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多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片斷一、基礎(chǔ)知識(一)DNA分子的結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸1、基本單位脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式2、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’通常將DNA的羥基“-OH”末端稱為3’端,而磷酸基團的末端稱為5’端堿基脫氧核糖磷酸基團堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’3、DNA的結(jié)構(gòu)(二)DNA的復(fù)制2、時期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場所細胞核(主)、線粒體、葉綠體4、模板兩條DNA母鏈1、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程5、原材料6、基本條件脫氧核苷酸酶、ATP、原料、模板邊解旋邊復(fù)制(過程)7、復(fù)制特點半保留復(fù)制(結(jié)果)8、遵循原則堿基互補配對原則②RNA引物的合成以單股DNA為模板,在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成以單股的DNA為模板,在DNA聚合酶的作用下,在RNA引物的末端由5’端-3’端合成DNA。④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA,此時的DNA片斷稱為岡崎片斷9、復(fù)制過程①DNA的解旋親代DNA分子利用細胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂,部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈⑤DNA片斷的連接在DNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的DNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的DNA(四)PCR(多聚酶鏈式反應(yīng))1、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA,只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈,因此,DNA復(fù)制需要引物2、DNA聚合酶作用過程當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后,DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈,DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸3、PCR原理①在80-100°C的溫度范圍內(nèi),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體,雙鏈分開,這個過程稱為變性②當溫度緩慢降低后,兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈,這個過程稱為復(fù)性③PCR利用了DNA的熱變性原理,通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合,現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器4、TaqDNA聚合酶的應(yīng)用5、緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)DNA模板,分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物,四種脫氧核苷酸,耐熱的DNA聚合酶,同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行6、細胞內(nèi)和細胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)DNA的復(fù)制體外的模擬模板(母鏈)細胞內(nèi)源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP細胞內(nèi)源外源加入聚合酶細胞內(nèi)源外源加入反應(yīng)環(huán)境細胞內(nèi)環(huán)境緩沖液①PCR過程需要的引物不是RNA,而是人工合成的DNA單鏈,其長度通常為20-30個脫氧核苷酸7、細胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點②PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶,而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的(五)PCR的反應(yīng)過程1、PCR的反應(yīng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán),每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復(fù)性和延伸①變性(模板DNA解旋)模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使成為單鏈,以便于它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準備2、循環(huán)過程靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步:加熱變性(950C)②復(fù)性(退火)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降到500C左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步:引物與靶序列退火550C③延伸DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料,以母鏈為模板,按堿基互補配對的原則與半保留復(fù)制的原理,合成一條新的DNA鏈靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步:引物延伸720C靶序列靶序列第1個PCR循環(huán)完成后:得到兩個拷貝的靶序列4、PCR循環(huán)的結(jié)果②DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列,使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增①從第二輪循環(huán)開始,上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng),并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合,進行DNA的延伸循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量二、PCR的實驗操作1、PCR儀(一)設(shè)備及用具實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管,總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體,其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次PCR儀微量離心管微量移液器1、準備2、移液(二)實驗操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑①過程:蓋嚴微量離心管口的蓋子,用手指輕輕彈擊管壁②注意:3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁,目的是使反應(yīng)液混合均勻A、離心管口的蓋子一定蓋嚴,防止實驗中脫落或液體外溢將離心管放入PCR儀上,設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序①過程:將微量離心管放在離心機上,離心約10s4、離心5、反應(yīng)②離心目的:使反應(yīng)液體集中在離心管底部,提高反應(yīng)效果循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94°C,10min--30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1minPCR技術(shù)高度靈敏,為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗,PCR操作時要注意做到:6、注意事項①隔離操作區(qū),所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌;②分裝試劑,簡化操作程序,使用一次性槍頭(一)理論上DNA擴增數(shù)目的計算三、課題成果評價1、一條DNA,復(fù)制n次,DNA為2n2、
a條DNA,復(fù)制n次,DNA為ax2n(二)實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果,DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰,峰值的大小與DNA的含量有關(guān)2、過程①稀釋2uLPCR反應(yīng)液,加入98uL蒸餾水,即將樣品進行50倍稀釋②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照,在波長260nm處,將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100uL至比色杯中,測定260nm處的光吸收值③讀數(shù)④計算DNA含量(g)=50x(260nm的讀數(shù))x稀釋倍數(shù)50:1g/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02四、課題延伸PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出特點五、實驗小結(jié)
PCR儀加熱使()變性,復(fù)性使引物與模板DNA(),延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(),在()的作用下,以()為原料,以()為復(fù)制的起點,合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫
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