檢測NK細(xì)胞活性的方法

中國專利獎推薦項目介紹（發(fā)明/實用新型）專利號：ZL201410005008.7專利名稱：檢測NK細(xì)胞活性的方法申報單位：推薦單位：二〇二〇年九月十八日國家知識產(chǎn)權(quán)局制

一、申報項目基本信息專利號ZL201410005008.7專利名稱檢測NK細(xì)胞活性的方法專利權(quán)人王昭發(fā)明人王昭；張嘉；王旖旎；王晶石；吳林IPC主分類號IPC主分類號可通過國家知識產(chǎn)權(quán)局網(wǎng)站查詢。G01N21/64通訊地址/郵編聯(lián)系人1王昭手公電子郵箱zhaowww263@聯(lián)系人2手機(jī)辦公電話電子郵箱推薦單位

二、專利質(zhì)量評價材料評價“三性”和“文本質(zhì)量”,說明參評專利質(zhì)量的優(yōu)秀程度（一）新穎性和創(chuàng)造性：列出若干個申請日之前最接近的技術(shù)，簡要介紹其技術(shù)方案；并詳細(xì)說明未對參評專利的新穎性和創(chuàng)造性構(gòu)成實質(zhì)性影響。NK細(xì)胞活性是判定機(jī)體抗腫瘤、抗病毒感染及免疫調(diào)節(jié)功能的重要指標(biāo)之一。51Cr釋放法被認(rèn)為是NK細(xì)胞活性測定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但此方法檢測成本高，且具有放射性污染，不宜普遍開展。而LDH釋放法雖然操作簡便，但易受時間和溫度的影響，穩(wěn)定性差，且要求受檢單個核細(xì)胞的數(shù)量較多，造成采血量增加以及嚴(yán)重血細(xì)胞減低的患者檢測失敗。流式細(xì)胞術(shù)作為一種新型的NK細(xì)胞活性測定方法，近年來得到越來越廣泛的關(guān)注。但目前各種流式測定方法存在檢測結(jié)果易受非特異性染色、熒光易丟失等因素影響。雖然前期公開存在各類NK細(xì)胞活性的檢測方法，但由于各種檢測方法均存在自身缺陷不足及操作條件的限制，仍缺乏一種可廣泛應(yīng)用及臨床推廣的可靠穩(wěn)定的NK細(xì)胞活性的檢測手段。因此，臨床上對于某些危重疾病的早期診斷仍面臨很大挑戰(zhàn)。那么，建立一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確、直接、操作易行性強的檢測NK細(xì)胞活性的方法日漸凸顯其迫切性，是本領(lǐng)域技術(shù)人員一直存在并亟待解決的技術(shù)難題?；谏鲜鰡栴}，為克服上述前期NK細(xì)胞活性檢測方法的不足，本專利研發(fā)建立了轉(zhuǎn)染熒光細(xì)胞株聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)測定NK細(xì)胞活性技術(shù)，采用穩(wěn)定表達(dá)EGFP的長期傳代靶細(xì)胞株，并采用AnnexinV-PE/7AAD雙染色標(biāo)記不同狀態(tài)靶細(xì)胞所占比例，并能直觀精準(zhǔn)的反映NK細(xì)胞的殺傷活性，從而提高檢測的準(zhǔn)確性和成功率，并且宜于臨床推廣應(yīng)用。主要新穎性及創(chuàng)造性如下：1.本專利技術(shù)創(chuàng)新采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞株，使其能夠長期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，與瞬時轉(zhuǎn)染相比，克服了細(xì)胞長期傳代后EGFP大量丟失的情況，保證了該檢測方法的長期穩(wěn)定性；同時省去了預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞染色或抗體標(biāo)記的冗繁過程，也避免了非特異性染色以及標(biāo)記效/靶細(xì)胞所造成的細(xì)胞功能影響，從而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及檢測效率。2.采用AnnexinV-PE/7AAD雙染色標(biāo)記細(xì)胞凋亡，具有特異性細(xì)胞染色功能，能夠計算出靶細(xì)胞各階段不同狀態(tài)(活細(xì)胞、早凋、晚凋及壞死細(xì)胞)所占比例，與單純使用核酸染料碘化丙啶(PI)染色僅能標(biāo)記死亡細(xì)胞相比較，能夠更全面、直觀、精準(zhǔn)地反映NK細(xì)胞殺傷活性。3.將流式細(xì)胞術(shù)與EGFP熒光細(xì)胞株相結(jié)合用于NK細(xì)胞活性檢測，該創(chuàng)新克服了傳統(tǒng)檢測技術(shù)的放射性污染(51Cr釋放法)以及粗略性(LDH釋放法)的局限，敏感性及再現(xiàn)性強，并且對受檢者抽血量明顯減少，降低白細(xì)胞缺乏患者檢測失敗率，能大幅提高NK細(xì)胞活性檢測的準(zhǔn)確性和適用性。該技術(shù)的顯著優(yōu)點如下：①檢測方法靈敏度提高：在判定原發(fā)性HLH的效能方面，采用該項技術(shù)測定NK細(xì)胞活性的研究數(shù)據(jù)表明，ROC曲線下面積(AUC)為0.872，Youdenindex最大時對應(yīng)的敏感度為84.21%，特異度80.67%。②需采血量少：當(dāng)檢測血液中NK細(xì)胞的活性時，所需的血量大大減少，并且經(jīng)過試驗證明，本發(fā)明的檢測方法用于檢測血液中NK細(xì)胞的活性時，抽血量為傳統(tǒng)技術(shù)(51Cr釋放法、LDH釋放法、MTT比色法)的25%。③本技術(shù)不需要放射性物質(zhì)，因此不存在放射性污染。④檢測時間短。本技術(shù)的檢測時長僅為2-4h，大幅度節(jié)省了人力和物力資源的投入。綜上所述，本技術(shù)創(chuàng)新具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、樣品所需量小、無放射污染、檢測效率高等諸多優(yōu)點。該技術(shù)創(chuàng)新圖示如下：①熒光顯微鏡下觀察EGFP-K562細(xì)胞的凋亡情況，活細(xì)胞僅發(fā)出單一綠色熒光，凋亡細(xì)胞可被膜熒光染料AnnexinV-PE著色同時發(fā)出黃色熒光，細(xì)胞膜完整性被破壞的晚期凋亡及壞死細(xì)胞可被核酸染料7AAD著色發(fā)出紅色熒光。早期凋亡EGFP-K562細(xì)胞（低倍10×10）晚期凋亡及壞死EGFP-K562細(xì)胞（高倍10×40）②流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞殺傷活性結(jié)果示意圖單純EGFP-K562細(xì)胞自然凋亡背景正常人NK細(xì)胞的殺傷活性HLH患者NK細(xì)胞的殺傷活性（二）實用性：結(jié)合實施情況，說明參評專利的技術(shù)方案能夠制造或使用，并已產(chǎn)生了積極的效果。1.該專利技術(shù)成果被第30屆國際組織細(xì)胞學(xué)會議(30thHS,2014)選為大會發(fā)言《THESIGNIFICANCEOFANEWMETHODOFNKCELLACTIVITYBYFLOWCYTOMETRYINTHEDIAGNOSISOFADULTHEMOPHAGOCYTICSYNDROME》進(jìn)行匯報交流。研究成果相關(guān)論文《Applicationofanimprovedflowcytometry-basedNKcellactivityassayinadulthemophagocyticlymphohistiocytosis》于2017年發(fā)表在\o"Internationaljournalofhematology."IntJHematol.期刊雜志2017;105(6):828-834，系列相關(guān)研究論文分別發(fā)表在2019年ClinImmunol.期刊和2020年OrphanetJRareDis.期刊。2.該專利檢測技術(shù)被納入《HLH診治中國專家共識》中作為推薦檢測方法“關(guān)于NK細(xì)胞活性的檢測方法，國內(nèi)外沒有統(tǒng)一的規(guī)定，推薦使用熒光細(xì)胞構(gòu)建與流式細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合的手段檢測NK細(xì)胞殺傷活性方法。”——摘自《噬血細(xì)胞綜合征診治中國專家共識》(噬血細(xì)胞綜合征中國專家聯(lián)盟,中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會血液學(xué)組.噬血細(xì)胞綜合征診治中國專家共識[J].中華醫(yī)學(xué)雜志.2018,98(2):91-9)3.該項發(fā)明專利技術(shù)作為噬血細(xì)胞綜合征(HLH)快速診斷中的一項重要技術(shù)，榮獲2017年度北京市科學(xué)技術(shù)三等獎(2017醫(yī)-3-009-04)，2018年度華夏醫(yī)學(xué)科技獎二等獎(編號：201802039U0201)，2019年度北京醫(yī)學(xué)科技獎二等獎（編號：201902004）和2020年度“金橋獎”二等獎。4.目前已成功舉辦五屆“全國HLH相關(guān)實驗室檢測培訓(xùn)班”，推廣轉(zhuǎn)染熒光細(xì)胞株聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)測定NK細(xì)胞活性技術(shù)，來自全國20多個省近500名實驗技術(shù)人員參加培訓(xùn)。該項發(fā)明專利技術(shù)在全國多家三甲醫(yī)院開展了技術(shù)推廣及應(yīng)用，并出具應(yīng)用證明。5.該項發(fā)明專利技術(shù)成果連同其相關(guān)專利技術(shù)目前已成功實現(xiàn)科技成果轉(zhuǎn)化簽約。6.以該項專利技術(shù)為依托，獲得科研項目如下：①首都衛(wèi)生科研發(fā)展專項(自主創(chuàng)新轉(zhuǎn)化項目2016)：轉(zhuǎn)染熒光細(xì)胞株聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)測定NK細(xì)胞活性的新技術(shù)及其臨床應(yīng)用；②北京市醫(yī)管局“揚帆”計劃（臨床技術(shù)創(chuàng)新項目2018）：NK細(xì)胞功能性檢測用于快速診斷噬血細(xì)胞綜合征的臨床研究。7.該項專利技術(shù)及相關(guān)內(nèi)容被多家網(wǎng)絡(luò)及視頻媒體(搜狐網(wǎng)、丁香園、華醫(yī)網(wǎng)等)進(jìn)行報道：①搜狐網(wǎng)：北京友誼醫(yī)院血液科領(lǐng)銜的科研項目獲北京市科學(xué)技術(shù)獎勵三等獎/a/222160295_100443，；②丁香園：專家訪談|北京友誼醫(yī)院王昭主任談噬血細(xì)胞綜合征-丁香園/article/582271；③華醫(yī)網(wǎng)：/cme/contents/30/21048.html；④搜狐網(wǎng)：/a/274951466_685811。三、技術(shù)先進(jìn)性評價材料（一）技術(shù)原創(chuàng)性及重要性：結(jié)合技術(shù)要點，說明參評專利屬于基礎(chǔ)型的專利或改進(jìn)型專利，并解釋是否解決了本領(lǐng)域關(guān)鍵性、共性的技術(shù)難題。本發(fā)明專利基于流式細(xì)胞術(shù)、穩(wěn)定傳代熒光標(biāo)記細(xì)胞、特異性染色技術(shù)，實現(xiàn)NK細(xì)胞活性的實時精準(zhǔn)檢測，以克服目前檢測技術(shù)的局限性。1.目前流式細(xì)胞術(shù)多采用基因轉(zhuǎn)染方法使靶細(xì)胞特異性表達(dá)增強型綠色熒光蛋白(EGFP)，這種瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)存在多次傳代后EGFP大量丟失的情況，因而影響檢測結(jié)果，難以保證實驗的長期性。本專利在研發(fā)過程中，構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)目的基因的慢病毒質(zhì)粒載體并包裝形成慢病毒，然后用上述慢病毒侵染K562細(xì)胞，將目的基因整合到靶細(xì)胞的基因組中，并篩選得到一株穩(wěn)定表達(dá)EGFP的單克隆K562細(xì)胞系，使其能夠長期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。解決了靶細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的技術(shù)難點，保證了檢測結(jié)果的可靠性，并易于保存和轉(zhuǎn)運。2.目前用于凋亡細(xì)胞標(biāo)記的染色劑PI僅能標(biāo)記晚期凋亡及壞死細(xì)胞，故無法反映NK細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷的早期凋亡。本專利采用AnnexinV-PE/7AAD雙染色標(biāo)記細(xì)胞凋亡，能夠計算出靶細(xì)胞各階段不同狀態(tài)(活細(xì)胞、早凋、晚凋及壞死細(xì)胞)所占比例，將那些處于早期凋亡階段(傳統(tǒng)方法無法體現(xiàn))的細(xì)胞明確標(biāo)記，可以更全面、直觀、精準(zhǔn)的反映NK細(xì)胞的殺傷活性。因此解決了現(xiàn)有檢測手段難以對NK細(xì)胞實際殺傷能力進(jìn)行評估的技術(shù)難點。3.該創(chuàng)新克服了傳統(tǒng)檢測技術(shù)的放射性污染(51Cr釋放法)以及粗略性(LDH釋放法)的局限，敏感性及再現(xiàn)性強，并且對受檢者抽血量明顯減少，降低白細(xì)胞缺乏患者檢測失敗率，能大幅提高NK細(xì)胞活性檢測的準(zhǔn)確性和適用性。（二）技術(shù)優(yōu)勢：１．對比若干個當(dāng)前（參加評獎時）的同類技術(shù)，詳細(xì)說明參評專利在提高效率、降低成本、節(jié)能減排、改善性能、提升品質(zhì)等方面的技術(shù)優(yōu)勢和不足。２．結(jié)合實施情況，相對于公開的技術(shù)方案，說明參評專利技術(shù)實施效果的確定性。該專利檢測技術(shù)與目前各類技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：1.通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染使靶細(xì)胞本身可以特異性表達(dá)熒光蛋白，從而省去了每次實驗前需預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞染色或抗體標(biāo)記的冗繁過程，提高了檢測效率；同時也避免了非特異性染色結(jié)果不準(zhǔn)確的問題，避免了共孵育前標(biāo)記靶細(xì)胞影響靶細(xì)胞功能的問題，提高了檢測的精準(zhǔn)性。2.本檢測方法不需要放射性物質(zhì)，因此，不存在放射性污染。3.檢測時間短：本專利檢測方法的檢測時長約為2-4h，而傳統(tǒng)技術(shù)（LDH釋放法、MTT比色法等）的檢測時間需要18-24h，由此可見，本專利技術(shù)大大縮短了檢測時間。4.由于本檢測方法靈敏度提高，因此，當(dāng)檢測血液中NK細(xì)胞的活性時，所需的采血量大大減少，并且經(jīng)過試驗證明，本發(fā)明的檢測方法用于檢測血液中NK細(xì)胞的活性時，抽血量僅為傳統(tǒng)技術(shù)（51Cr釋放法、LDH釋放法等）的1/4，降低了白細(xì)胞缺乏患者檢測失敗率，能大幅提高NK細(xì)胞活性檢測的適用性。綜上所述，本檢測方法具有檢測全面、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、檢測效率高、樣品所需量小等諸多優(yōu)點。（三）技術(shù)通用性：1.介紹參評專利目前已應(yīng)用的領(lǐng)域和范圍；2.說明該專利技術(shù)還可以應(yīng)用的其他領(lǐng)域和范圍。以上材料不超過2500字。1.目前應(yīng)用領(lǐng)域范圍：噬血細(xì)胞綜合征(HLH)是一種危及生命的高炎癥因子狀態(tài)，若不能及時診斷并給予恰當(dāng)?shù)闹委?，病死率極高。而NK細(xì)胞活性是早期確診HLH的重要指標(biāo)，準(zhǔn)確測定NK細(xì)胞活性的變化是診斷疾病、選擇治療方式以及隨訪療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。噬血細(xì)胞綜合征(Hemophagocyticlymphohistiocytosis,HLH)是一種以T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化的失控以及炎性細(xì)胞因子過度生成為特征的免疫紊亂狀態(tài)?；顒悠诘腍LH病情進(jìn)展迅速，若不及時進(jìn)行合理、有效的干預(yù)治療，死亡率極高。因此，若患者在疾病早期能夠得到及時準(zhǔn)確的診斷，積極給予恰當(dāng)?shù)闹委?，可以改善生存，降低病死率。HLH的病理生理基礎(chǔ)為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的下調(diào)和NK細(xì)胞功能的缺陷。NK細(xì)胞活性降低是HLH-2004診斷標(biāo)準(zhǔn)中一項重要的檢測指標(biāo)。Janka等發(fā)現(xiàn)原發(fā)性HLH患者在疾病早期NK細(xì)胞活性降低檢測率幾乎可達(dá)100%。另有Spessott等研究證實即使基因篩查為雜合突變也可能導(dǎo)致蛋白功能異常因而確診為原發(fā)性HLH，而這類患者早期NK細(xì)胞活性持續(xù)降低，這些都說明NK細(xì)胞活性的測定對早期正確診斷HLH具有重要意義。越來越多的研究認(rèn)為，體外檢測NK細(xì)胞活性是HLH診斷、選擇合理治療方式以及隨訪療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前該專利檢測技術(shù)已被納入《HLH診治中國專家共識》中作為NK細(xì)胞活性的推薦檢測方法。2.其他應(yīng)用領(lǐng)域：在實際臨床應(yīng)用當(dāng)中，NK細(xì)胞活性是判定機(jī)體抗腫瘤、抗病毒感染及免疫調(diào)節(jié)功能的重要指標(biāo)之一，并可在一定程度上判定及監(jiān)測疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。例如：在惡性腫瘤、免疫缺陷病、長期使用免疫抑制劑及部分病毒、細(xì)菌和真菌感染患者中，NK細(xì)胞活性減低；在某些病毒感染性疾病的早期、長期使用干擾素及其誘導(dǎo)物、習(xí)慣性流產(chǎn)及宿主抗移植物反應(yīng)者中，NK細(xì)胞活性增高。該專利技術(shù)檢測NK細(xì)胞活性的應(yīng)用可在一定程度上提高某些危重疾病的早期診斷率，及早得到有效治療，從而更好地服務(wù)于醫(yī)療及患者，使更多危重患者的預(yù)后得到改善，并從中獲益。四、社會效益及發(fā)展前景評價材料（一）社會效益狀況：詳細(xì)說明參評項目對促進(jìn)技術(shù)進(jìn)步、提高科學(xué)管理水平、保護(hù)自然資源與生態(tài)環(huán)境、消除公害污染、安全生產(chǎn)、改善勞動條件、醫(yī)療保健、保障國家和公共安全、提高人民物質(zhì)文化生活水平、引領(lǐng)消費習(xí)慣等方面所起的作用。如能采取定量方法說明的均需有具體數(shù)字。該項專利解決了目前用于NK細(xì)胞活性測定的各種檢測手段的局限性（包括放射性污染、白細(xì)胞缺乏失敗率高、可重復(fù)性差、判讀不精準(zhǔn)等），提高了該技術(shù)領(lǐng)域的檢測水平，提高了診斷時效，節(jié)省醫(yī)療資源。具體如下：1.該專利檢測方法不需要放射性物質(zhì)及高昂的設(shè)備，因此不存在放射性污染，節(jié)省了醫(yī)療資源；2.所需采血量減少，抽血量僅為傳統(tǒng)技術(shù)的1/4，降低了白細(xì)胞缺乏患者檢測失敗率，降低患者多次抽血痛苦，擴(kuò)大檢測的適用性；3