微孔板檢測技術的原理和應用

微孔板檢測技術的原理和應用第一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日原理及應用介紹大綱光的物理簡介光吸收檢測的原理與應用實例熒光檢測的原理與應用實例發(fā)光檢測的原理與應用實例第二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日光的物理簡介光的本質光的性質第三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日光的本質一種能量電磁波電子能級（軌道）波粒二相性衍射光電效應紅外線第四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日光的性質基本性質速度：3×108m/s波長：顏色頻率：能量E=hν其他性質偏振熒光：激發(fā)c=λ×ν第五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日光的性質物體的顏色白光是復合光單色光互補色光溶液的顏色由溶液中的質點（分子，離子）吸收特定波長的光，透射其互補色的光吸收曲線KMnO4溶液的吸收曲線(cKMnO4:a<b<c<d)第六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日原理及應用介紹大綱光的物理簡介光吸收檢測的原理與應用實例熒光檢測的原理與應用實例發(fā)光檢測的原理與應用實例第七頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日光吸收檢測的原理當光穿過待測物時，光的強度（能量）發(fā)生變化bcIIAbsorbance××lg0e==

（公式反應了與濃度的依賴關系） I0

入射光強度 I 透射光強度

摩爾消光系數(shù)

b 光程 c 樣品濃度II0第八頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日吸光值(Absorbance)的意義Absorbance(OpticalDensity):%ofLightTransmitted:%ofLightAbsorbed:0OD100%0%1OD2OD3OD4OD5OD6OD7OD8OD

1%0.1%0.01%0.001%0.0001%0.00001%0.000001%90%99%99.9%99.99%99.999%99.9999%99.99999%99.999999%10%第九頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日影響結果的因素單色光不純非平行入射光介質不均勻溶液濃度過高溶液中發(fā)生化學反應第十頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日光吸收的應用如果光的強度變化能夠反映被測量物的待測性質，則顯色反應都可以使用光吸收核酸和蛋白質的紫外光吸收檢測酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）酶動力學分析細菌內(nèi)毒素檢測乙酰膽堿脂酶檢測細胞活性檢測（MTT）環(huán)境監(jiān)測第十一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日核酸的紫外光吸收檢測DNA，RNA的吸收峰在260nm標準曲線法光程測量法（光程未知【酶標板】）校正吸收值到1cm光程通過水（如果溶劑是水）的1cm光程吸收值來校正第十二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日標準曲線法作光吸收最常用的方法已知濃度樣品吸收值（同一光程【比色杯】）標準曲線未知吸收值帶入，得到未知樣品濃度第十三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日光程測量法光程不一致時（酶標板）通過水的吸收值（1cm光程）來求得實際光程水在977nm有吸收峰，在900nm幾乎無吸收（與溶質的吸收峰無重疊）Pathlength：實際的光程A977：水溶液樣品在977nm的吸光值A900：水溶液樣品本底Awatercm-1：1cm光程比色杯中水的吸光度值（A977）－本底值（A900）第十四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日光程測量法水相樣品的吸收值/cm光程：光程的校正水：998nm等消光點（受溫度影響?。?77nm吸收峰Asample：樣品在特定波長的吸光值

第十五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日實例：DNA濃度的測量水的吸光度/cm

Result: Awater:A998–A900:0.159OD/cm樣品的吸光度 A998–A900:0.132OD

A260:0.084OD第十六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日實例：DNA濃度的測量光程的校正DNA的分光光度計標準，1OD/cm

相當于50ng/ulDNA相當于40ng/ulRNA相當于33ng/ulOligo結果計算：0.101×50ng/ul=5.05ng/ul第十七頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日實例：蛋白定量CoomassieBrilliantBlueG-250加入蛋白質酸性環(huán)境下呈茶色與蛋白質結合變藍色

CBG是一種指示劑470nm595nm第十八頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日實例：ELISA抗原，抗體，底物，顯色反應陰性域值，陽性程度，定量第十九頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日實例：細胞活性檢測（MTT）細胞代謝活動與活細胞數(shù)直接成比例（線粒體的活性脫氫酶的活性）MTT：一種甲氮唑鹽，是細胞線粒體脫氫酶的底物；活細胞內(nèi)的線粒體脫氫酶可將MTT分解產(chǎn)生藍黑色（fromazan）產(chǎn)物進入活細胞，被分解，裂解細胞，分析吸光度Fromazan吸光譜第二十頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日實例：細胞活性檢測（MTT）第二十一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日實例：內(nèi)毒素檢測（LPS）LPS：存在于革蘭陰性(G－)細菌細胞壁外層，脂多糖，為細菌類屬的共同抗原，介導多種生物效應?？勺鳛槎喾N與G－細菌相關疾病的診斷和預后指標方法：鱟血細胞基質染色試驗原理：LPS作用于鱟血細胞溶解物中的凝固酶原使之成為凝固酶。凝固酶水解人工底物顯色。（檢測波長：405nm）第二十二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日實例：乙酰膽堿脂酶檢測乙酰膽堿酯酶（AChE）：可作為反映胎兒神經(jīng)系統(tǒng)成熟度的指標。方法：乙酰膽堿酯酶水解乙酰膽堿生成膽堿及乙酸，膽堿可以與巰基顯色劑反應生成TNB黃色化合物。（檢測波長：450nm）第二十三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日光吸收的優(yōu)勢和缺點優(yōu)勢技術成熟設備和試劑成本低操作簡單第二十四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日光吸收的優(yōu)勢和缺點缺點動態(tài)范圍窄靈敏度低（核酸到ng級）特異性不強受溶液的濃度和粘稠度影響細胞學實驗中采用的吸收底物往往有細胞毒性相互作用檢測很難實現(xiàn)實時檢測無法做多標記檢測第二十五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日原理及應用介紹大綱光的物理簡介光吸收檢測的原理與應用實例熒光檢測的原理與應用實例發(fā)光檢測的原理與應用實例第二十六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光原理熒光：某些物質吸收特定波長的光能量（能量高），從基態(tài)(S0)成為激發(fā)態(tài)(S1)；被激發(fā)的分子通過內(nèi)部轉化失去能量并回到基態(tài)；同時發(fā)出波長更長的光（能量低）第二十七頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光原理Excitationinfemtoseconds(10E-15seconds)Internalinpicoseconds(10E-12seconds).Emissionintherelativelylongtimeperiodofnanoseconds(10E-9seconds)Tremendouslysensitiveemissionprofiles,spatialresolution,andhighspecificityoffluorescenceinvestigations,thetechniqueisrapidlybecominganimportanttoolingeneticsandcellbiology.第二十八頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光的優(yōu)勢靈敏度高——可以低到單個分子對環(huán)境敏感細胞毒性較小，可以進行活細胞或活體檢測實時檢測多標記檢測（如藍色細胞核，紅色線粒體等等）檢測模式多樣，具有多種類型的熒光探針和熒光染料兼容性強——可以兼容多種儀器平臺和多種樣本形式使用方便，高效安全，無輻射第二十九頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日以熒光為基礎的檢測技術熒光強度(FI)時間分辨熒光(TRF)熒光偏振(FP)熒光共振能量轉移(FRET)均相時間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)熒光壽命(FLT)第三十頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光強度（FI）DNA、RNA的熒光定量熒光ELISA酶動力學分析藥物代謝（CYP450）氧化酶的呼吸爆發(fā)細胞凋亡研究細胞基礎實驗（細胞吸附、細胞滲透、細胞遷移、細胞增殖、細胞毒理研究等）鈣流檢測報告基因檢測（GFP）第三十一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日DNA的熒光定量Figure2λ-DNAmeasuredwithPicoGreen（485/535nm）Figure1λ-DNAmeasuredwithabsorbanceat260nm靈敏度比較：260nm光吸收：50－250ng/mlPicoGreenFluorescence：300pg/ml第三十二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日細胞貼壁研究細胞的貼壁性反映了細胞的狀態(tài)，類型傳統(tǒng)方法：細胞計數(shù)，繁瑣不準確熒光強度方法熒光標記細胞微孔板孵育洗去未粘附細胞檢測板底熒光強度第三十三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日死細胞數(shù)目檢測藥物的毒性；外界刺激細胞受損死亡細胞的膜破裂PI（PropidiumIodide），一種膜不滲透性DNA熒光染料PI的熒光強度反映了死細胞數(shù)目PIPIPIPIPIPIPIPIPIPIPIPIPI活細胞

死細胞或受損細胞第三十四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日細胞凋亡分析某些細胞凋亡的信號通路包括Caspase3的酶活性提高模擬Caspase3底物Z-DEVD-R110NonfluorescentCaspase3Caspase3Rhodamine110FluorescentCaspase在細胞凋亡中起著中心作用第三十五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日酶活性分析藥物代謝酶活性分析細胞色素P450酶家族成員負責大約20％普通藥物代謝P450酶活性的調(diào)節(jié)P450的抑制物的篩選第三十六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日酶活性分析底物構造熒光染料＋封閉基團＝不發(fā)熒光加入酶促反應之后，底物被切開，熒光染料與封閉基團分離加入候選藥物分子，可篩選作用于藥物代謝通路的調(diào)解物e.g.CYP3A4DrugcandidatesX第三十七頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日酶活性分析加入不同濃度的底物的CYP的反應曲線CYP抑制劑篩選第三十八頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日紫外熒光利用蛋白內(nèi)部發(fā)色團（Tryptophan、Tyrosine、Phenylalanine）作為熒光指示劑（紫外激發(fā)），可分別對蛋白結構,構象,亞基組裝，酶與底物結合，蛋白結構的共效應因子進行研究。發(fā)色團的暴露或掩藏還可以研究一些電子傳遞鏈的耦連劑NADHFADB族維生素，維生素A，E檢測第三十九頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日紫外熒光－蛋白質的折疊/變性RNaseA的熱變性曲線第四十頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光強度應用的不足部分熒光素激發(fā)峰與發(fā)射峰往往相隔很近，干擾檢測發(fā)射光產(chǎn)生極快，且持續(xù)時間短，容易與激發(fā)光重疊，干擾檢測第四十一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日時間分辨熒光（TRF）以鑭系元素(稀土離子：銪、釤、鏑、鋱）為標記發(fā)射功率低，螯合Europiumion第四十二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日時間分辨熒光（TRF）激發(fā)波長與發(fā)射波長差距大（>200nm）光譜窄發(fā)光時間長ElapsedTimeIntensity

ExcitationAutoFluorescenceFluoresceinEmission

EuropiumEmission較長延遲時間------Measurement------Eu:激發(fā)波長320nm，發(fā)射波長612/620nm第四十三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日時間分辨熒光（TRF）和普通熒光相比，排除了背景光干擾所有普通熒光強度（FI）檢測，如干擾影響極大，無法排除，均可采用時間分辨熒光標記來解決第四十四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日以熒光為基礎的檢測技術熒光強度(FI)時間分辨熒光(TRF)熒光偏振(FP)熒光共振能量轉移(FRET)均相時間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)熒光壽命(FLT)第四十五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日用FI的方法檢測分子間結合缺點：1、步驟繁瑣，需要洗滌2、且每次洗滌強度很難一致，造成結果有差異，重復性差。優(yōu)點：1、步驟簡單，無需洗滌2、試驗均一性，重復性好非均相試驗孵育(結合)洗滌（去除非結合）

檢測均相試驗孵育(結合)檢測第四十六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光偏振（FP）的原理光的偏振性PolarizerAnalyzerAnalyzerPolarizer第四十七頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光偏振（FP）的原理如果熒光基團在處于激發(fā)態(tài)的時間內(nèi)（如Fluorescein為4ns)保持靜止，那么它發(fā)射出的熒光也是與激發(fā)光是同平面的polarizedexcitation100%0%stationaryfluorophore第四十八頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光偏振（FP）的原理如果熒光基團在處于激發(fā)態(tài)的時間內(nèi)是運動狀態(tài)，那么它發(fā)射出的熒光會發(fā)生偏振平面的改變polarizedexcitation<100%>0%fluorophoreinmotion第四十九頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光偏振（FP）的原理熒光偏振改變反映了分子的運動狀態(tài)，也可以說反映了分子所處的環(huán)境的狀態(tài)分子運動快，偏振方向改變大分子運動慢，偏振方向改變小熒光偏振：分子運動越快，P值越小分子運動越慢，P值越大第五十頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光偏振（FP）的原理分子體積與運動速度的關系體積越大，運動速度越慢體積越小，運動速度越快分子所處環(huán)境與運動速度的關系溶液的粘稠度利用熒光偏振的特性可以研究相互作用分子結合，體積改變，運動速度變化，P值相應發(fā)生變化溶液狀態(tài)變化，溶液的粘稠度改變，其中的分子運動速度變化，P值相應發(fā)生變化第五十一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光偏振（FP）研究分子相互作用原則熒光基團標記在小分子上，偏振值低當小分子與較大的分子結合后體積增加，偏振值增加偏振值的大小反映了兩個分子之間的結合效率與結合數(shù)量第五十二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光偏振（FP）研究分子相互作用配體受體結合

蛋白質與蛋白質結合抗原抗體結合蛋白質與DNA的相互作用

DNA雜交酶活性檢測膜的流動性分析第五十三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日Estradiol與EstradiolReceptorER：能和小分子疏水配體結合的核受體超家族成員，穿梭于胞漿和胞核內(nèi)，具有轉錄因子的作用（DNA結合），包括ERα、ERβ兩種亞型Estradiol（雌激素）：與ER結合，引起其入核，調(diào)節(jié)基因轉錄Estradiol類似物第五十四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日ER-β競爭性結合物的篩選雌激素受體ER-β競爭性結合物可作為候選的藥物成分具體步驟熒光標記的雌激素ES2與ER-β結合，復合物較大，P值較大加入競爭物之后，則能夠將ES2替換下來，單獨的ES2體積小，P值減小P值的減小程度與競爭物的濃度的關系反映了競爭物的競爭性第五十五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日ER-β競爭性結合物的篩選第五十六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日Estradiol-ER與DNA結合ER核受體，Estradiol與DNA結合，調(diào)節(jié)基因轉錄傳統(tǒng)方法EMSA放射性，繁瑣第五十七頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日Estradiol-ER與DNA結合熒光偏振方法親和層析純化ERFAM標記的DNA結合序列偏振分析第五十八頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日激酶活性分析競爭性免疫分析檢測激酶活性被激酶磷酸化的產(chǎn)物與熒光標記的磷酸化示蹤物競爭磷酸化抗體熒光標記的磷酸化示蹤物與抗體結合后熒光偏振值增加激酶活性決定了磷酸化產(chǎn)物比例，熒光偏振值增加的程度與激酶活性成反比例抑制物對激酶活性的影響第五十九頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日激酶活性分析第六十頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日蛋白酶活性分析蛋白酶將大分子的蛋白切割成小的片斷，熒光偏振值變小研究蛋白酶的動力學參數(shù)peptidefragmentsProteaseProtein第六十一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日偏振中數(shù)據(jù)處理問題G值儀器分別測量與激發(fā)光偏振平面平行和垂直的偏振光時，使用相同但是不是同一個光學元件校準，使用已知偏振值的熒光物質及其相應的緩沖液計算G值。P實際＝G×P測量G＝((RFU－BUF)×(1＋Pref))/((RFU－BUF)×(1＋Pref))第六十二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日偏振中數(shù)據(jù)處理問題只有當被測樣品的信號變化比對照組（正μC+、負μC-）有足夠的標準偏差，結果才有意義。第六十三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日偏振中數(shù)據(jù)處理問題第六十四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光偏振優(yōu)勢均相(無分離/洗滌）在溶液中進行，沒有固相的參與，因此反應速度較快，操作也相應簡單測量的是比值，結果與熒光基團的絕對濃度/強度無關無破壞性(可重復測量)無放射性可實現(xiàn)高通量第六十五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光偏振缺點FP使用具有較短壽命的熒光素（如Fluorescein,TAMRA)，它被限定為：熒光標記的小的配體（如抗原）和大的受體（如抗體）的結合。檢測依賴于分子結合造成的分子體積的顯著改變。第六十六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日以熒光為基礎的檢測技術熒光強度(FI)時間分辨熒光(TRF)熒光偏振(FP)熒光共振能量轉移(FRET)均相時間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)熒光壽命(FLT)第六十七頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光共振能量轉移（FRET）FRET：一對合適的熒光物質，前者的發(fā)射波長正好是后者的激發(fā)波長，當二者達到一定的分子距離時（1～9nm），供體發(fā)出的光子能量會傳遞給受體分子，受體被激發(fā)，發(fā)射熒光供受體的激發(fā)光譜要分得足夠開供體的發(fā)射光譜要與受體的激發(fā)光譜重疊供受體的發(fā)射光譜要分得足夠開第六十八頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光共振能量轉移（FRET）熒光能量傳遞的效率與分子間的作用距離相關因此能量傳遞的發(fā)生及強度可以作為分子間發(fā)生相互作用以及相互作用強弱的指示特征第六十九頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日FRET的應用分子間相互作用藥篩模型蛋白質與核酸的結構和構象研究/蛋白質復合物的分配與組裝測量DNA寡聚體的結合（溶液中DNA雜交的動力學測量）膜融合研究分子內(nèi)和分子間的距離測量標記的大分子上特定位點的距離測定供體和受體的距離，受體/配基相互作用第七十頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日激酶反應檢測FRET熒光素對標記底物分子位點特異性的酶不能切開被激酶磷酸化的底物，保持FRET；磷酸化的底物失去FRET測量Donor的發(fā)射光（445nm）和Acceptor的發(fā)射光（520nm），計算比值445/520。比值越大，激酶活性越強第七十一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日FRET的優(yōu)勢均相檢測(無分離和洗滌步驟)在溶液中進行，沒有固相的參與，因此反應速度較快，操作也相應簡單可以很好地觀察活細胞內(nèi)酶活性變化，并且能做到定時、定量、定位，是一種非常有效的研究手段無放射性第七十二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日FRET的缺點供體與受體的距離限定為10-80?，而許多生物結構（如蛋白-DNA復合物，大的蛋白，膜等）為80-130?信噪比經(jīng)常不佳，通常為1：1；背景噪聲來自供體熒光干擾及受體被直接激發(fā)供體與受體濃度的比率很關鍵必須有兩種熒光標記第七十三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日以熒光為基礎的檢測技術熒光強度(FI)時間分辨熒光(TRF)熒光偏振(FP)熒光共振能量轉移(FRET)均相時間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)熒光壽命(FLT)第七十四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日均相時間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)結合TRF與FRET，選擇發(fā)光時間長的稀土元素作為Donor，使得Acceptor的發(fā)光時間更長選擇檢測時間，避開激發(fā)光和Acceptor直接被激發(fā)的發(fā)光時間區(qū)域解決信噪比問題第七十五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日應用實例：cAMP濃度檢測cAMP重要的第二信使傳統(tǒng)的報告基因方法HTRF供體: 抗cAMP抗體用銪螯合物Eu(K)標記受體: cAMP用XL665(Allophycocyanin)標記樣品分子: 處理后的細胞裂解物cAMP與標記的cAMP競爭結合抗體計算受體發(fā)射光與供體發(fā)射光的比值，比值越大則細胞中cAMP的濃度越低第七十六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日應用實例：cAMP濃度檢測YenergytransferXL665EuExcitationat320nmEmissionat665nmlong-liveddecayat665nmTimeIntensitycAMP由于Eu元素的熒光壽命較長，當FRET效應存在時，會使得XL665也保持較長的能量衰減時間EnergyTransferfromEutoXL665第七十七頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日應用實例：cAMP濃度檢測cAMPExcitationat320nmEmissionat665nmshort-livedsignalat665nm,discriminatedbytimingparametersTimeIntensityXL665如果不存在FRET效應，激發(fā)光直接激發(fā)APC，APC所發(fā)出的是一個短壽命的熒光NoEnergyTransfer第七十八頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日應用實例：cAMP濃度檢測YEuExcitationat320nmEmissionat612/620nmlong-livedsignalat612/

620nm,discriminatedbywavelengthTimeIntensityNoEnergyTransfer對于部分沒有結合的Eu標記的抗體分子，同樣會被激發(fā)出長壽命的熒光第七十九頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日均相時間分辨熒光的優(yōu)勢鑭系元素標記，能量傳遞效率更高，放大了所能檢測到的作用距離范圍(100-200?)，提高了檢測的靈敏度及應用范圍時間分辨的檢測方法，可極大地降低背景熒光的干擾，提高信噪比均相，操作簡單快速，僅需三個步驟:加樣，孵育，測量采用比率計算，更為準確，降低了系統(tǒng)誤差第八十頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日以熒光為基礎的檢測技術熒光強度(FI)時間分辨熒光(TRF)熒光偏振(FP)熒光共振能量轉移(FRET)均相時間分辨熒光(HTRF)/(TR-FRET)熒光壽命(FLT)第八十一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光壽命（FLT）熒光壽命τ：熒光分子在回到基態(tài)之前之前維持激發(fā)態(tài)的平均時間一般在ns范圍內(nèi)熒光壽命受到許多條件的影響，可作為一種分子狀態(tài)（環(huán)境）改變的標志檢測速度是其他方法的幾百萬倍對分子進行動態(tài)監(jiān)測，時間顯微技術第八十二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光壽命（FLT）I(t)=I0e(-t/t)

熒光壽命：當熒光強度衰減到最高值的1/e時（一般是37%)所經(jīng)過的時間外界環(huán)境和分子自身的狀態(tài)變化影響熒光壽命τ=1/(krad+knonrad)第八十三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日使用FLT篩選藥物快速，高通量篩選人類α凝血酶抑制子已知aptamer是一種有效的抑制因子用IRIS-5標記aptamer，與α凝血酶結合或分離表現(xiàn)不同的熒光壽命代篩選的物質與aptamer競爭α凝血酶導致aptamer的分離改變熒光壽命第八十四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日使用FLT篩選藥物篩選窗口FP驗證第八十五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光技術總結FI，TRF相對而言是一項異相操作技術，相比均相檢測技術較為煩瑣，但應用范圍更廣，操作靈活FP、FRET、HTRF均是均相分子檢測技術，擯棄了異相操作的煩瑣步驟、洗滌條件的嚴格控制、結果的不均一化等條件的限制FP技術整體操作簡單易行，所耗試劑成本較低，而且可以進行動力學計算，但容易受一些外界因素影響（背景干擾，溶液離子環(huán)境）、檢測范圍相比而言較窄（分子量的限制）FRET技術相比FP而言可進行活體檢測，是一項動態(tài)分析檢測技術，可以計算分子間相互作用的平衡常數(shù)以及反應速率。但試劑成本較高，而且容易受直接激發(fā)干擾，分子間的檢測距離也往往受到一定的限制。第八十六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日熒光技術總結HTRF技術能解決分子間檢測距離的限制，也基本不受溶液離子環(huán)境，溫度、背景熒光，激發(fā)光等的干擾，且能排除加樣體積等的影響HTRF采用的是比率計算，從而消除了分子濃度不均一等造成的系統(tǒng)誤差。因此相比而言，HTRF是一項信噪比絕佳的熒光分析技術。而且HTRF還是一項動態(tài)分析檢測技術FLT是一項新技術，以其檢測敏感，時間短和高通量為優(yōu)勢，但是對儀器配置要求很高第八十七頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日原理及應用介紹大綱光的物理簡介光吸收檢測的原理與應用實例熒光檢測的原理與應用實例發(fā)光檢測的原理與應用實例第八十八頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日發(fā)光原理發(fā)光：與熒光類似，同樣是由于電子的躍遷產(chǎn)生的，但促成電子的躍遷的能量不是由光源直接激發(fā)造成的，而是來源于反應中產(chǎn)生的能量化學發(fā)光是能量來自于化學反應引起的發(fā)光生物發(fā)光是能量來自于酶促催化下的生化反應引起的發(fā)光分類連續(xù)發(fā)光型（輝光型）：發(fā)光長效持久，無需自動加樣器。(eg.Alkalinephosphatase)瞬時發(fā)光型（閃光型）：發(fā)光時間短，變化快，需使用自動加樣器。(eg.Aequorin)第八十九頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日發(fā)光原理Intensitytime20minutes1.5-2hoursFlashlumiassay:PicaGene–singlecolorGlowlumiassay:PicaGeneLT(longlifetime)第九十頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日發(fā)光的應用領域報告基因檢測化學發(fā)光免疫分析核酸定量(PCRQuantification)酶活分析活性氧分析BRET分析第九十一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日報告基因檢測評價啟動子調(diào)控效率和其中作用元件的有效方法雙報告系統(tǒng)同時向細胞中轉入兩種報告基因其中一種為待研究的啟動子控制（熒火蟲熒光素酶），另一種為不被處理所影響的啟動子控制（海腎熒光素酶）作為內(nèi)參消除系統(tǒng)誤差第九十二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日報告基因檢測Transfectcells分別將兩個載體中的SV40啟動子替換成一個目標啟動子和一個內(nèi)參啟動子分別測量兩個報告系統(tǒng)中l(wèi)uciferase表達量將結果用內(nèi)參均一化（比值）第九十三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日報告基因檢測得出報告基因活性在不同條件下的相對值第九十四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日報告基因檢測的優(yōu)勢減小隨機誤差比率計算避免了系統(tǒng)誤差超高的靈敏度（極低的背景干擾）動力學范圍更廣發(fā)光強度在4～6個數(shù)量級之間與測定物質濃度間呈線性關系無需昂貴的設備投入手段更為靈活第九十五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日生物發(fā)光共振能量傳遞（BRET）研究分子間相互作用EnergytransferfrombioluminescentDonor

fluorescentAcceoptorDonor=Renillaluciferase(Rluc)Acceptor=GreenFluorescentProtein(GFP2)第九十六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日生物發(fā)光共振能量傳遞（BRET） 加入底物DeepBlueCTM，Rluc發(fā)射藍光(390-400nm)，當A蛋白和B蛋白結合，生物共振能量傳遞發(fā)生，GFP發(fā)射綠光(505-508nm)RlucDeepBlueC?GFP2ProteinAProteinBDeepBlueC?RlucGFP2BRET2第九十七頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日BRET的應用領域蛋白組學監(jiān)測蛋白-蛋白相互作用檢測胞內(nèi)細胞器間的相互作用在哺乳動物細胞中對酵母雙雜交結果的驗證受體研究細胞信號傳導通路研究第九十八頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日BRET的優(yōu)勢與缺點優(yōu)勢避免了光漂白信號穩(wěn)定：可維持1小時分析方法靈活缺點步驟繁瑣，難度高在細胞中要同時表達兩種蛋白融合蛋白第九十九頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日總結第一百頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日各種技術的影響因素第一百零一頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日GeniosPro檢測模式及儀器特點主要競爭產(chǎn)品分析第一百零二頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日GeniosPro之檢測模式及儀器特點檢測模式應有盡有－堪稱全能戰(zhàn)士：光吸收（230－1000nm）熒光強度（230－900nm）熒光偏振(275–750nm)時間分辨熒光均相時間分辨熒光底部閱讀熒光共振能量轉移FRET化學發(fā)光：連續(xù)和瞬時化學發(fā)光共振能量轉移BRET雙報告系統(tǒng)：Chroma-Glo

第一百零三頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日GeniosPro之檢測模式及儀器特點儀器設計獨到巧妙－－堪稱濾光片系統(tǒng)的精致之作每一個細節(jié)都體現(xiàn)著精致：光源：高能閃爍氙燈——檢測范圍更廣，從紫外區(qū)到遠紅外區(qū)使用壽命更長（可閃爍1百萬次以上）無需預熱，工作狀態(tài)更穩(wěn)定適合瞬時檢測

第一百零四頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日GeniosPro之檢測模式及儀器特點每一個細節(jié)都體現(xiàn)著精致：光路：

發(fā)光、頂部和底部閱讀各自采用獨立的光路系統(tǒng)，避免了相互干擾無光纖，內(nèi)置多個二分鏡，由二分鏡分光，最大限度的減少了光傳播途徑中的能量損失。

第一百零五頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日GeniosPro之檢測模式及儀器特點每一個細節(jié)都體現(xiàn)著精致：檢測器：光吸收、熒光和化學發(fā)光檢測分別由三個各自獨立優(yōu)化的檢測器完成：

光電二極管：檢測范圍廣，滿足4O.D以下的吸收光檢測

低暗電流PMT：具有大光敏面積，適用于各類熒光檢測

單光子計數(shù)PMT：用于化學發(fā)光及BRET的檢測，具有增益值高、暗電流小、噪聲低、時間分辨率高、量子效率高、紅光敏感等特點。

（其他產(chǎn)家產(chǎn)品多數(shù)只有兩個探測器，一個針對光吸收，一個針對熒光，兼顧較強的化學發(fā)光）

第一百零六頁，共一百一十七頁，2022年，8月28日GeniosPro之檢測模式及儀器特點每一個細節(jié)都體現(xiàn)著精致：濾光片——濾光片分組放入條形架中，可隨意插入，取出，既保護了濾光片