生物：52《多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段》課件(新人教版選修1)

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷一、基礎(chǔ)知識（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸1、基本單位脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)式2、脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’通常將DNA的羥基“－OH”末端稱為3’端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5’端堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’3、DNA的結(jié)構(gòu)（二）DNA的復(fù)制2、時(shí)期有絲分裂間期減數(shù)第一次分裂前的間期3、場所細(xì)胞核（主）、線粒體、葉綠體4、模板兩條DNA母鏈1、概念由一個(gè)DNA形成兩個(gè)完全相同的DNA的過程5、原材料6、基本條件脫氧核苷酸酶、ATP、原料、模板邊解旋邊復(fù)制(過程）7、復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制（結(jié)果）8、遵循原則堿基互補(bǔ)配對原則②RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物③DNA的生成以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。④切掉引物生成岡崎片斷在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下將引物部位換上DNA，此時(shí)的DNA片斷稱為岡崎片斷9、復(fù)制過程①DNA的解旋親代DNA分子利用細(xì)胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈⑤DNA片斷的連接在DNA連接酶的作用下將岡崎片斷連接起來。形成一條完整的新的DNA鏈。新鏈與舊鏈構(gòu)成新的DNA（四）PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）1、DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物2、DNA聚合酶作用過程當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸3、PCR原理①在80－100°C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性②當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈，這個(gè)過程稱為復(fù)性③PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器4、TaqDNA聚合酶的應(yīng)用5、緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行6、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)DNA的復(fù)制體外的模擬模板（母鏈）細(xì)胞內(nèi)源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP細(xì)胞內(nèi)源外源加入聚合酶細(xì)胞內(nèi)源外源加入反應(yīng)環(huán)境細(xì)胞內(nèi)環(huán)境緩沖液①PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為20－30個(gè)脫氧核苷酸7、細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點(diǎn)②PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的（五）PCR的反應(yīng)過程1、PCR的反應(yīng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個(gè)基本步驟──變性、復(fù)性和延伸①變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備2、循環(huán)過程靶序列靶序列PCR循環(huán)第一步：加熱變性(950C）②復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循環(huán)第二步：引物與靶序列退火550C③延伸DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)第三步：引物延伸720C靶序列靶序列第1個(gè)PCR循環(huán)完成后：得到兩個(gè)拷貝的靶序列4、PCR循環(huán)的結(jié)果②DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增①從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量二、PCR的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具實(shí)質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次PCR儀微量離心管微量移液器1、準(zhǔn)備2、移液（二）實(shí)驗(yàn)操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑①過程：蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁②注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻A、離心管口的蓋子一定蓋嚴(yán)，防止實(shí)驗(yàn)中脫落或液體外溢將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序①過程：將微量離心管放在離心機(jī)上,離心約10s4、離心5、反應(yīng)②離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94°C，10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：6、注意事項(xiàng)①隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；②分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算三、課題成果評價(jià)1、一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復(fù)制n次，DNA為ax2n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測定1、原理可以通過計(jì)算DNA含量來評價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)2、過程①稀釋2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③讀數(shù)④計(jì)算DNA含量（g）＝50x(260nm的讀數(shù)）x稀釋倍數(shù)50：1g/ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02四、課題延伸PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出特點(diǎn)五、實(shí)驗(yàn)小結(jié)

PCR儀加熱使（）變性,復(fù)性使引物與模板DNA（）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(),在（）的作用下,以（）為原料,以（）為復(fù)制的起點(diǎn),合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫