNP多態(tài)性基因型分布中的雜合子頻率在所研究的人群中都很高。一般來講，基因型分布中的高雜合子頻率可能是由于基因分型的技術(shù)限制或基因組重復(fù)(genomeduplicon)所造成[20]。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，避免錯(cuò)誤結(jié)果的發(fā)生，我們有必要用另一種基因分型原理不同的技術(shù)，即焦磷酸光化測序法重復(fù)基因分型實(shí)驗(yàn)。最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示清楚，這個(gè)SNP高雜合子頻率的現(xiàn)象在瑞典、丹麥、日本和馬來西亞的人群體中存在[18,19,21,22,23]。這個(gè)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)充分講明焦磷酸光化測序法獨(dú)特的技術(shù)原理能夠用于基因分型驗(yàn)證等類似的實(shí)驗(yàn)研究。圖2人類基因組中單核苷酸多態(tài)性的類型和代碼3.3、DNA甲基化水平的分析表觀遺傳學(xué)(epigenetics)主要研究基于DNA序列未發(fā)生改變而基因的功能和特性發(fā)生異常變化，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑和非編碼RNA調(diào)控等。在人類基因組中，DNA甲基化發(fā)生在體細(xì)胞中DNA兩條鏈上的胞嘧啶(5mecytosine)環(huán)的5-位(CpG)，通常DNA甲基化以CpG島的形式在基因的啟動(dòng)子或者其他區(qū)域出現(xiàn)?，F(xiàn)有的資料表示清楚，DNA甲基化的異常變化形式與生長發(fā)育、環(huán)境影響以及腫瘤等復(fù)雜性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因而，分析DNA甲基化水平的變化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的主要內(nèi)容之一。近年來，已經(jīng)開發(fā)了多種用于DNA甲基化研究的技術(shù)。但是，相比擬而言，焦磷酸光化測序法是一種實(shí)時(shí)DNA合成測序方式方法，通過酶促級聯(lián)反響能夠定量將核苷酸摻入時(shí)釋放的焦磷酸轉(zhuǎn)化為光信號，因而非常適用于亞硫酸氫鹽(bisulfite)處理后的DNA甲基化分析。如此圖3所示，應(yīng)用焦磷酸光化測序法進(jìn)行DNA甲基化分析的整個(gè)實(shí)驗(yàn)程序包括兩個(gè)部分。第一部分，將待檢測的DNA樣本用亞硫酸氫鹽處理，使得未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(uracil)，而待檢測甲基化的胞嘧啶(5mecytosine)保持原樣不變。第二部分，通過特異性引物和PCR擴(kuò)增制備DNA模板，在亞硫酸氫鹽處理和PCR之后，DNA模板序列中每個(gè)CpG位置的每個(gè)甲基化程度由T和C的比率確定，此刻用焦磷酸光化測序法就完全能夠量化分析發(fā)生甲基化的胞嘧啶水平。作者所在實(shí)驗(yàn)室的工作實(shí)踐表示清楚，無論某基因DNA甲基化水平較低還是很高,采用焦磷酸光化測序法分析這些靶基因DNA甲基化水平的變化，都能夠獲得很好的結(jié)果。譬如，近期的研究表示清楚，溶質(zhì)載體家族30成員8(solutecarrierfamily30member8,SLC30A8)是2型糖尿病易感基因[24,25]，我們用焦磷酸光化測序法研究馬來西亞2型糖尿病患者中該基因DNA甲基化水平的變化，結(jié)果表示清楚SLC30A8基因啟動(dòng)子上六個(gè)CpG位點(diǎn)平均基因甲基化水平高達(dá)約80%，顯著高于非糖尿病對照組[26]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(insulin-likegrowthfactor-bindingprotein7,IGFBP7)基因DNA甲基化水平較低(約15%)。我們分析該基因DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)該基因甲基化水平在男性2型糖尿病患者中明顯高于非糖尿病對照組，但在女性2型糖尿病和非糖尿病人群中未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。IGFBP7在胰島素抵抗的表觀遺傳學(xué)作用方面具有性別差異[27]。在人類基因組中，LINE-1(longinterspersednucleotideelement-1)在人類基因組中廣泛分布，近期，我們采用PyroQ96儀和焦磷酸光化測序法分析了英國2型糖尿病患者在14年隨訪期間基因組DNA中LINE-1DNA上4個(gè)CpG的變化，結(jié)果表示清楚整個(gè)基因組DNALINE-1甲基化平均水平為76%，在女性2型糖尿病患者中，LINE-1DNA甲基化水平的變化與舒張壓、腎小球?yàn)V過率和膽固醇高密度脂蛋白比值等代謝標(biāo)記物之間顯著負(fù)相關(guān)[28]。圖3焦磷酸光化測序法DNA甲基化水平的實(shí)驗(yàn)程序把上述三個(gè)研究實(shí)例總結(jié)起來能夠表示清楚，用焦磷酸光化測序法分析DNA甲基化水平具有下面優(yōu)點(diǎn)：(1)該技術(shù)能夠直接定量測定甲基化的胞嘧啶；(2)通過DNA樣本亞硫酸氫鹽的處理，能夠使所有檢測DNA甲基化統(tǒng)一定量而保證準(zhǔn)確性；(3)將與甲基化的胞嘧啶互相補(bǔ)的核苷酸摻入時(shí)釋放的焦磷酸轉(zhuǎn)化為光信號檢測，具有較高的敏感性。因而，焦磷酸光化測序法已經(jīng)被以為是DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方式方法。4、焦磷酸光化測序技術(shù)的發(fā)展前景生命科學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展不是孤立的，而是與工業(yè)革命帶來的新技術(shù)相鋪相成共同發(fā)展的。從過去的幾十年到將來的十年，工業(yè)革命在計(jì)算機(jī)技術(shù)、數(shù)字化照相和成像技術(shù)以及5-G通訊技術(shù)等方面，肯定會給當(dāng)代人類生活和生命科學(xué)研究帶來很大的改變。正如前面所言，焦磷酸光化測序法技術(shù)的本質(zhì)和亮點(diǎn)是產(chǎn)生焦磷酸而發(fā)出的可見光。因而，數(shù)字化照相和成像的進(jìn)步，計(jì)算機(jī)分析能力的提高，5-G通訊技術(shù)的快速，都有可能促進(jìn)焦磷酸光化測序技術(shù)的改良和新的發(fā)展。作者以為主要有兩個(gè)可能性：第一個(gè)是通過檢測系統(tǒng)的敏感性的提高，極大地提高對焦磷酸所產(chǎn)生的可見光的捕獲和量化分析，這樣就有可能只要少量的DNA模板，甚至不需要PCR擴(kuò)增而直接對于DNA樣本進(jìn)行焦磷酸光化測序法測序。假如能夠到達(dá)這個(gè)水平，那整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程不僅能夠節(jié)約至少一半的費(fèi)用，而且可能避免由于PCR擴(kuò)增出現(xiàn)的誤差和人工合成DNA對環(huán)境的污染。第二個(gè)是通過檢測系統(tǒng)敏感性和分辨率的提高，使得焦磷酸光化測序法能夠分析模板DNA序列中三個(gè)或者三個(gè)以上重復(fù)序列，譬如GGG或者AAAA等，進(jìn)而克制了該技術(shù)原有的缺陷?？傊?，在不久的將來，焦磷酸光化測序法很可能從諸多的DNA檢測技術(shù)中脫穎而出，成為一機(jī)多用、快速簡便和準(zhǔn)確有效的生命科學(xué)技術(shù)。講明：厘摩根cM(centi-Morgan)是遺傳學(xué)上確定基因重組頻率的測量單位,是由美國遺傳學(xué)家AlfredHenrySturtevant為了紀(jì)念他的教師，著名的遺傳學(xué)家ThomasHuntMorgan而建立的。1個(gè)cM定義為重組頻率100次中發(fā)生1次。假如兩個(gè)基因間相距1個(gè)cM，那么其后代與父母相比，有1%的個(gè)體具有不同的等位基因頻率。假如相距50cM，就意味著這兩個(gè)基因是不連鎖的，很有可能是位于不同的染色體上。對于人類基因組而言，1cM平均代表7.5105bp的距離。以下為參考文獻(xiàn)[1]GreenED,WatsonJD,CollinsFS.HumanGenomeProject:twenty-fiveyearsofbigbiology.Nature,2021,526:29-31[2]WatsonJD,CrickFH.Molecularstructureofnucleicacids:astructurefordeoxyribosenucleicacid.AmJPsychiatry,2003,160:623-4[3]SangerF.DeterminationofnucleotidesequencesinDNA.BiosciRep,2004,24:237-53[4]NilssonM,MalmgrenH,SamiotakiM,etal.Padlockprobes:circularizingoligonucleotidesforlocalizedDNAdetection.Science,1994,265:2085-8[5]LarssonC,KochJ,NygrenA,etal.InsitugenotypingindividualDNAmoleculesbytarget-primedrolling-circleamplificationofpadlockprobes.NatMethods,2004,1:227-32[6]FredrikssonS,GullbergM,JarviusJ,etal.Proteindetectionusingproximity-dependentDNAligationassays.NatBiotechnol,2002,20:473-7[7]AssarssonE,LundbergM,HolmquistG,etal.Homogenous96-plexPEAimmunoassayexhibitinghighsensitivity,specificity,andexcellentscalability.PLoSOne,2020,9:e95192[8]NyrnP,PetterssonB,UhlnM.SolidphaseDNAminisequencingbyanenzymaticluminometricinorganicpyrophosphatedetectionassay.AnalBiochem,1993,208:171-5[9]RonaghiM,UhlnM,NyrnP.Asequencingmethodbasedonreal-timepyrophosphate.Science,1998,281:363,365[10]MarguliesM,EgholmM,AltmanWE,etal.Genomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypicolitrereactors.Nature,2005,437:376-80[11]FireAZ.Genesilencingbydouble-strandedRNA.CellDeathDiffer,2007,14:1998-2020[12]StrattonMR,CampbellPJ,FutrealPA.Thecancergenome.Nature,2018,458:719-24[13]KotsopoulosJ.BRCAmutationsandbreastcancerprevention.Cancers(Basel),2021,10:E524[14]NarodSA,SalmenaL.BRCA1andBRCA2mutationsandbreastcancer.DiscovMed,2018,12:445-53[15]MurphyKM,BergKD,EshlemanJR.SequencingofgenomicDNAbycombinedamplif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