中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)課件

中醫(yī)藥研究常用分子生物學(xué)技術(shù)

教學(xué)參考資料唐炳華、王繼峰:醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)(第一版）,中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2006年胡維新:醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（第一版）,科學(xué)出版社,2007年T.A.Brown著，魏群等譯：基因克隆和DNA分析（第五版），高等教育出版社，2003年王艷明、周坤福、徐力：分子生物學(xué)與中醫(yī)藥研究，上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，2000年RobertF.Weaver：MolecularBiology（3rded），

McGraw-HillPress.2005[美]J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯：分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版），科學(xué)出版社，2002年朱玉賢、李毅、鄭曉峰：現(xiàn)代分子生物學(xué)（第三版），高等教育出版社，2007年

教學(xué)參考資料盧圣棟：現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，高等教育出版社，1993年J.D.WatsonetalMolecularBiologyoftheGene

5thTheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.2003Lewin,B.,GENES

Ⅷ.UniversityPress,Oxford.2004孫乃恩孫東旭朱德煦：分子遺傳學(xué)（第二版），南京大學(xué)出版社，1997年網(wǎng)址：（參見教材P274表7-3）第一章緒論一、什么是分子生物學(xué)分子生物學(xué)已廣泛滲透到醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理論基礎(chǔ)。微生物學(xué)臨床各學(xué)科細(xì)胞學(xué)免疫學(xué)病理學(xué)藥理學(xué)生理學(xué)分子生物學(xué)二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容

（一）分子生物學(xué)理論1、核酸的分子生物學(xué)：研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能。分子遺傳學(xué)（moleculargenetics）是其主要研究?jī)?nèi)容包括①核酸/基因組的結(jié)構(gòu)，②遺傳信息的復(fù)制，③轉(zhuǎn)錄與翻譯，④核酸存儲(chǔ)的信息突變與修復(fù)，⑤基因表達(dá)調(diào)控和基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用等。遺傳信息傳遞的中心法則（centraldogma）是其理論體系的核心。二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容

（一）分子生物學(xué)理論：1、核酸的分子生物學(xué)：研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能。（二）

分子生物學(xué)技術(shù)1、基本技術(shù)分光光度技術(shù)；電泳技術(shù)（瓊脂糖凝膠電泳，醋酸纖維素薄膜電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦，λ噬菌體的限制性內(nèi)切酶酶切片段）；放射性同位素技術(shù)；色譜技術(shù)（層析法，吸附色譜法，分配色譜法，離子交換色譜法，凝膠色譜法，親和色譜法，高效液相色譜法）；細(xì)胞培養(yǎng)等二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容（二）

分子生物學(xué)技術(shù)2、核酸操作技術(shù)核酸的提取和純化；DNA、RNA合成技術(shù)；DNA重組技術(shù)；核酸雜交技術(shù)；DNA序列測(cè)定技術(shù)等。3、實(shí)用蛋白技術(shù)蛋白質(zhì)的提取和純化；蛋白質(zhì)測(cè)定；蛋白質(zhì)印跡技術(shù)；蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)等。二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容分子生物學(xué)中的兩項(xiàng)最重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

分子生物學(xué)的誕生和發(fā)展中的瓶頸基因克?。―NA重組，基因工程）

(Geneclone,DNArecombination,geneengineering)

基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)vectorDNA操作工具酶的發(fā)現(xiàn)DNAmanipulation

基因合成和基因測(cè)序sequencePCR技術(shù)(polymerasechainreaction)三、分子生物學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史

（一）準(zhǔn)備和醞釀階段

19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初，是現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的準(zhǔn)備和醞釀階段。在這一階段產(chǎn)生了兩點(diǎn)對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)上的重大突破：

1、確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)2、確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA1944年O.T.Avery等證明了肺炎球菌轉(zhuǎn)化因子是DNA1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P分別標(biāo)記T2噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸

,證明遺傳物質(zhì)是DNA。（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段

這一階段是從50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑，開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代。

1、中心法則的建立Watson和Crick就提出DNA復(fù)制的可能模型。1956年A.Kornbery首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶。1958年Meselson及Stahl用同位素標(biāo)記和超速離心分離實(shí)驗(yàn)為DNA半保留模型提出了證明。1968年Okazaki（岡畸）提出DNA不連續(xù)復(fù)制模型。（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段1972年證實(shí)了DNA復(fù)制開始需要RNA作為引物

1958年Weiss及Hurwitz等發(fā)現(xiàn)依賴于DNA的RNA聚合酶

1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補(bǔ)

60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學(xué)家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼

1970年Temin和Baltimore又同時(shí)從雞肉瘤病毒顆粒中發(fā)現(xiàn)以RNA為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄酶

（三）初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段

70年代后，以基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，標(biāo)志著人類深入認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并能動(dòng)改造生命的新時(shí)期開始。其間的重大成就包括：

1、重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶為基因工程提供了有力的工具；1972年Berg等將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使本來(lái)在真核細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)能在細(xì)菌中合成,打破了種屬界限；1、重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展1977年Boyer等首先將人工合成的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽

1979年美國(guó)基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰島素。

1、重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展我國(guó)已有人干擾素、人白介素2、人集落刺激因子、重組人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹瀉疫苗等多種基因工程藥物和疫苗進(jìn)入生產(chǎn)或臨床試用。1982年P(guān)almiter等將克隆的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫鸭?xì)胞核內(nèi)，培育得到比原小鼠個(gè)體大幾倍的“巨鼠”。1991年美國(guó)向一患先天性免疫缺陷病（遺傳性腺苷脫氨酶ADA基因缺陷）的女孩體內(nèi)導(dǎo)入重組的ADA基因，獲得成功。

1994年我國(guó)用導(dǎo)入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治療了乙型血友病的患者。

2、分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展

⑴癌基因的發(fā)現(xiàn)⑵基因診斷⑶基因組文庫(kù)的建立⑷基因工程生產(chǎn)人胰島素⑸轉(zhuǎn)基因動(dòng)物⑹人類基因治療⑺基因工程抗體技術(shù)的建立和發(fā)展⑻DNA芯片技術(shù)（基因芯片、生物芯片）3、基因組研究的發(fā)展

1977年Sanger測(cè)定了ΦX174-DNA全部5375個(gè)核苷酸的序列；

1978年Fiers等測(cè)出SV-40DNA全部5224對(duì)堿基序列；

20世紀(jì)80年代λ噬菌體DNA全部48,502堿基對(duì)的序列全部測(cè)出；

1996年底許多科學(xué)家共同努力測(cè)出了大腸桿菌基因組DNA的全序列長(zhǎng)4x106堿基對(duì)。

1990~2003年人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject）實(shí)施并基本完成。4、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理

1961年，Jacob，F(xiàn).和Monod，J.提出了操縱子模型，打開了人類認(rèn)識(shí)基因表達(dá)調(diào)控的窗口。20世紀(jì)70年代以后才逐漸認(rèn)識(shí)了真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的復(fù)雜性。

1977年最先發(fā)現(xiàn)猴SV40病毒和腺病毒中編碼蛋白質(zhì)的基因序列是不連續(xù)的，揭開了認(rèn)識(shí)真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的序幕。

1981年Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA的自我剪接，從而發(fā)現(xiàn)核酶（ribozyme）。

20世紀(jì)80-90年代，使人們逐步認(rèn)識(shí)到真核基因的順式調(diào)控元件與反式轉(zhuǎn)錄因子、核酸與蛋白質(zhì)間的分子識(shí)別與相互作用是基因表達(dá)調(diào)控根本所在。

6、小分子RNA研究進(jìn)展1993年，LeeRC等發(fā)現(xiàn)線蟲（C.elegans）lin-4基因編碼的長(zhǎng)度為22~61b的小分子RNA關(guān)閉線蟲不同發(fā)育階段mRNA轉(zhuǎn)錄的作用，這是繼核酶以后，內(nèi)源性RNA參與基因調(diào)節(jié)的又一證據(jù)。小分子RNA(miRNA或siRNA）具有調(diào)控基因表達(dá)的功能。miRNA可以通過(guò)部分互補(bǔ)結(jié)合到目的mRNA的3′非翻譯區(qū)，抑制蛋白質(zhì)合成。這種結(jié)合并不誘導(dǎo)目的mRNA的降解。siRNA能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因沉默，與長(zhǎng)雙鏈RNA有同源序列的mRNA被降解，從而抑制基因的表達(dá)。二十一世紀(jì)生物學(xué)的新熱點(diǎn)及領(lǐng)域

結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）

生物大分子的高級(jí)三維結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一生物大分子之間的互作→基因的社會(huì)學(xué)分子發(fā)育生物學(xué)（MolecularDevelopingBiology）基因表達(dá)，基因互作

器官發(fā)生胚胎形成個(gè)體發(fā)育五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

（一）在中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用1、證本質(zhì)的研究近年來(lái)運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)腎的實(shí)質(zhì)、活血化瘀理論及中藥抗衰老機(jī)理進(jìn)行研究例①沈自尹等采用RT-PCR法進(jìn)行了“補(bǔ)腎健脾活血三類復(fù)方對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸及促腎上腺激素釋放因子（CRF）基因表達(dá)的影響”的研究，其目的是從分子水平來(lái)闡述藥物對(duì)腎陽(yáng)虛證的主要調(diào)節(jié)點(diǎn)。例②陳可冀等應(yīng)用斑點(diǎn)印跡雜交、原位雜交、和3H-TdR摻入細(xì)胞DNA等技術(shù)，證明活血化瘀類中藥都可抑制血管壁血小板衍化生長(zhǎng)因子（PDGF）基因及血管壁原癌基因c-mycmRNA的表達(dá)水平，從而抑制動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生，阻止動(dòng)脈粥樣硬化。研究表明，活血化瘀類中藥干預(yù)基因調(diào)控、抑制原癌基因表達(dá)。例③沈小珩采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)二仙湯及其拆方影響老年大鼠肝組織超氧化物岐化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性及其基因表達(dá)水平的觀察發(fā)現(xiàn)，老年大鼠氧化脂質(zhì)（LPO）含量明顯提高，超氧化物岐化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性降低，而且與這類編碼這類酶的基因表達(dá)水平密切相關(guān)，用二仙湯及其拆方治療后，大鼠氧化脂質(zhì)（LPO）含量明顯降低，提高了超氧化物岐化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性。五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

（一）在中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用2、治則治法的研究科研人員用抑癌扶正行氣活血法治療經(jīng)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌大鼠，采用DD-PCR（差異顯示技術(shù)）和Northernbolt對(duì)治療后大鼠肝組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肝癌組織若干癌基因轉(zhuǎn)錄水平降低。（見P8）五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

（二）在中醫(yī)臨床上的應(yīng)用吳志奎等進(jìn)行了“補(bǔ)腎生血方對(duì)β-地中海貧血基因水平的影響”的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎生血藥能明顯提高β-地中海貧血患者血紅蛋白（Hb）和抗堿血紅蛋白（HbF），提高血紅蛋白的珠蛋白鏈比。起作用機(jī)制可能是補(bǔ)腎生血藥能提高珠蛋白鏈γ/β+γ比值，促進(jìn)γ-珠蛋白基因的表達(dá)，誘導(dǎo)HbF合成，從而代償了β-珠蛋白基因功能缺陷。五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

（三）在針灸研究中的應(yīng)用1、針刺鎮(zhèn)痛與C-fos、C-jun、CC-k基因的研究2、耳針與表皮生長(zhǎng)因子RACTH的研究3、電針抗癇與CCK基因表達(dá)的研究4、電針與抗腦缺血與C-fos原癌基因表達(dá)的研究5、針刺抑制老年大鼠與垂體細(xì)胞因子基因表達(dá)6、電針對(duì)細(xì)胞凋亡的影響7、針刺對(duì)脊髓背角內(nèi)生長(zhǎng)期相關(guān)蛋白GAP43表達(dá)的影響8、針刺對(duì)雌性大鼠垂體雌激素受體mRNA表達(dá)和血雌二醇（E2）水平影響的研究9、“醒腦開竅”針?lè)▽?duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠腦細(xì)胞核糖核酸的影響（四）在中藥研究中的應(yīng)用1、鑒定中藥材及藥用植物資源保護(hù)常用DNA分子標(biāo)記法，其是指以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。

DNA分子遺傳標(biāo)記常用的方法是RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA——隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)DNA)是1990年由Williams等發(fā)展起來(lái)的。分子標(biāo)記主要應(yīng)用：

遺傳育種

生藥鑒定和藥材道地性

五、分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

2、獲取有效成分一是