蛋白質(zhì)和氨基酸的測定

關(guān)于蛋白質(zhì)和氨基酸的測定第一頁，共五十一頁，2022年，8月28日§8-1概述§8-2蛋白質(zhì)的定性測定（自學(xué)）§8-3蛋白質(zhì)的定量測定*（§8-4蛋白質(zhì)的末端測定）§8-5氨基酸的定性測定（自學(xué)）§8-6氨基酸的定量測定*§8-7氨基酸的分離及測定第八章蛋白質(zhì)和氨基酸的測定第二頁，共五十一頁，2022年，8月28日本章重點凱氏定氮法的原理及注意事項。蛋白質(zhì)快速測定法有哪些？氨基酸總量的測定方法（甲醛滴定法）。第三頁，共五十一頁，2022年，8月28日

第一節(jié)概述

蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機化合物。蛋白質(zhì)換算系數(shù)F

玉米、雞蛋、肉6.25花生5.46

乳制品6.38大米5.95

面粉5.70大豆及制品5.71蛋白質(zhì)平均含N量（15-17.6）為16%

。第四頁，共五十一頁，2022年，8月28日不同的食品中蛋白質(zhì)含量不一樣，一般動物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。雞肉鴨兔肉牛肉豬肉帶魚

21.516.521.220.19.518.1大豆稻米菠菜蘋果黃瓜牛乳

36.38.52.40.40.83.5第五頁，共五十一頁，2022年，8月28日測定意義：評價食品的營養(yǎng)價值。為合理開發(fā)利用食物資源，提高產(chǎn)品質(zhì)量，優(yōu)化食品配方及生產(chǎn)過程控制提供依據(jù)。第六頁，共五十一頁，2022年，8月28日其中：凱氏定氮法——最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍。雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法等——多用于生產(chǎn)單位質(zhì)量控制分析。國外：紅外分析儀在一般的常規(guī)檢驗中多進行氨基酸總量的測定，通常采用酸堿滴定法來完成。各種氨基酸的分離與定量——色譜技術(shù)。有多種氨基酸分析儀。蛋白質(zhì)的測定方法：分兩大類

一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量；

另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基（酸性和堿性基團、芳香基團等）測定蛋白質(zhì)含量。第七頁，共五十一頁，2022年，8月28日第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性測定

（自學(xué)）一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并變色。書中列舉了5種染料。二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)（一）糖蛋白的顯色（3種方法）（二）脂蛋白的顯色（2種方法）第八頁，共五十一頁，2022年，8月28日測定總氮量→

N%×F=粗蛋白質(zhì)含量%因為：樣品中除蛋白氮外，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物堿、含氮類脂、卟啉和含氮色素等。第三節(jié)蛋白質(zhì)的定量測定！??！第九頁，共五十一頁，2022年，8月28日一、 凱氏定氮法

由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。改良：氮的完全氨化，縮短時間，簡化操作。主要改良催化劑及消化蒸餾裝置。第十頁，共五十一頁，2022年，8月28日

（一）常量凱氏定氮法

原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。①用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl滴定或H2SO4溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計算出蛋白質(zhì)的含量。②也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過量的酸。為什么？第十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日催化劑煮沸1、消化：NCOC+濃H2SO4（NH4）2SO4+CO2+SO2+H2O

2、蒸餾與吸收：2NaOH+（NH4）2SO42NH3↑+Na2SO4+2H2O

2NH3+4H3BO3

（NH4）2B4O7+5H2O3、滴定：（NH4）2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3(注:NCOC,Nitrogencontainingorganiccompounds)凱氏定氮法原理（方程式）整個過程分三步：消化、蒸餾與吸收、滴定第十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日1.消化<1>加硫酸鉀作為增溫劑，提高溶液沸點，純硫酸沸點340℃，加入硫酸鉀之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點，但效果不如硫酸鉀。要防止暴沸第十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日<2>加硫酸銅作為催化劑。還可以作消化終點指示劑、蒸餾時堿性指示劑。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒粉、二氧化鈦。<3>加氧化劑如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機物氧化速度。第十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日凱氏定氮法注意事項圖：常量凱氏定氮消化及蒸餾裝置

a．消化裝置b．蒸餾吸收裝置1、硫酸鉀及硫酸銅的作用2、火候控制3、裝置的氣密性4、何時加堿5、難消化的對策6、停止蒸餾第十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日自動回流消化蒸餾儀第十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日2.蒸餾與吸收

消化液+40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣?！耙阅问显噭睓z查。同時用4%硼酸吸收〔Nessler試劑，K2（HgI4）〕檢驗NH4+離子，析出黃色或紅棕色沉淀。第十七頁，共五十一頁，2022年，8月28日3.滴定用HCl滴定用混合指示劑（甲基紅+溴甲酚綠或亞甲基蘭+甲基紅）終點：藍色→微紅色計算：F要根據(jù)樣品來源定

3學(xué)時第十八頁，共五十一頁，2022年，8月28日說明及注意：①本法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定（粗蛋白質(zhì)）。結(jié)果準(zhǔn)確，但費時。②所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。③同時作一空白試驗，從消化開始到滴定。④消化時不要用強火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。第十九頁，共五十一頁，2022年，8月28日

⑤

消化時應(yīng)注意不時轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，并促進其消化完全。

⑥樣品中若含脂肪或糖較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應(yīng)用小火加熱，并時時搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強度。⑦當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過氧化氫2—3m1后再繼續(xù)加熱消化。第二十頁，共五十一頁，2022年，8月28日⑧—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸等時，需適當(dāng)延長消化時間（如大豆粉）。有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。⑨蒸餾裝置不能漏氣。蒸餾時，加熱火力要穩(wěn)定，否則將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。(NH4)2SO4檢驗第二十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日⑩蒸餾前加NaOH要足量，溶液應(yīng)變?yōu)樯钏{色或黑褐色↓（Cu（OH）2、CuO、銅氨離子），如顏色不變可能堿不夠

。⑾蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源．否則可能造成吸收液倒吸。⑿H3BO3吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃，否則對NH3的吸收作用減弱而造成損失。

第二十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）微量凱氏定氮法1、原理、步驟及適用范圍同前2、與常量法不同點：樣品量、試劑用量減少加入硼酸量由50ml10ml,滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。3、蒸餾裝置見下圖。第二十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日保持酸性第二十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日第二十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日改良式微量凱氏定氮裝置

第二十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日

（三）自動凱氏定氮法

1、原理及適用范圍同前

2、特點：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗洠?2分鐘完成1個樣。第二十七頁，共五十一頁，2022年，8月28日如何測定蛋白氮？先把非蛋白質(zhì)的含氮物與蛋白質(zhì)分開。一般多采用沉淀劑（CuSO4+NaOH，或三氯乙酸

），將蛋白質(zhì)沉淀析出，經(jīng)過過濾（或離心分離），將沉淀物再用凱氏法測定含N量。

馬鈴薯含非蛋白氮多。乳中非蛋白氮的測定？

第二十八頁，共五十一頁，2022年，8月28日二、雙縮脲法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費時間，有環(huán)境污染。快速方法：雙縮脲法紫外分光光度法染料結(jié)合法水楊酸比色法紅外光譜法考馬斯亮藍染料比色法……

樣品消化轉(zhuǎn)化為銨鹽后，在一定條件下與水楊酸鈉和次氯酸鈉生成藍色化合物，660nm比色。

在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合染色，620nm吸收。快、靈敏，干擾較少。第二十九頁，共五十一頁，2022年，8月28日1.原理脲（尿素）NH2—CO—NH2

加熱至150~160℃時，兩分子縮合成雙縮脲。

雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫紅色絡(luò)合物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵—CO—NH—，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計來測其吸光度，確定含量。（560nm）NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2第三十頁，共五十一頁，2022年，8月28日配合物：雙縮脲銅鈉氫氧化物第三十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日

注：測蛋白質(zhì)時叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化

可直接用粉樣，振蕩、顯色后離心。

2. 方法特點及應(yīng)用范圍本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中常用。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。

3.主要儀器：分光光度計，離心機

4.試劑：

(1)堿性硫酸銅溶液

(2)四氯化碳第三十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日5．操作方法：采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。三．紫外吸收法1．原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團，│R（—NH—CH—CO）

對紫外光有吸收作用，在280nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量。第三十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日2．適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因為干擾因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3．主要儀器：①紫外分光光度計②離心機（3000～5000r/min）4．操作：用凱氏法測得結(jié)果的同類樣品作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線。測牛乳

冰醋酸第三十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日第五節(jié)氨基酸的定性測定（自學(xué)）利用各種顯色反應(yīng)（134～138頁）第三十五頁，共五十一頁，2022年，8月28日一、氨基酸的一般顯色反應(yīng)茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二甲醛法。前二種是經(jīng)典的常用顯色法，后一種是近年來發(fā)展起來的熒光顯色法。1.茚三酮法氨基酸或蛋白質(zhì)能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物。2.吲哚醌法各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可借此辯認氨基酸。3.鄰苯二甲醛法（最靈敏）鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為340nm和455nm。在手提式紫外燈(254/365)下觀察。

各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強度不同。第三十六頁，共五十一頁，2022年，8月28日二、個別氨基酸的顯色反應(yīng)利用個別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應(yīng)定性氨基酸。可應(yīng)用于紙層析和紙電泳顯色。

精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和羥賴氨酸、羥脯氨酸,色氨酸、酪氨酸、酪氨酸和組氨酸。第三十七頁，共五十一頁，2022年，8月28日第六節(jié)氨基酸定量測定

一．氨基酸的一般定量測定

（一）甲醛滴定法

1.原理：氨基酸本身有堿性—NH2—基，又有酸性—COOH基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與—NH2—結(jié)合，堿性消失，再用強堿來滴定—COOH基。（有多種寫法）

第三十八頁，共五十一頁，2022年，8月28日2、測定適量樣品于100ml容量瓶中（含氨基酸約20mg）→水定容→取20.0ml于燒杯中，加60ml水→用0.05mol/LNaOH滴至pH8.2（此體積可供計算總酸含量）→加10.0ml中性甲醛→NaOH滴至pH9.2，記錄消耗體積V1。空白試驗：80ml水→NaOH調(diào)至pH8.2→加10.0ml中性甲醛→NaOH滴至pH9.2，耗V0ml。用酸度計電極的選擇？第三十九頁，共五十一頁，2022年，8月28日3、說明①本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定。②固樣先粉碎，稱量后用水萃取約半小時（50℃水?。＂垆@鹽的存在使結(jié)果偏高，因其也與甲醛作用產(chǎn)生酸。④也可用指示劑指示終點（中性紅、百里酚酞），但準(zhǔn)確度稍差，對深色樣品要用活性炭脫色，但芳香族氨基酸易被吸附。第四十頁，共五十一頁，2022年，8月28日同時取兩份樣：①+中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和樣液中其它酸性物質(zhì)。pH6.8～8.0②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴，中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總和。pH9.4～10.6(淡藍色)

二者之差可計算氨基酸含量。第四十一頁，共五十一頁，2022年，8月28日（二）茚三酮比色法1、原理：氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（脯氨酸反應(yīng)成黃色），可用吸光光度法測定，λ=570nm。2、測定：樣品→水提取氨基酸，活性炭脫色（Δ），過濾→分取澄清液于25ml比色管中→加茚三酮，pH8.04磷酸鹽緩沖液→水浴加熱15min→迅速冷卻，水定容→靜置15min→測A570，空白為參比。同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線，氨基酸標(biāo)液用某一干燥的氨基酸如異亮氨酸配制。3、結(jié)果：氨基酸含量（mg/100g）以所用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸計第四十二頁，共五十一頁，2022年，8月28日二．個別氨基酸的定量測定介紹了8種氨基酸的定量測定方法見P147～155第四十三頁，共五十一頁，2022年，8月28日第七節(jié)氨基酸的分離與測定

一．薄層色譜法（TLC法）ThinLayerChromatography簡介：

一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達到分離、鑒定和定量的目的。因為層析在薄層上進行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。第四十四頁，共五十一頁，2022年，8月28日（一）原理：

取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種氨基酸可達到彼此分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進行對比，鑒別氨基酸種類，從顯色斑點顏色的深淺可以大致確定其含量。

第