第七章食品檢驗的課件

第七章食品衛(wèi)生微生物學檢驗第一節(jié)細菌的生理生化反應

各種細菌具有不同的酶類，因此分解糖類、蛋白質及各種氨基酸的能力不同，所生成的代謝產物也不一樣。應用鑒別培養(yǎng)基,觀察其生化反應情況,是鑒別細菌的重要手段之一?，F將常用的生化反應試驗進行介紹。(一)糖類代謝試驗1．糖(醇)類發(fā)酵試驗各種細菌含有發(fā)酵不同糖(醇)類的酶，所以分解糖(醇)的能力各不相同。有的能分解某些糖(醇)類，有的則不能分解。有的分解某些糖(醇)類產酸、產氣，有的則僅產酸，而不產生氣體。根據這些特點,可鑒別細菌。2．V—P試驗(伏—普二氏試驗)某些細菌如產氣桿菌，分解葡萄糖產生丙酮酸，再將丙酮酸脫羧，變?yōu)橐阴＜谆状?，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境下，被空氣中的氧氣氧化為二乙酰，二乙酰與培養(yǎng)基內蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色的化合物。故在培養(yǎng)基中加入少量含胍基的化合物，如肌酸或肌酐等，可以加速這個反應。3．甲基紅(MR)試驗許多細菌如大腸桿菌等，分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸再被分解，產生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降至4.5以下，這時加入甲基紅指示劑呈紅色。(甲基紅指示劑變色范圍為pH4.4(紅色)一pH6.2(黃色))。若細菌分解葡萄糖產酸量少，或產生的酸進一步轉化為其他物質(如醇、酮、醛、氣體和水等)，則培養(yǎng)的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色是為陰性。4．

β—半乳糖苷酶試驗(ONPG)具有半乳糖苷酶的細菌，能水解鄰硝基酚—β—D半乳糖苷，而釋放出黃色的鄰硝基酚，用以鑒別腸桿菌，如遲緩發(fā)酵乳糖的腸桿菌，為陽性反應。

5．七葉苷分解試驗能分解七葉苷的細菌，其代謝產物與鐵離子結合后，產生黑色沉淀，使培養(yǎng)基變黑。6．石蕊牛乳試驗牛乳中含大量的乳糖和酪蛋白，營養(yǎng)豐富，一般細菌均能在其中生長。但各種細菌對這些物質的分解能力不一樣。故可觀察下列不同的反應。(1)產酸若發(fā)酵乳糖產酸，使石蕊指示劑變?yōu)榉奂t色。(2)產氣若發(fā)酵乳糖同時產氣者，可沖開覆蓋在培養(yǎng)基上的凡士林。(3)凝固若發(fā)酵乳糖產酸甚多，可使酪蛋白凝固。(4)胨化若將凝固的酪蛋白繼續(xù)水解成蛋白胨，此時牛乳培養(yǎng)基的上段變清。

(5)產堿若不發(fā)酵乳糖，分解含氮物質，生成氨及胺，使培養(yǎng)基變堿性，石蕊指示劑為藍紫色。7．葡萄糖氧化—發(fā)酵試驗細菌對糖的代謝，分為有氧氧化和無氧氧化兩種類型。在有氧環(huán)境下氧化完全，生成二氧化碳和水。在無氧環(huán)境下，進行不完全的分解(發(fā)酵)，生成酸類、醇類和氣體。氧化型的細菌在無氧環(huán)境中，不能分解糖。發(fā)酵型的細菌不論在有氧或無氧的環(huán)境中，都可以分解糖。(二)有機酸鹽及銨鹽利用試驗1．枸櫞酸鹽利用試驗枸櫞酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中枸櫞酸鈉為碳的唯一來源，磷酸二氫銨為氮的唯一來源。有的細菌如產氣桿菌等，可利用枸櫞酸鹽作為碳源，能在此培養(yǎng)基上生長，并且分解枸櫞酸鹽而最后產生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變堿性。這樣培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由綠色變?yōu)樯钏{色，是為枸櫞酸鹽可利用試驗陽性。若細菌不能利用枸櫞酸鹽作為碳源，在此培養(yǎng)基上就不生長，培養(yǎng)基則不變色，是為枸櫞酸鹽利用試驗陰性。

2．縮蘋果酸鹽利用試驗縮蘋果酸鹽培養(yǎng)基，也是一種綜合性培養(yǎng)基?？s蘋果酸鈉為碳的唯一來源，硫酸銨為氮的唯一來源。有的細菌如亞利桑那桿菌，能利用培養(yǎng)基中的縮蘋果酸鹽作為碳源而生長，并使培養(yǎng)基呈堿性反應。此時培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑則由綠色變?yōu)樯钏{色，是為陽性。但有些細菌如大腸桿菌、沙門氏桿菌、志賀氏桿菌等，則不能利用縮蘋果酸鹽為碳源，故在此培養(yǎng)基上不生長。培養(yǎng)基顏色無變化，是為陰性。(三)蛋白質及氨基酸代謝試驗1．靛基質(吲哚)試驗某些細菌，如大腸桿菌、變形桿菌等，能分解培養(yǎng)基內蛋白胨中的色氨酸，產生靛基質(吲哚)，再與試劑對二甲基氨基苯甲醛作用后，形成紅色的化合物——玫瑰靛基質。2．硫化氫產生試驗某些細菌如變形桿菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，產生硫化氫，硫化氫遇到培養(yǎng)基中的重金屬鹽類如鉛鹽、鐵鹽等，則形成硫化鉛或硫化鐵黑色沉淀物。

3．尿素分解試驗某些細菌如變形桿菌，具有尿素酶，能分解培養(yǎng)基中的尿素而產生氨，使培養(yǎng)基呈堿性，培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈紅色。4．明膠液化試驗某些細菌具有膠原酶，分解明膠原，使明膠失去凝固能力，而呈液體狀態(tài)，是為陽性。5．苯丙氨酸脫氨酶試驗有的細菌如變形桿菌、普羅菲登桿菌，具有苯丙氨酸脫氨酶，可使苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基中的苯丙氨酸脫氨生成苯丙酮酸，苯丙酮酸與氯化鐵作用，形成綠色化合物。(四)呼吸酶類試驗1．氧化酶試驗某些細菌如奈瑟菌和綠膿桿菌，具有氧化酶(靛基酚氧化酶)，能將鹽酸二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺試劑氧化成紅色的醌類化合物。2．細胞色素氧化酶試驗某些細菌如綠膿桿菌，具有細胞色素氧化酶，在有分子氧存在的情況下，將試劑鹽酸二甲基對苯二胺氧化，并和a—萘酚結合生成吲哚酚蘭，而出現藍色。此試驗經常與氧化酶試驗同時進行。

3．氰化鉀抑制試驗有的細菌被一定濃度的氰化鉀所抑制而不生長，有的細菌則不被氰化鉀抑制仍能生長，以此試驗來鑒別細菌。4．觸酶試驗有些細菌如葡萄糖球菌等具有觸酶，能催化過氧化氫放出初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現氣泡。5．硝酸鹽還原試驗某些細菌如腸道桿菌，能還原培養(yǎng)基中的硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與試劑中的醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸再與對氨基苯磺酸和—萘胺結合生成顯色（紅色）的N——萘胺偶氮苯磺酸。(五)毒性酶類試驗1．溶血試驗某些細菌在代謝過程中，產生溶血素，使人或動物的紅細胞發(fā)生溶解，可借以鑒別細菌。2．鏈激酶試驗A組溶血性鏈球菌能產生鏈激酶，此酶能激活血液中的血漿素原使成血漿素，血漿素可溶解纖維蛋白，該試驗用以測定鏈球菌的致病性，有一定意義。3．卵磷脂酶試驗產氣莢膜桿菌能產生卵磷脂酶(即毒素)，此酶可分解血清或卵黃中的磷脂，使血清或卵黃發(fā)生混濁現象。但這些現象，可被產氣莢膜桿菌a抗毒素所阻止，故可用來鑒別產氣莢膜桿菌。

4．卵黃沉淀試驗此試驗測定產氣莢膜桿菌的卵磷脂酶(毒素)。因卵黃中含有可溶性磷脂蛋白復合物，經產氣莢膜桿菌的卵磷脂酶作用后，分解為磷脂類及蛋白質類的沉淀物。5．磷酸酶試驗金黃色葡萄球菌產生磷酸酶，因此在磷酸酚酞瓊脂平板上生長發(fā)育后分解磷酸酚酞，遇到濃氨水使菌落變紅色。6．DNA酶試驗有些革蘭氏陽性菌，如葡萄球菌、鏈球菌、芽孢桿菌等，產生細胞外脫氧核糖核酸酶，分解培養(yǎng)基中的脫氧核糖核酸，在菌落周圍出現清晰、透明環(huán)，尤其是凝固酶陽性的葡萄球菌，此試驗都呈陽性。

7．血漿凝固酶試驗測定葡萄球菌的致病性，通常以能否產生血漿凝固酶為準，產生者為致病菌株，不產生者為非致病菌株。但也有少數致病菌株，不產生血漿凝固酶。葡萄球菌產生的血漿凝固酶有兩種，一種是結合在細菌的細胞壁上，直接作用于血漿中的纖維蛋白，使細菌凝成塊狀，玻片法試驗的陽性結果是由此酶形成。另一種是在菌體內產生釋放到菌體外，稱為游離血漿凝固酶，它能使血漿中的凝血酶原變?yōu)槟割惍a物，呈現凝塊為陽性，試管法的陽性結果是由游離的血漿凝固酶形成。第二節(jié)一般檢驗方法一、菌落總數測定菌落總數是指食品檢樣經過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或lmL檢樣中所含細菌菌落的總數。菌落總數主要作為判定食品被污染程度的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據。每種細菌都有它一定的生理特性。培養(yǎng)時，應用不同的營養(yǎng)條件及其他生理條件(如溫度、培養(yǎng)時間、pH、需氧性質等)去滿足其要求，才能分別將各種細菌都培養(yǎng)出來。但在實際工作中，一般都只用一種常用的方法去作細菌菌落總數的測定，所得結果，只包括一群能在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫性需氧菌的菌落總數。1．設備和材料培養(yǎng)箱：(36±1)℃；冰箱：0～4℃；恒溫水浴：(46±1)℃；天平；電爐：可調式；吸管：容量為lmL和10mL，標有0.1mL單位的刻度；廣口瓶或三角燒瓶：容量為500mL；玻璃珠：直徑為5mm;平皿:皿底直徑為9-12cm;試管:18×200mm;酒精燈;均質器或乳缽；試管架；滅菌刀或剪刀；滅菌鑷子；酒精棉球；登記??；玻璃蠟筆。2．培養(yǎng)基和試劑營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：75％乙醇。生理鹽水或其它稀釋液：定量分裝于玻璃瓶和試管內，滅菌。3．檢驗程序菌落總數的檢驗程序如下：4．操作步驟(1)檢樣稀釋及培養(yǎng)①以無菌操作，將檢樣25g(或25mL)剪碎放于含有225mL滅菌生理鹽水或其它稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨作成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質器中以8000～10000r／min的速度處理lmin，作成1:10的均勻稀釋液。②用lmL滅菌吸管吸取1:10稀釋液lmL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水或其它稀釋液的試管內(注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液)，振搖試管混合均勻，作成1:100的稀釋液。

③另取lmL滅菌吸管，按上項操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支lmL滅菌吸管。④根據食品衛(wèi)生標準要求或對標本污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液于滅菌平皿內，每個稀釋度作兩個平皿。⑤稀釋液移入平皿后，應及時將涼至46

℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[可放置于(46±1)℃水浴保溫]注入平皿約15mL，并轉動平皿使混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有l(wèi)mL稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內作空白對照。⑥待瓊脂凝固后，翻轉平板，置(36±1)℃溫箱內培養(yǎng)(48±2)h。(2)菌落計數方法作平板菌落計數時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數。(3)菌落計數的報告①平板菌落數的選擇。選取菌落數在30～300之間的平板作為菌落總數測定標準。一個稀釋度使用兩個平板，應采用兩個平板平均數，其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數。平皿內如有鏈狀菌落生長時(菌落之間無明顯界線)，若僅有一條鏈，可視為一個菌落；如果有不同來源的幾條鏈，則應將每條鏈作為一個菌落計。

②稀釋度的選擇

a．應選擇平均菌落數在30—300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數報告之(見表11-1例1)。

b．若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30—300之間，則視二者之比如何來決定，若其比值小于2，應報告其平均數；若大于2則報告其中較小的數字(見表11-1例2及例3)。

c．若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表11-1例4)。

d．若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表11—1例5)。

e．若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于(<)1乘以最低稀釋倍數報告之(見表11-1例6)。

f．若所有稀釋度的平均菌落數均不在30—300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表11-1，例7)。③菌落數的報告。菌落數在100以內時，按其實有數據報告；大于100時，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，以四舍五入方法計算。為了縮短數字后面的零數，也可用10的指數來表示(見表11—1“報告方式”欄)。5．注意事項為了正確地反映食品中各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況，檢驗時必須遵循以下一些要求和規(guī)定。(1)所用器皿及稀釋液①檢驗中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿、吸管、試管等必須是完全滅菌的，并在滅菌前徹底洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質。②用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現幾個菌落時，要追加對照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿、吸管或空氣可能存在的污染。

③檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水，但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1％蛋白胨水為合適，因蛋白胨水對細菌細胞有更好的保護作用；不會因為在稀釋過程中而使食品檢樣中原已受損傷的細菌細胞導致死亡。如果對含鹽量較高的食品(如醬品等)進行稀釋，則宜采用蒸餾水。(2)檢樣稀釋①檢樣稀釋時，應以無菌手續(xù)稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或mL)剪碎放于含有225mL滅菌稀釋液的玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)，經充分振搖作成1:10的稀釋液。如系肉、魚等固體樣品，最好剪細于滅菌乳缽內與稀釋液研勻，或與稀釋液同置于滅菌均質器杯中(國產均質器，目前以江蘇武進鄭陸醫(yī)學儀器廠產品較簡便而實用)，以8000～10000r／min速度攪拌lmin；使做成均勻的1:10稀釋液。②根據食品衛(wèi)生標準要求或對標本污染情況的估計，將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個適當的10倍遞增稀釋液。即取1:10稀釋掖1mL與9mL稀釋液混合做成1:100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1:1000、1:10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另換一支1mL滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數方為準確。③從吸管筒內取出滅菌吸管時，不要將吸管尖端碰著其它仍留在容器內的吸管的外露部分；而且吸管在進出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時，也不要觸及瓶口及試管口的外側部分；因為這些部分都可能接觸過手或其它沾污物。

④在做10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內不能低于液面2.5cm；吸入液體時，應先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端離開液面，將尖端貼于玻璃瓶或試管的內壁使吸管內液體調至所要求的刻度，這樣取樣較準確,而且在吸管從稀釋液內取出時不會有多余的液體黏附于管外。⑤當用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的管內時，應小心沿管壁加入，不要觸及管內稀釋液，以防吸管尖端外側部分黏附的檢液也混入其中。

(3)平板接種與培養(yǎng)①將稀釋液加至滅菌平皿內時，應根據食品衛(wèi)生標準要求或對標本污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(從皿側加入，不要揭去皿蓋)，最后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個稀釋度應作2個平皿。②用于傾注平皿的營養(yǎng)瓊脂應預先加熱使融化，并保溫于(45±1)℃恒溫水浴中待用。傾注平皿時，每皿內傾入約15mL，最后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。

③為了防止細菌增殖及產生片狀菌落，在檢液加入平皿后，應在20min內傾入瓊脂，并立即使其與瓊脂混合均勻。④檢樣與瓊脂混合時，可將皿底在平面上先向一個方向旋轉，然后再向相反的方向旋轉，以使充分混勻。旋轉中應加小心，不要使混合物濺到皿邊的上方。為了保證混合均勻，而不濺及皿邊的上方，可使用江蘇省無錫縣衛(wèi)生防疫站童鶴泉設計制成的自動平皿旋轉儀，直接將加有檢樣的平皿放在旋轉儀上(可同時放4只平皿)，加入瓊脂后，開動電鈕，在數十s內即可自動左右旋轉而使皿內的檢樣與瓊脂混合勻。⑤皿內瓊脂凝固后，不要長久放置，然后使翻轉培養(yǎng)；而應于瓊脂凝固后，在數分鐘內即應將平皿翻轉予以培養(yǎng)，這樣可避免菌落蔓延生長。必要時，可先將皿打開倒置(皿底向上)于溫箱內經15～60min使瓊脂表面干燥后，再將皿底移至蓋內倒置于溫箱內培養(yǎng)。這樣可以阻止運動性強的變形桿菌屬、假單孢菌屬和芽孢桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴展生長。⑥為了控制污染，在取樣進行檢驗的同時，于工作臺上打開一塊瓊脂平板，其暴露的時間，應與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長的時間相當，然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內培養(yǎng)，以了解檢樣在檢驗操作過程中有無受到來自空氣的污染。

⑦培養(yǎng)溫度，應根據食品種類而定。肉、乳、蛋類食品用37℃培養(yǎng)，水產品用30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為(48±2)h。其它食品，如清涼飲料、調味品、糖果、糕點、果脯、酒類(主要為發(fā)酵酒)、豆制品和醬腌菜均系用37℃，(24±2)h培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和時間之所以有所不同是因為在制定這些食品衛(wèi)生標準中關于菌落總數的規(guī)定時，分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時間所取得的數據之故。水產品因來自淡水或海水，水底溫度較低，因而制定水產品細菌方面的衛(wèi)生標準時，系用30℃作為培養(yǎng)的溫度。(4)對照試驗①加入平皿內的檢樣稀釋液(特別是10-1的稀釋液)，有時帶有食品顆粒，在這種情況下，為了避免與細菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與瓊脂混合的平皿，不經培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便在計數檢樣菌落時用作對照。②為了防止檢樣中食品顆粒與菌落混淆，也可在已溶化而保溫于45℃水浴內的瓊脂中，按每100mL加1mL0.5％氯化三苯四氮唑(2，3，5—TTC)水溶液。培養(yǎng)后，如系食品顆粒，不見變化，如為細菌，則生成紅色菌落。配好的TTC溶液，應先用來與不加TTC的作對照，以觀察其對計數是否有不利的作用(TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用)。

TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發(fā)生分解。無色的TTC是作為受氫體加入培養(yǎng)基中，如果有細菌存在，培養(yǎng)后，在細菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲，使菌落呈現紅色。(5)菌落計數①從溫箱內取出平皿進行菌落計數時，應先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內平板上菌落生長情況。平行試驗的2個平板與菌落數應該接近，不同稀釋度的幾個平板上菌落數則應與檢樣稀釋倍數成反比，即檢樣稀釋倍數越大，菌落數越低，稀釋倍數越小，菌落數越高。②計數菌落時，應選取菌落數在30～300之間的平板作為菌落總數測定的標準。一個稀釋度使用兩個平板，應采用兩個平板平均數；如其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數。如在一個稀釋度的兩個平板中，一個平板的菌落數在30～300之間，另一個大于300或小于30時，則以菌落數在30～300間的平板作為計數的標準。③菌落計數所得結果，可分別按以下幾種不同情況作報告。

a．若1個稀釋度的平均菌落數在30～300之間，則將該菌落數乘其稀釋倍數報告之，如表11—1中例1，報告為:164×102=16400，或1.6×104b.若有2個稀釋度，其生長的菌落數均在30—300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2，應報告其平均數，如表11-1中例2：46000／29500=1.6<2，故報告為：(46000+29500)／2=37750或3.8×104。若大于2，則報告其中較小的數字，如表11—1例3:60000／27100=2.272，故報告為：27100或2.7×104。c．若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之，如表11—1中例4，報告為313×103=313000或3.1×105。d．若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之，如表11—1中例5，報告為27×10=270或2.7×102。e．若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1(<1)乘以最低稀釋倍數報告之，如表11—1中例6，報告為：<1×10，或<10。f．若所有稀釋度的平均菌落數均不在30～300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之，如表11—1中例7，報告為305×102=30500或3.1×104。④如果稀釋度大的平板上菌落數反比稀釋度小的平板上菌落數高，則系檢驗工作中發(fā)生的差錯，屬實驗案事故。此外，也可能因抑菌劑混入樣品中所致，均不可用作檢樣計數報告的依據。⑤如果平板上出現鏈狀菌落，菌落之間沒有明顯的界限，這是在瓊脂與檢樣混合時，一個細菌塊被分散所造成的。一條鏈作為一個菌落計，如有來源不同的幾條鏈，每條鏈作為一個菌落計，不要把鏈上生長的各個菌落分開來數。此外，如皿內瓊脂凝固后未及時進行培養(yǎng)而遭受昆蟲侵入，在昆蟲爬過的地方也會出現鏈狀菌落，也不應分開來數。⑥如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可計作報告，而應在稀釋度最大的平板上，任意數其中2個cm2中的菌落數，除2求出每cm2內平均菌落數，乘以皿底面積63.6cm2，再乘其稀釋倍數作報告。例如10-1～10-3稀釋度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀釋的平板上任意數2個cm2內的菌落數是60個，皿底直徑為9cm，則該檢樣每g(或mL)中“估計”菌落數為：(60／2)×63.6×1000=1908000或1.9×10663.6cm2系按皿底直徑為9cm時計算而得，即：(9／2)2

×3.14=63.6；如所用平皿的皿底直徑不是9cm，則可按其直徑的實際cm數代入圓面積公式求出。⑦菌落計數中，如能使用國產JLQ—S2型菌落計數器(江蘇武進鄭陸醫(yī)學儀器廠產品)，則比較方便，燈光由側面射向平板，菌落易于觀察。由于儀器帶有電子音響訊號，用特制金屬探筆點數中，在發(fā)出音響之下始顯示數字增加，不會發(fā)生差錯。且燈光與平板之間夾有多用方格玻質規(guī)板(方格面積為1cm2)，也有助于對菌落密布的平板進行計數。⑧檢樣如系微生物類制劑(如酸牛乳、酵母制酸性飲料)，則平板計數中應相應地將有關微生物(乳酸桿菌、酵母菌)排除，不可并入檢樣的菌落總數內作報告。一般在校正檢樣的pH至7.6后，再進行稀釋和培養(yǎng)，此類嗜酸性微生物往往不易生長，并可以用革蘭法染色鑒別。

染色鑒別時，要用不校正pH的檢樣做成相同稀釋度的稀釋液培養(yǎng)所生成的菌落涂片染色作對照，以資辨別。酵母菌卵圓形，遠比細菌大，大小為(2～5)×(5～3)μm，革蘭氏陽性著色。乳酸桿菌在24h內，于普通營養(yǎng)瓊脂平板上在有氧條件下培養(yǎng)，通常是不生長的。(6)報告方式①當檢樣的菌落數為1～100時，按實有數報告；大于100時，只記錄左面頭兩位數字(用兩位有效數字作報告，可避免產生虛假的精確概念)，左面第三位數字則用四舍五入法計算，從第二位數字之后都記為0，為了縮短數字后面的0數，也可用10的指數來表示，例如菌落數為37750時，即可寫成3.8×104(見表11—1中“報告方式”欄)。

②檢樣的菌落數如系從菌落密布的平板上按比例計算而求得，報告結果時，應在菌落數前加上“估計”二字(見上述菌落計數⑥中所舉之例)。③檢樣為固體，用重量法取樣檢驗時，以g為單位報告其菌落數；檢樣為液體，用容量法取樣檢驗時，以mL為單位報告其菌落數；如檢樣為樣品表面的涂擦液，則應以cm2為單位報告其菌落數。④如檢樣為液體，在兩個平皿內所加lmL未經稀釋的檢樣(原液)培養(yǎng)中均無細菌集落生成，則報告為lmL檢樣內未有菌落生長，或lmL檢樣內菌落數<1。二、大腸菌群測定大腸菌群系指一群在37℃、24h能發(fā)酵乳糖、產糖、產酸、產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質量，具有廣泛的衛(wèi)生學意義。食品中大腸菌群數系以每100mL(g)檢樣內大腸菌群最可能數(MPN)表示。1．設備和材料溫箱：(36±1)℃；水?。?44±0.5)℃；天平；顯微鏡；均質器或乳缽；溫度計；平皿；試管；吸管；載玻片；發(fā)酵倒管。

2．培養(yǎng)基和試劑乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍瓊脂、乳糖發(fā)酵管、革蘭氏染色液。3．檢驗程序大腸菌群檢驗程序如下：4．操作步驟(1)檢樣稀釋①以無菌操作將檢樣25mL(或25g)放于含有225mL滅菌生理鹽水或其它稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨作成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質器，以8000～10000r／min的速度處理lmin作成1:10的均勻稀釋液。②用lmL滅菌吸管吸取1：10稀釋液lmL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其它稀釋液的試管內，振搖試管混勻，作成1:100的稀釋液。③另取lmL滅菌吸管，按上項操作依次作10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支lmL滅菌吸管。

④根據食品衛(wèi)生標準要求或對檢樣污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。(2)乳糖發(fā)酵試驗將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內，接種量在lmL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管：lmL及l(fā)mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置(36±1)℃溫箱內，培養(yǎng)(24±2)h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產氣者，則按下列程序進行。(3)分離培養(yǎng)將產氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置(36±1)℃溫箱內，培養(yǎng)18～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭染色和證實試驗。

(4)證實試驗在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1～2個進行革蘭染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置(36±1)℃溫箱內培養(yǎng)(24±2)h，觀察產氣情況，凡乳糖管產氣、革蘭染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。(5)報告根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表(表11-2)，報告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。5．糞大腸菌群(faecalcoliform)(1)檢樣稀釋見4．(1)。(2)44℃乳糖發(fā)酵試驗將檢樣以無菌操作接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；lmL及l(fā)mL以下者，可用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管)，置(44±0.5)℃水浴內，培養(yǎng)(24±2)h，經培養(yǎng)后，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產氣，則可報告為陰性。如有產氣者，則按下列程序進行。(3)證實試驗將所有產氣發(fā)酵管，分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置(36±1)℃培養(yǎng)18～24h，并同時接種蛋白質試劑約0.5mL，觀察靛基質反應。

(4)結果評定凡靛基質陽性，平板上有典型菌落者，則證實為糞大腸菌群陽性。(5)報告根據證實為糞大腸菌群的陽性管數，查MPN檢索表，報告每100mL(g)糞大腸菌群的最可能數。6．注意事項(1)檢驗步序

a.大腸菌群的檢驗步序采用三步法(乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗)。第一步乳糖發(fā)酵試驗是樣品的發(fā)酵結果，不是純菌的發(fā)酵試驗，所以初發(fā)酵陽性管，經過平板分離和證實試驗后，有時可能成為陰性。

b.大量檢驗數據表明，食品中大腸菌群檢驗步序的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大，不同食品三步序的符合情況也不一致(見表11—3)。

c.所以在大腸菌群檢驗步序方面，應結合食品類別、污染情況以及樣品中菌相的差異分別予以考慮。

d.在食品檢驗上，除個別情況外，一般來說，如果平板上有較多典型大腸菌群菌落，革蘭染色為陰性桿菌，即可做出判定。

e.如平板上典型菌落甚少或均不夠典型，則應多挑菌落做證實試驗，以免出現假陰性。只做一步初發(fā)酵，對某些食品來說，誤差是比較大的。這樣做，會有相當的合格樣品被做為不合格樣品處理，應予注意。(2)抑菌劑

a.大腸菌群檢驗中經常使用的抑菌劑有膽鹽、洗衣粉、十二烷基硫酸鈉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產生一些抑制作用。

b.有些抑菌劑用量甚微，稱量時稍有差誤，即可對抑菌作用產生影響。

c.有的抑菌劑當批號、規(guī)格改變時，也可影響抑菌效果，而需重新測定抑菌的有效劑量。這些情況均給抑菌劑的使用帶來不利條件。d.我們曾對膽鹽等三種抑菌劑進行大腸菌群檢驗效果的觀察(見表11-4)。目前我國在食品大腸菌群檢驗方面采用膽鹽作為抑菌劑，豬、牛、羊三種膽鹽對大腸菌群的檢驗效果，經實驗觀察無何明顯差異，可相互替代。e.但其它膽鹽的檢驗效果則不一致(見表11-5)，故不宜相互替代。目前由于膽鹽不易購買，有的實驗室以3號膽鹽、混合膽鹽、去氧膽酸鈉或免膽鹽等代替豬膽鹽加入培基中，這會影響大腸菌群的檢驗結果，應予注意。f.在膽鹽用量上，實驗表明1％、0.5％和0.25％三個劑量無任何差異。所以目前乳糖發(fā)酵管采用的膽鹽劑量(0.5％)是適宜的，在稱量時稍有差誤，亦不致影響大腸菌群的檢出。(3)挑選菌落

a.大腸菌群是一群腸道桿菌的總稱，大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸桿菌更為復雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關。所以在實際工作中，為了提高大腸菌群的檢出率，應當熟悉大腸菌群的菌落色澤和形態(tài)。在檢驗方法中我們選用伊紅美藍平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤，檢出率為最高；紅色、粉色菌落檢出率較低。菌落形態(tài)的其它方面(如菌落大小、光滑與粗糙、邊緣完整情況、隆起情況、濕潤與干燥等)雖亦應注意，但不如色澤方面更為重要(見表11-6、表11-7)。

b.挑取菌落數與大腸菌群的檢出率有密切關系，在實際工作中，由于工作量較大，通常只挑取一個菌落，但影響大腸菌群檢出率的因素較多，如食品種類，菌落色澤和形態(tài)、細菌種類等，所以只挑一個菌落，由于幾率問題，很難避免假陰性的出現，尤其當菌落呈不典型時(見表11—8)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應多挑幾個，以免出現假陰性。(4)產氣量

a.在糖發(fā)酵試驗工作中，經?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內存有極微小的氣泡(有時比小米粒還小)，類似這樣的情況能否算作產氣陽性，這是許多食品檢驗工作者經常遇到的問題。大腸菌群協作組在這方面進行了實驗觀察。

b.結果表明，大腸菌群的產氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產生小于米粒的氣泡。一般來說，產氣量與大腸菌群檢出率呈正相關，但隨樣品種類而有不同，有小于米粒的氣泡，亦可有陽性檢出。

c.另外，對未產氣的乳糖發(fā)酵管是否均應作陰性處理，根據大量工作實踐來看，對這種情況應予慎重考慮，在日常工作中，經?？梢杂龅皆诔醢l(fā)酵時產酸無氣，但復發(fā)酵卻證實為大腸菌群陽性。有時倒管內雖無氣體，但在液面及管壁卻可以看到緩緩上浮的小氣泡。

d.所以對未產氣的乳糖發(fā)酵管如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產生，而應作進一步觀察。這種情況的陽性檢出率可達半數以上(見表11-9)。(5)MPN檢索表最可能數(MPN)是表示樣品中活菌密度的估測。MPN檢索表(見表11-2)是采用三個稀釋度九管法，稀釋度的選擇是基于對樣品中菌數的估測，較理想的結果應是最低稀釋度3管為陽性，而最高稀釋度3管內陰性。如果無法估測樣品中的菌數，則應做一定范圍的稀釋度。這次提供的MPN檢索表列出了95％可信限，供使用者參考。在查閱MPN檢索表時，應注意以下幾個問題。①這次提供的MPN檢索表和部頒法(1976版)不同，只給了三個稀釋度，即1mL(g)、0.1mL(g)、0.01mL(g)、如欲改用10mL(g)、lmL(g)、0.1mL(g)或0.1mL(g)、0.01mL(g)、0.001mL(g)時，則表內數字應相應降低或增加10倍，其余可類推。

②在MPN檢索表第一欄陽性管數下面列出的mL(g)，系指原樣品(包括液體和固體)的mL(g)數，并非樣品稀釋后的mL(g)數，對固體樣品更應注意。如固體樣品1g經10倍稀釋后，雖加入1mL量，但實際其中只含有0.1g樣品，故應按0.1g計，不應按lmL計。③當檢索表內三個稀釋度檢測結果都是陰性時，MPN值應按<3判定，這樣更能反映實際情況。例如11.1mL(g)和1.11mL(g)兩個檢測劑量，當它們都是陰性時，如都按0處理，則兩組樣品量雖相差10倍，但MPN值卻無法區(qū)分，實際上兩個0的含義并不相等。如按<3和<30處理，則MPN值能反映出兩組所用樣品量的不同，實際上11.1mL(g)應為<3，而1.11mL(g)應為<30，二者還是有區(qū)別的。所以用<3和<30處理，更反映實際情況。第三節(jié)常見致病菌檢驗一、葡萄球菌檢驗食品中生長金黃色葡萄球菌是食品衛(wèi)生上的一種潛在危險，因為金黃色葡萄球菌可以產生腸毒素，食后能引起食物中毒。因此，檢查食品中金黃色葡萄球菌有實際意義。1．設備和材料顯微鏡；溫箱：(36±1)℃；離心機；滅菌吸管：1、5、10mL；滅菌試管；載玻片；酒精燈。2．培養(yǎng)基和試劑7.5％氯化鈉肉湯、血瓊脂平板、Baird—Parker氏培養(yǎng)基、肉浸液肉湯、滅菌鹽水、兔血漿。3．檢驗程序葡萄球菌檢驗程序如下：4．操作步驟(1)一般培養(yǎng)將上述混懸液(25g檢樣加225mL滅菌生理鹽水)或液體檢樣吸取5mL接種于7.5％氯化鈉肉湯50mL，同時挑取混懸液接種血平板及Baird-Parker氏培養(yǎng)基，置(36±1)℃溫箱培養(yǎng)24h，7.5％氯化鈉肉湯經增菌后轉種上述平板。挑取金黃色葡萄球菌菌落進行革蘭染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。(2)形態(tài)本菌為革蘭陽性球菌，排列呈葡萄狀，無芽孢，無莢膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5～1μm。

(3)培養(yǎng)特性在肉湯中呈混濁生長，血平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird-Parker氏培養(yǎng)基上為圓形，光滑，凸起，濕潤，直徑為2—3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明帶。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。(4)血漿凝固酶試驗吸取1:4新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5mL振蕩混勻，放(36±1)℃溫箱或水浴內每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現凝塊即為陽性。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌菌株及肉浸液肉湯作為對照。5．注意事項(1)增菌培養(yǎng)一般用7.5％氯化鈉肉湯增菌。Giolitti和Cantoni應用加有亞碲酸鉀、氨基乙酸等試劑的Giolitti-Cantoni肉湯，增菌食品樣品中的葡萄球菌，效果較好。37℃培養(yǎng)24h。(2)分離培養(yǎng)用Baird-Parker平板和血平板進行劃線接種。(3)分純培養(yǎng)在Baird-Parker平板上挑取圓形、光滑、凸起、濕潤、直徑為2～3mm，顏色呈灰黑色到黑色菌落，菌落周圍有一混濁帶在其外層有一透明圈。偶然也會遇到無混濁帶和透明圈的菌落。在血平板上菌落呈現金黃色(個別有白色)，大而突起，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。進行分純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h，進行革蘭染色，如為革蘭氏陽性葡萄狀排列，進行生化試驗，腸毒素分型，噬菌體分型等試驗。

(4)生化試驗葡萄球菌觸酶陽性，與鏈球菌相區(qū)別，一般對糖發(fā)酵不規(guī)則，多數菌株分解葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，產酸不產氣，致病性葡萄球菌在厭氧條件下能分解甘露醇，產酸，非致病性葡萄球菌無此作用。

二、溶血性鏈球菌檢驗鏈球菌在自然界分布較廣，可存在于水、空氣、塵埃、牛奶、糞便及人的咽喉和病灶中，根據其抗原結構，族特異性“C”抗原的不同，可進行血清學分群，按其在血平板上溶血的情況可分為甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌和丙型溶血性鏈球菌。與人類疾病有關的大多屬于乙型溶血性鏈球菌，其血清型90％屬于A群鏈球菌，?？梢鹌つw和皮下組織的化膿性炎癥及呼吸道感染，還可通過食品引起猩紅熱、流行性咽炎的暴發(fā)性流行。

1．設備和材料溫箱：(36±1)℃；水浴箱：(36±1)℃；顯微鏡；離心機；試管架；滅菌平皿；滅菌小試管；載玻片；滅菌吸管：lmL、5mL；滅菌鑷子。2．培養(yǎng)基和試劑葡萄糖肉浸液肉湯(在肉浸液肉湯內加入1％葡萄糖)、匹克氏肉湯、血瓊脂、人血漿、0.25％氯化鈣。滅菌生理鹽水。桿菌肽藥敏紙片(含0.04單位)。3．檢驗程序溶血性鏈球菌檢驗程序如下圖4．操作步驟(1)檢樣處理稱取25g固體檢樣，加入225mL滅菌生理鹽水，研成勻漿制成混懸液；液體檢樣可直接培養(yǎng)。(2)一般培養(yǎng)將上述混懸液或液體檢樣直接劃線于血平板，并吸取5mL接種于50mL葡萄糖肉浸液肉湯內，如檢樣污染較嚴重，可同時按上述量接種匹克氏肉湯，經(36±1)℃培養(yǎng)24h，接種血平板，置(36±1)℃培養(yǎng)24h，挑取乙型溶血圓形突起的細小菌落，在血平板上分純，然后觀察溶血情況及革蘭染色，并進行鏈激酶試驗及桿菌肽敏感試驗。(3)形態(tài)與染色本菌呈球形或卵圓形，直徑0.5～lμm，鏈狀排列，鏈長短不一，短者4～8個細胞組成，長者20～30個，鏈的長短常與細菌的種類及生長環(huán)境有關；液體培養(yǎng)中易呈長鏈；在固體培養(yǎng)基中常呈短鏈；不形成芽孢，無鞭毛，不能運動。(4)培養(yǎng)特性該菌營養(yǎng)要求較高，在普通培養(yǎng)基上生長不良，在加有血液、血清培養(yǎng)基中生長較好。溶血性鏈球菌在血清肉湯中生長時，管底呈絮狀或顆粒狀沉淀。血平板上菌落呈灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直徑約0.5～0.75mm，為圓形突起的細小菌落，乙型溶血性鏈球菌周圍有2～4mm界限分明、無色透明的溶血圈。(5)鏈激酶試驗致病性溶血性鏈球菌能產生鏈激酶(即溶纖維蛋白酶)，此酶能激活正常人體血液中血漿蛋白酶原，使成血漿蛋白酶，而后溶解纖維蛋白。

吸取草酸鉀血漿0.2mL(草酸鉀0.0lg，加入5mL人血混勻，經離心沉淀吸取上清液即為血漿)，加入0.8mL滅菌生理鹽水，混勻，再加入18～24h鏈球菌肉湯培養(yǎng)物0.5mL及0.25％氯化鈣0.25mL，振蕩搖勻。置(36±1)℃水浴中每隔數分鐘觀察一次(一般約l0min即可凝固)，血漿凝固后，再注意觀察及記錄溶化的時間。溶化時間愈短，表示該菌產生的鏈激酶愈多，含量多時，20min內凝固的血漿即完全溶解。如無變化，應在水浴中持續(xù)放置2h，24h后再觀察，如凝塊全部溶解為陽性，24h后仍不溶解者為陰性。

(6)桿菌肽敏感試驗挑取乙型溶血性鏈球菌濃菌液，涂布于血平板(肉浸液瓊脂加入5％血)上，用滅菌鑷子夾取每片含有0.04單位的桿菌肽紙片，放于上述平板上，于(36±1)℃培養(yǎng)18～24h，如有抑菌帶出現即為陽性，可初步鑒定為A群鏈球菌，同時用已知陽性菌株作為對照。5．注意事項(1)增菌培養(yǎng)一般用匹克肉湯或葡萄糖肉浸液肉湯，有的學者在葡萄糖肉湯內加有Lablemco粉，增菌效果好。匹克肉湯含有胰蛋白胨的心肌浸液和脫纖維血，營養(yǎng)豐富，含有三氮化鈉抑制革蘭陰性細菌生長，一般用于污染嚴重的標本。接種后經37℃培養(yǎng)24h。

(2)分離培養(yǎng)將上述增殖的培養(yǎng)物接種于血瓊脂平板，有的學者應用三氮化鈉平板分離效果也較好。分離后37℃培養(yǎng)24h。(3)分純培養(yǎng)挑取血平板上灰白色、半透明或不透明、表面光滑小的菌落，菌的周圍有透明環(huán)的單個菌落，進行分純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h，進行革蘭染色，如為革蘭陽性鏈狀排列球菌，進行生化試驗和血清學試驗。(4)生化試驗①溶纖維蛋白酶試驗(鏈激酶)：抽取人血l0mL，放入已加有無菌0.02g草酸鉀試管內，混合之，置于2000r／min離心機內旋轉l0min，吸取血漿進行試驗。取血漿0.2mL，加0.8mL鹽水混合，再加入鏈球菌24h肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5mL。

然后再加入0.25％氯化鈣(分析純)0.25mL，混合后放37℃水浴，注意血漿完全凝固時間(約15min)。凝固后每半小時觀察一次結果，記錄完全凝固和溶解時間，共觀察2h，不溶解者仍放水浴，24h后再觀察一次。另用0.5mL肉浸液肉湯作為陰性對照，用已知鏈激酶陽性菌株肉浸肉湯培養(yǎng)物0.5mL作為陽性對照。致病性溶血鏈球菌鏈激酶應為陽性。做該項試驗注意人血漿應新鮮。②桿菌肽敏感試驗，將分純的乙類溶血鏈球菌劃線接種于血瓊脂平板，以無菌手續(xù)將每片內含有0.04單位的桿菌肽紙片貼附于上述劃線處。37℃培養(yǎng)18h，如產生抑菌圈即為對桿菌肽敏感，對桿菌肽敏感的菌株99.5％為A族鏈球菌，另外還有6％B族；7.5％C族和G族鏈球菌也對桿菌肽敏感，因此當該項試驗陽性時，可推測為乙類溶血性A族鏈球菌。

三、沙門菌檢驗沙門菌病常在動物中廣泛傳播，人的沙門菌感染和帶菌也非常普遍。由于動物的生前感染或食品受到污染，均可使人發(fā)生食物中毒。在世界各地的食物中毒中，沙門菌食物中毒常占首位或第二位。食品中沙門菌的含量較少，且常由于食物加工過程使其受到損傷而處于瀕死的狀態(tài)。故為了分離食品中的沙門菌，必須將增菌方法作某些改進。同時，由于分類學的改變，過去所稱“亞利桑那菌屬”現已與沙門菌屬合并，列為亞屬Ⅲ，因此，分離與鑒定的方法應作相應的改變。

目前用于食品中沙門菌的檢驗方法，包括五個基本步驟：(1)前增菌，用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的沙門菌恢復其活力；(2)選擇性增菌，使沙門菌得以繁殖，而大多數的其它細菌受到抑制；(3)選擇性平板分離沙門菌；(4)生化試驗，鑒定到屬；(5)血清學分型鑒定。1．設備和材料天平：稱取檢樣用；均質器或乳缽；溫箱：(36±1)℃、42℃；顯微鏡；滅菌廣口瓶：500mL；滅菌三角燒瓶：250mL；滅菌吸管：l0mL；滅菌平皿：皿底直徑9cm；滅菌小玻管：內徑3mm，長約5cm；滅菌毛細吸管及橡皮乳頭；載玻片；酒精燈；滅菌金屬匙或玻璃棒；接種棒、鎳鉻絲；試管架。2．培養(yǎng)基和試劑緩沖蛋白胨水(BP)、氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硫酸鉍瓊脂(BS)。DHL瓊脂、HE瓊脂、SS瓊脂、三糖鐵瓊脂(TSI)、蛋白胨水、靛基質試劑、尿素瓊脂(DHTZ)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、糖發(fā)酵管、ONPG培養(yǎng)基、半固體瓊脂、緩沖葡萄糖蛋白胨水、甲基紅試劑、V-P試劑、丙二酸鈉培養(yǎng)基、氧化酶試驗、革蘭氏染色液、沙門菌因子血清：用于初步分型有26種，一般分型有57種，詳細分型有144種。3．檢驗程序沙門菌檢驗程序如下：4．操作步驟(1)前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品均應經過前增菌。各稱取檢樣25g，加在裝有225mL緩沖蛋白胨水的500mL廣口瓶內。固體食品可先應用均質器，以8000～10000r／min打碎lmin，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻璃棒研磨使乳化。于(36±1)℃培養(yǎng)4h(干蛋品需培養(yǎng)18—24h)，移取l0mL，轉種于l00mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內，于42

℃培養(yǎng)18—24h。同時，另取l0mL，加入于l00mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內，于(36±1)℃培養(yǎng)18—24h。

鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經加工的食品不必經過前增菌。各取25g(25mL)加入滅菌生理鹽水25mL按前法做成檢樣勻液，取其半量接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內，于42℃培養(yǎng)24h；另半量接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內，于(36±1)℃培養(yǎng)18～24h。(2)分離取增菌液1環(huán)，劃線接種于亞硫酸鉍瓊脂平板一個和DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、或SS瓊脂平板)一個。兩種增菌液可同時劃線接種在同一個平板上。于(36±1)℃分別培養(yǎng)18—24h(DHL、HE、SS)或40～48h(BS)。觀察各平板上生長的菌落，沙門菌屬亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、V和亞屬Ⅲ在各個子板上的菌落見表12—1。

(3)生化試驗①挑取選擇性平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂。一般應多挑幾個菌落，以防遺漏。在三糖鐵瓊脂內，各個菌屬的主要反應結果見表12-2。

表12—2說明在三糖鐵瓊脂內只有斜面產酸并同時硫化氫(H2S)陰性的菌株可以排除，其它的反應結果均有沙門菌的可能，同時也均有不是沙門菌的可能，因此都需要做幾項最低限度的生化試驗。必要時作抹片染色鏡檢應為革蘭陰性短桿菌，作氧化酶試驗應為陰性。②在接種三糖鐵瓊脂的同時，再接種蛋白胨水(供作靛基質試驗)、尿素瓊脂，(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各一管，于(36±1)℃培養(yǎng)18—24h，必要時可延長至48h，按表12-3判定結果。按反應序號分類，沙門菌屬的結果應屬于A1、A2和B1，其他五種反應結果均可以排除。

沙門菌的檢驗可做至上述初步生化鑒定。必要時可將初步鑒定所分離的菌種及實驗記錄送至上級檢驗部門，做進一步鑒定。5．注意事項(1)前增菌、增菌和分離細菌受冷凍、加熱、干燥、高滲、酸堿、輻射等的影響，可導致亞致死性的損傷，如給予適當的營養(yǎng)和溫度，很快即能恢復，故經過冷凍或加工的食品，一般要選經過非選擇性的前增菌。經過前增菌再進行選擇后的增菌一般比直接增菌有更高的陽性檢出率。目前常用于前增菌的培養(yǎng)基為緩沖蛋白胨水和乳糖肉湯，兩種培養(yǎng)基的效果無顯著差異。未經加工的生食品或污染嚴重的食品，直接選用選擇性增菌。選擇性增菌培養(yǎng)基，目前仍以亞硒酸鹽肉湯、四硫磺酸鹽肉湯和氯化鎂孔雀綠肉湯為好。亞硒酸鹽肉湯選擇作用的機制可能是由亞硒酸鈉與某些硫化物反應生成硒基連多硫酸鹽或其它硒硫化合物所致。胱氨酸是較好的硫源，故在美國被推薦加入于增菌肉湯中。四硫磺酸鹽肉湯的選擇作用，取決于硫代硫酸鈉和碘的平衡(Na2S203·5H20+I2→Na2S406+2NaI+5H2O)，碘液的加入量要經過嚴格的計算，配合后進行分裝，并當時使用。氯化鎂孔雀綠肉湯也是一種很好的沙門菌增菌培養(yǎng)基，但對傷寒沙門菌不利，近年來在原配方基礎上又有所改進，形成了RV增菌肉湯和R10增菌肉湯。選擇性培養(yǎng)的溫度，一般認為在43

℃時可增加沙門菌的檢出率，但對傷寒沙門菌和雛沙門菌不利。

選擇性瓊脂平板、目前認為以亞硫酸鉍瓊脂(BS)最好；其次為木糖賴氨酸瓊脂(XLD)、Hektoen瓊脂(HE)、煌綠瓊脂(BG)；而以SS瓊脂為最差。新介紹的含硫膽鹽乳糖瓊脂(DHL)的效果優(yōu)于HE瓊脂。關于食品中沙門菌的增菌、分離等各個階段的方法學，國內已有很好的綜述。由于XLD瓊脂和HE瓊脂成本昂貴，國內難以普遍使用。HE瓊脂的H2S指示系統是非常好的，國內紛紛以此為基礎，取得了良好的效果。(2)生化學鑒定20世紀40年代用于沙門菌的生化試驗項目過于簡單，大量生化特性相似的菌株無法鑒別。50年代開始，新的生化試驗項目不斷產生，但尚未在實際工作中應用。1962年在蒙德利爾召開的國際細菌分類命名委員會腸桿菌科小組委員會會議，為推廣新的生化試驗項目奠定了良好的基礎。天津商品檢驗局

于1958年報告了采用KCN試驗鑒別檸檬酸桿菌和沙門菌。但由于文革十年動亂，大量的新的生化試驗項目尚未被國內的同行們所熟知。國內推廣沙門菌的新的生化試驗項目，是在20世紀70年代的中后期。1976年出版的《食品衛(wèi)生檢驗方法(微生物學部分)》第二版中，鑒定沙門菌所用的一般生化試驗項目，仍是40年代的老方法，而書中所介紹的系統生化試驗項目，則是以腸桿菌科小組委員會1962年公布的定義為準，必須做完28項生化項目方能作出沙門菌屬的鑒定結論。而且必要時還要加做ONPG試驗（β—半乳糖苷酶試驗）或5％乳糖發(fā)酵，甚至還要做考夫曼所推薦的5項有機酸鹽試驗。由于試驗項目過多，給實際工作帶來很大的不便。

1983年在《食品衛(wèi)生檢驗方法(微生物學部分)》第三版中起草了第二個腸桿菌科各屬簡化診斷表。列入本表的必要的生化項目只有五項，即是H2S、靛基質、pH7.2尿素酶、KCN和賴氨酸脫羧酶。對于H2S陽性的細菌，已足以正確鑒別沙門菌屬和檸檬酸桿菌屬；對于H2S陰性的細菌，查表到B1時，實際上只要補做ONPG試驗（β—半乳糖苷酶試驗），即可以正確鑒別沙門菌屬和艾希菌屬。這是沙門菌屬生化學鑒定的最簡單的，也是最佳的方案。

四、志賀菌檢驗志賀菌在食品中的存活期較短，目前仍缺少理想的增菌方法，但其重要性不可忽視。1．設備和材料天平：稱取檢樣用；均質器或乳缽；溫箱：(36±1)℃；顯微鏡；滅菌廣口瓶：500mL；滅菌平皿：皿底直徑9cm；酒精燈；載玻片；滅菌金屬匙或玻璃棒；接種棒、鎳鉻絲；試管架。2．培養(yǎng)基和試劑

GN增菌液、HE瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂(EMB)、三糖鐵瓊脂(TSI)、半固體管、賴氨酸培養(yǎng)基、苯丙氨酸瓊脂、西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、葡萄糖銨培養(yǎng)基、糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質試劑、緩沖葡萄糖蛋白胨水、V-P試基、甲基紅試劑、氧化酶試驗、革蘭氏染色液。

3．檢驗程序志賀菌檢驗程序如下。4．操作步驟(1)增菌稱取檢樣25g，加入裝有225mLGN增菌液的500mL廣口瓶內(固體食品應用均質器以8000～10000r／min打碎lmin，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品應用滅菌金屬匙或玻璃棒研磨使其乳化)，于(36±1)℃培養(yǎng)6～8h。(2)分離取增菌液1環(huán)，劃線接種于HE瓊脂平板或SS瓊脂平板一個，麥康凱瓊脂平板或伊紅美藍瓊脂平板一個，于(36±1)℃培養(yǎng)18～24h。志賀菌在這些培養(yǎng)基上呈現無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。

(3)生化試驗挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和半固體各一管。一般應多挑幾個菌落以防遺漏。志賀菌屬在三糖鐵瓊脂內的反應結果為底層產酸、不產氣(福氏志賀菌6型可微產氣)，斜面產堿，不產生硫化氫，無動力，在半固體管內沿穿刺線生長。具有以上特性的菌株，疑為志賀菌，可做血清凝集試驗。在做血清學試驗的同時，應進一步做V—P、苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫羧酶、西蒙檸檬酸鹽和葡萄糖銨試驗，志賀菌屬均為陰性反應。必要時應做革蘭染色檢查和氧化酶試驗，應為氧化酶陰性的革蘭陰性桿菌，并以生化試驗方法做4個生化群的鑒定，見表12-4。(4)血清學試驗必要時，可將生化試驗分群鑒定的菌種及實驗記錄，送至上級檢驗機構進行血清學鑒定。5．注意事項(1)志賀菌在常溫存活期很短，因此，當樣品采集后，應盡快進行檢驗。如果在24h內檢驗，樣品可保存在冰箱內，如欲保存較長時間，必須放在低溫冰箱內。宋內志賀菌和福氏志賀菌2a型，在牛乳和麥粉中，于—25℃可存活100d；在雞蛋和水產品中于—20

℃可存活30d。(2)迄今沒有很好的增菌培養(yǎng)基。目前仍然認為用GN肉湯增菌，以檢查食品中和糞便中的志賀菌是有效的。

(3)增加鑒別培養(yǎng)基的數目，可以增加志賀菌的陽性檢出率。用于分離的鑒別培養(yǎng)基一般不少于兩個。中等選擇性的，HE或SS瓊脂平板一個；弱選擇性的，麥康凱或EMB瓊脂平板一個。WS瓊脂可作為中等選擇性培養(yǎng)基使用，FX瓊脂可作為弱選擇性培養(yǎng)基使用。(4)動力的觀察非常重要。挑取可疑菌落，除接種一支三糖鐵瓊脂外，還要接種一支半固體瓊脂。(5)下面的五項生化試驗：V-P、苯丙氨酸、賴氨酸、檸檬酸鹽和葡萄糖銨，是為了排除克雷伯菌族、變形桿菌族、以及無動力不產氣的大腸艾希菌。應當著重注意鑒別的是無動力不產氣的大腸艾希氏菌，其次是哈夫尼亞菌屬和普羅菲登斯菌屬。第四節(jié)真菌學檢驗一.霉菌和酵母菌數測定（一）常見產毒霉菌的觀察常見產毒霉菌主要有曲霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬中的一些種。要想從污染的食品中分離出這些霉菌，并鑒定到屬或種，首先必須學會霉菌的分離鑒定技術，同時還要具備霉菌形態(tài)學方面的知識。對常見產毒霉菌的觀察包括用肉眼觀察和在顯微鏡下觀察。肉眼觀察的方法是將這些霉菌接種于斜面培養(yǎng)基上或將純培養(yǎng)物點植于平板上，培養(yǎng)出一個完整的較大菌落，以供觀察記錄，這種方法叫大培養(yǎng)，主要是了解各種霉菌的培養(yǎng)性狀和菌落特征。要想進一步了解霉菌的生長發(fā)育過程以及菌絲和孢子的形態(tài)特點，則采用小培養(yǎng)方法在顯微鏡下觀察，或者從純培養(yǎng)物上取材，制成壓片，在顯微鏡下觀察。具體實驗方法見后面講解，下面分別介紹一下主要產毒霉菌的形態(tài)結構。1、曲霉屬本屬的產毒霉菌主要包括黃曲霉、寄生曲霉、棕曲霉、雜色曲霉和構巢曲霉等。菌落特征：菌落顏色多種多樣，但比較穩(wěn)定。菌落質地多為絲絨狀或絮狀，有些菌種菌落表面有放射狀溝紋。鏡下結構：菌絲無色或有明亮的顏色，菌絲有橫隔。附著在培養(yǎng)基表面的匍匐菌絲轉化成厚壁細胞，稱足細胞，在足細胞上長出直立的分生孢子梗。孢子梗的頂端膨大成頂囊，在頂囊的周圍有輻射狀排列的小梗(單層或雙層)，如為兩層，其內面一層稱初生小梗(又稱?；?，外面一層稱為次生小梗(又叫瓶梗)。小梗頂端產生一串分生孢子。常見產毒霉菌如下圖：圖

2、青霉屬本屬的產毒霉菌主要包括黃綠青霉、桔青霉、圓弧青霉、展開青霉、純綠青霉、紅色青霉、產紫青霉和島青霉等。菌落特征：顏色大多數為青灰色、灰綠色。質地可為絨狀、絮狀、繩狀和束狀四種類型。有些種菌落表面有放射狀溝紋或同心環(huán)，有的有滲出液。鏡下結構：菌絲無色或有顏色，有橫隔。分生孢子?？捎蔂I養(yǎng)菌絲或氣生菌絲生出。分生孢子梗的頂端形成帚狀的分枝，稱為帚狀枝。帚狀枝是本屬的基本特征。根據帚狀枝分枝的不同分為四種類型：(1)單輪生帚狀枝；(2)二輪對稱型帚狀枝；(3)非對稱型帚狀枝；(4)多輪生帚狀枝。帚狀枝最后一級分枝，即產生分生孢子的細胞，稱為瓶梗。產生瓶梗的細胞叫梗基。支持?；募毎懈敝ΑＦ抗ｍ敹水a生分生孢子。常見產毒霉菌如下圖：

3、鐮刀菌屬本屬的產毒霉菌主要包括禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、三線鐮刀菌、梨孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和木賊鐮刀菌等。菌落特征：菌落顏色多比較鮮艷，有粉紅色、黃色、橙色、紫色等。質地疏松，多為絮狀或絨狀及粉狀。

鏡下結構：菌絲多無色透明，或有明亮鮮艷顏色。本屬大多數種具有兩種分生孢子。小分生孢子生于分生孢子梗上，形狀多樣，卵形、梨形、橢圓形和紡錘形等，少數有1-2個隔。大分生孢子產生在菌絲的短小爪狀突起上或產生在分生孢子座上，或產生在粘孢團中。大分生孢子多種多樣，可呈鐮刀形、線形、紡錘形、披針形、弧形、柱形和錐形等，通常有3—5個分隔，少數種有6—9個分隔。大分生孢子的形態(tài)，大小和分隔數目是鑒定鐮刀菌的重要依據。常見產毒霉菌如下圖：（二）、霉菌和酵母計數各類食品由于遭到霉菌和酵母的侵染，常常使食品和糧食發(fā)生霉壞變質，有些霉菌的有毒代謝產物引起各種急性和慢性中毒，特別是有些霉菌毒素具有強烈的致癌性。實驗證明，一次大量食入或長期少量食入，皆能誘發(fā)癌癥。目前已知的產毒霉菌如青霉、曲霉和鐮刀菌在自然界中分布較廣，對食品的侵染機會亦多。因此，對食品加強霉菌的檢驗，在食品衛(wèi)生學上具有重要意義。霉菌和酵母數的測定是指食品檢樣經過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，測得1g或lmL檢樣中所含的霉菌和酵母菌落數(糧食樣品是指1g糧食表面的霉菌總數)。霉菌和酵母數主要作為判定食品被霉菌和酵母污染程度的標志，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據。本方法適用于所有食品。1、霉菌和酵母平板計數法（1）．設備和材料溫箱：25～28℃；振蕩器；天平；顯微鏡；玻塞三角瓶：300mL；試管：15×150mm；平皿：直徑9cm；吸管：lmL及l(fā)0mL；酒精燈；載物玻片；蓋玻片：廣口瓶：121℃滅菌20min；牛皮紙袋：121℃滅菌20min；金屬勺、刀等；試管架；接種針；橡皮乳頭。（2）．培養(yǎng)基和試劑察氏培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、馬鈴薯瓊脂、孟加拉紅培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂、滅菌蒸餾水、乙醇、乳酸一苯酚液。

（3）．檢驗程序霉菌和酵母數檢驗程序見下圖。（4）．操作步驟

①采樣取樣時需特別注意樣品的代表性和避免采樣時的污染。首先準備好滅菌容器和采樣工具，如滅菌牛皮紙袋或廣口瓶，金屬刀或勺等。在衛(wèi)生學調查基礎上，采取有代表性的樣品。樣品采集后應盡快檢驗，否則應將樣品放在低溫干燥處。糧食(包括糧庫儲糧，糧店或家庭小量存糧)樣品的采集，可根據糧囤或糧垛的大小和類型，分層定點取樣，一般可分三層五點，或分層隨機采取不同點的樣品，充分混合后，取500g左右送檢。小量存糧可使用金屬小勺采取上、中、下各部位的混合樣品。

海運進口糧的采樣：每一船倉采取表層、上層、中層及下層四個樣品，每層從五點取樣混合。如船倉盛糧超過1萬噸，則應加采一個樣品。必要時采取有疑問的樣品送檢。谷物加工制品(包括熟飯、糕點、面包等)、發(fā)酵食品、乳及乳制品以及其它液體食品，用滅菌工具采集可疑霉變食品250g，裝入滅菌容器內送檢。

②以無菌操作稱取檢樣25g(或25mL)，放入含有225mL滅菌水的玻塞三角瓶中，振搖30分鐘，即為1:10稀釋液。

③用滅菌吸管吸取1:10稀釋液l0mL，注入試管中，另用帶橡皮乳頭的lmL滅菌吸管反復吹吸50次，使霉菌孢子充分散開。

④取lmL1:10稀釋液注入含有9mL滅菌水的試管中，另換一支lmL滅菌吸管吹吸5次，此液為1:100稀釋液。

⑤按上述操作順序作10倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支lmL滅菌吸管，根據對樣品污染情況的估計，選擇3個合適的稀釋度，分別在作10倍稀釋的同時，吸取lmL稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度作2個平皿，然后將涼至45℃左右的培養(yǎng)基注入平皿中，待瓊脂凝固后，倒置于25～28℃溫箱中，3d后開始觀察，共培養(yǎng)觀察5d。

⑥計算方法通常選擇菌落數以10～150之間的平皿進行計數，同稀釋度的2個平皿的菌落平均數乘以稀釋倍數，即為每g(或每mL)檢樣中所含霉菌和酵母數。

⑦報告每g(或每mL)食品所含霉菌和酵母數以個／g(個／mL)表示。2、霉菌直接鏡檢計數法一般以郝氏霉菌計測法為最常用。本方法適用于番茄醬罐頭。（1）．設備和材料燒杯；玻璃棒；折光儀；顯微鏡；郝氏計測玻片：是一特制的，具有標準計測室的玻片；蓋玻片；測微器：具標準刻度的玻片。

（2）．操作步驟

①檢樣的制備取定量檢樣，加蒸餾水稀釋至折光指數為1.3447—1.3460(即濃度為7.9％一8.8％)備用。

②顯微鏡標準視野的校正將顯微鏡按放大率90～125倍調節(jié)標準視野。使其直徑為1.382mm。

③涂片洗凈郝氏計測玻片，將制好的標準樣液，用玻棒均勻的攤布于計測室，以備觀察。

④觀測將制好之載玻片放于顯微鏡標準視野下進行霉菌觀測，一般每一檢樣應觀察50個視野，最好同一檢樣兩人進行觀察。

⑤結果與計算在標準視野下，發(fā)現有霉菌菌絲其長度超過標準視野(1.382mm)的1／6或三根菌絲總長度超過標準視野的1／6(即測微器的一格)時即為陽性(+)，否則為陰性(-)，按100個視野計，其中發(fā)現有霉菌菌絲體存在的視野數，即為霉菌的視野百分數。3、糧食霉菌的分離糧粒的內部和外部均有大量真菌存在，霉菌和酵母菌數的測定可反映糧食外部帶菌情況，要想了解糧食內部霉菌侵染情況，一般采用直接平板法。[材料]小鑷子、滅菌錐形瓶、滅菌試管、滅菌吸管、75％酒精、滅菌蒸餾水、高滲察氏培養(yǎng)基平板等。

[方法]（1）．糧粒表面除菌為了分離侵染內部的霉菌，在分離培養(yǎng)前，必須將附在糧粒表面的霉菌除去。糧粒表面除菌的方法是采用無菌水多次洗滌的方法。取糧食樣品10—20g，放入滅菌的150ml錐形瓶中，以無菌技術，加入無菌水超過糧粒1—2cm左右，塞好棉塞充分振蕩1-2min，將水倒凈，再換水振蕩，如此反復洗滌十次，最后將水棄去，將糧粒倒在無菌平皿中備用。如為原糧(如玉米、小麥等)須事先用75％酒精浸泡1-2min，以脫糧粒表面的蠟質，傾去酒精后，再用無菌水洗滌糧粒。（2）.糧粒接種方法

①糧粒直接接種法糧粒內部的霉菌分離主要應用此法。以無菌操作，用滅菌鑷子將上述表面除菌的糧粒，胚部向下按等距離排列接種在高滲察氏瓊脂平板上，接種時須將糧粒一部分插入培養(yǎng)基中。每塊平板大粒(玉米、大豆等)者接種5粒，小粒者接種10粒，每份樣品共接種50-100粒。接種完畢后，立即置28℃恒溫箱培養(yǎng)一周。