第六章 一般毒性2-2

毒性評(píng)價(jià)或安全性評(píng)價(jià)的基本目的受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)劑量－反應(yīng)（效應(yīng)）研究確定毒作用的靶器官確定損傷的可逆性其它：敏感檢測指標(biāo)和生物學(xué)標(biāo)志、毒作用機(jī)制、毒物動(dòng)力學(xué)、中毒的解救措施…第四節(jié)短期、亞慢性和慢性毒性作用一、蓄積作用—檢測方法概念蓄積作用（accumulation）：外來化合物進(jìn)入機(jī)體之后，經(jīng)代謝或原型排出體外，但當(dāng)其連續(xù)、反復(fù)進(jìn)入機(jī)體，而且吸收速度或總量超過代謝轉(zhuǎn)化與排出的速度或總量時(shí)，化合物就有可能在機(jī)體內(nèi)逐漸增加并貯留，這種現(xiàn)象稱為化合物的蓄積作用蓄積庫（depot）：化學(xué)物蓄積的組織器官部位。常見的蓄積庫包括：血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼概念物質(zhì)蓄積（materialaccumulation）：用分析方法能測得機(jī)體內(nèi)存在該化合物或其代謝產(chǎn)物，且隨接觸時(shí)間延長而增加功能(機(jī)能)蓄積(functionalaccumulation)

：在機(jī)體內(nèi)雖不能被測出，卻在長期接觸下出現(xiàn)了慢性中毒現(xiàn)象蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)一種外源化學(xué)物有無蓄積作用是評(píng)定該化學(xué)物是否可能引起潛在慢性中毒是論據(jù)之一，也是制定衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)安全系數(shù)的一種依據(jù)。目的

求外來化學(xué)物的蓄積系數(shù)了解蓄積毒性的強(qiáng)度為慢性及其它有關(guān)毒性試驗(yàn)提供劑量選擇依據(jù)方法理化方法：應(yīng)用化學(xué)分析或其他技術(shù)測定化學(xué)物進(jìn)入機(jī)體后在體內(nèi)含量變化的過程該方法可測定化學(xué)物的半衰期，故可作為檢測物質(zhì)蓄積的方法生物學(xué)方法：將多次染毒與一次染毒所產(chǎn)生的效應(yīng)進(jìn)行比較。所測蓄積性不能區(qū)分功能蓄積和物質(zhì)蓄積研究方法

蓄積系數(shù)法

：在一定期限之內(nèi)以低于致死劑量(<LD50)，每日給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，直至出現(xiàn)預(yù)計(jì)的毒性效應(yīng)(或死亡)為止，計(jì)算達(dá)到預(yù)計(jì)效應(yīng)的總累積劑量，求出累積劑量與一次接觸該化合物產(chǎn)生相同效應(yīng)的劑量的比值

.即為蓄積系數(shù)(K值)

√多用小鼠或大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一般以死亡為指標(biāo)

K=ＥD50(n)ＥD50(１)K=LD50(n)LD50(１)蓄積系數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)蓄積系數(shù)(K)蓄積作用分級(jí)<11~3~5~高度蓄積明顯蓄積中等蓄積輕度蓄積某些外源化學(xué)物的慢性中毒效應(yīng)無法用K值表示如多數(shù)有機(jī)磷化合物屬于輕度蓄積（K>5），但小劑量反復(fù)與機(jī)體接觸后，紅細(xì)胞和腦組織的乙酰膽堿酯酶可以持續(xù)降低，且伴有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀方法：（1）急性毒性實(shí)驗(yàn)LD50(1)

（2）1/20-1/5LD50每日染毒

LD50(n)

（50%動(dòng)物死亡時(shí)累計(jì)染毒的總量）（3）計(jì)算K值：K=LD50(n)/LD50(1)

若累計(jì)染毒量已達(dá)到5個(gè)LD50，動(dòng)物仍未死亡或死亡未達(dá)到半數(shù)，可終止實(shí)驗(yàn)，其Ｋ值按＞５作為結(jié)果。1.固定劑量法方法：（1）測定LD50(1)（2）第1-4天，先給予0.1LD50(1)，以后每4天遞增劑量1.5倍

LD50(n)（3）計(jì)算Ｋ值。

28天時(shí)死亡動(dòng)物仍未達(dá)到半數(shù)，可停止實(shí)驗(yàn)，此時(shí)的總量達(dá)到12.8LD50(1)，即Ｋ＞12.8，可認(rèn)為基本無蓄積。

２.遞增劑量法方法：分為1/2、1/5、1/10、1/20LD50四個(gè)劑量組和對照組，每組10只動(dòng)物，每天染毒一次，共染毒20天，觀察每組動(dòng)物死亡數(shù)量。結(jié)果判定：蓄積不明顯：各劑量組均無死亡；弱蓄積性：僅1/2LD50組有死亡，其它劑量組無死亡；中等蓄積性：1/20LD50組無死亡，其它各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系；強(qiáng)蓄積性：1/20LD50組有死亡，且有劑量反應(yīng)關(guān)系。

３.劑量固定的20天蓄積法研究方法

蓄積系數(shù)法

：在一定期限之內(nèi)以低于致死劑量(<LD50)，每日給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，直至出現(xiàn)預(yù)計(jì)的毒性效應(yīng)(或死亡)為止，計(jì)算達(dá)到預(yù)計(jì)效應(yīng)的總累積劑量，求出累積劑量與一次接觸該化合物產(chǎn)生相同效應(yīng)的劑量的比值

.即為蓄積系數(shù)(K值)

√多用小鼠或大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一般以死亡為指標(biāo)

K=ＥD50(n)ＥD50(１)K=LD50(n)LD50(１)生物半減期法：利用動(dòng)力學(xué)原理

生物半衰期法從上圖可以看出，一種化學(xué)物質(zhì)若以t1/2相等的時(shí)間間距染毒，其在體內(nèi)經(jīng)過6個(gè)t1/2的接觸期就可以基本上達(dá)到蓄積的極限，此時(shí)理論蓄積量達(dá)到極限的98.4%，此后即使繼續(xù)接觸該物質(zhì)，機(jī)體的蓄積量基本上也不會(huì)增加。重復(fù)劑量毒性作用/亞急性毒性作用指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人連續(xù)接觸外源化學(xué)物4周（28天）內(nèi)所產(chǎn)生的毒效應(yīng)。能初步確定相應(yīng)的NOAEL/LOAEL我國毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中內(nèi)容--食品、消毒劑、農(nóng)藥和新化學(xué)品二、短期毒性作用

三、亞慢和慢性毒性作用

外源化學(xué)物在長期重復(fù)染毒時(shí)可產(chǎn)生與急性毒性試驗(yàn)完全不同的毒作用隨著動(dòng)物的衰老，有些因素如組織易感性改變、代謝和生理功能的改變，以及自發(fā)性疾病等均可影響毒作用的性質(zhì)和程度。某些重要的疾病例如心臟病、慢性腎衰、腫瘤等均與年齡增長有關(guān)。外源化學(xué)物的蓄積作用是發(fā)生慢性毒性作用的基礎(chǔ)概念指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人連續(xù)較長時(shí)間接觸外來化合物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。subchronictoxicity：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人連續(xù)較長期（約相當(dāng)于生命周期1/10）接觸外源化學(xué)物所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)?？苫敬_定NOAEL/LOAEL，嚙齒類染毒90天，犬1年。chronictoxicity：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人長期接觸外源化學(xué)物引起的毒性效應(yīng)。嚙齒類染毒至少12個(gè)月，亦可至終身。Parkinson等(1995)報(bào)告117種藥品犬亞慢性(90天)和慢性(24月)毒性試驗(yàn)結(jié)果與大鼠(短期或長期毒性試驗(yàn))的結(jié)果比較，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)新的毒性資料，因此認(rèn)為動(dòng)物毒性試驗(yàn)長于6個(gè)月沒有必要，除非研究致癌作用Weil等（1969）報(bào)告，112種受試物中，大鼠染毒90天后才出現(xiàn)毒性效應(yīng)的只有3種，認(rèn)為大鼠90天實(shí)驗(yàn)即可確定受試物的NOAEL慢性毒性試驗(yàn)傾向于和致癌試驗(yàn)合并進(jìn)行試驗(yàn)?zāi)康挠^察長期接觸受試物的毒性效應(yīng)譜、毒作用特點(diǎn)、靶器官；探索受試物作用機(jī)制；觀察長期接觸受試物所致毒性作用的可逆性；確定長期接觸受試物所致毒作用的劑量－反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，確定其NOAEL和/或LOAEL，為制定人類接觸的安全限量提供依據(jù)；觀察不同動(dòng)物對受試物的毒效應(yīng)差異，為確定適當(dāng)?shù)陌踩禂?shù)，將結(jié)果外推到人提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和要求-亞慢性試驗(yàn)

※兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：嚙齒類（大鼠），非嚙齒類（犬）

※實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長：要求為斷乳不久的動(dòng)物，小鼠體重以15g、大鼠50-1０0g（<6周）左右為宜

※至少應(yīng)設(shè)計(jì)３個(gè)染毒劑量組及１個(gè)正常對照組，必要時(shí)再加一個(gè)受試化合物的溶劑對照組

衛(wèi)星組：試驗(yàn)中期解剖或試驗(yàn)結(jié)束后做恢復(fù)期觀察，額外設(shè)置的動(dòng)物組

※小動(dòng)物每組不少于２0只，大動(dòng)物每組不少于8只，分組要隨機(jī)化。動(dòng)物同性別個(gè)體初始體重相差應(yīng)不超過平均體重的±20%。一般雌雄兩性動(dòng)物同時(shí)分別進(jìn)行，各劑量組兩性動(dòng)物數(shù)相等

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和要求-亞慢性試驗(yàn)

※盡可能使用高等級(jí)動(dòng)物，在符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求的試驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行

※

預(yù)檢（1周）：適應(yīng)環(huán)境、篩檢健康等不合要求的動(dòng)物

※

給藥前禁食處理：減少殘留食物對毒物毒性的影響

※亞慢性試驗(yàn)的上限劑量，需控制在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸受試化合物的整個(gè)過程中，不發(fā)生死亡或僅有個(gè)別動(dòng)物死亡，但有明顯的中毒效應(yīng)，或靶器官出現(xiàn)典型的損傷。低劑量組不宜出現(xiàn)任何看觀察到的毒效應(yīng)。

具體劑量的設(shè)計(jì)參考LD50和人體實(shí)際攝入量如以化學(xué)物L(fēng)D50的1/201/5為最高劑量（或用人體擬用的最高劑量），高、中、低3個(gè)劑量間組距以2-4倍為遞減。藥品：大鼠—人臨床擬用劑量的10、30、100倍非嚙齒類：人臨床擬用劑量的5、15、50食品：盡可能涵蓋人體預(yù)期攝入量的100倍量（或動(dòng)物最大給予劑量）染毒途徑應(yīng)考慮兩點(diǎn)：（1）盡量模擬人類在環(huán)境中接觸該化合物的途徑或方式；（2）應(yīng)與預(yù)期進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)的接觸途徑相一致。常為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚三種受試物在飼料中的比例一般應(yīng)小于5%，最大不超過10%。當(dāng)摻入量超過5%時(shí)，要調(diào)整飼料的營養(yǎng)成分，使其比例盡量與對照組一致。一般為擬用臨床用藥期的2-3倍觀察時(shí)間90天亞慢實(shí)驗(yàn)染毒期90天染毒+恢復(fù)期觀察（28天）：觀察受試物所致毒性的可逆性、持續(xù)性和遲發(fā)型試驗(yàn)期間至少應(yīng)每天觀察一次動(dòng)物的一般表現(xiàn)、動(dòng)物出現(xiàn)中毒表現(xiàn)的體征、程度、持續(xù)時(shí)間和死亡情況等。觀察指標(biāo)-亞慢性試驗(yàn)一般綜合性觀察指標(biāo)：體重、食物利用率、中毒癥狀及出現(xiàn)各癥狀的先后次序、時(shí)間，臟器系數(shù)等一般化驗(yàn)指標(biāo)：主要指血常規(guī)和肝、腎功能的檢測病理學(xué)檢查：確定靶部位、損傷的性質(zhì)和程度食物利用率

動(dòng)物每吃100g食物所增長的體重克數(shù)，表示為體重（g）/飼料（100g）。喂飼染毒時(shí)，可計(jì)算實(shí)際染毒劑量。食物利用率可以鑒別動(dòng)物體重降低是由于進(jìn)食減少，還是受試物毒作用。例如：大鼠喂飼溴甲烷熏蒸過的食物2個(gè)月，其體重平均增加156.6g，而對照組大鼠平均體重增加180.9g，雖然前者體重增加較慢，但接觸組與對照組的食物利用率卻基本相同（接觸組為25.2，對照組為25.6），說明大鼠長期食用溴甲烷熏蒸過的食物，基本上不影響其對食物的吸收和利用，體重增長減慢可能是由于食欲下降或其它原因所致。系統(tǒng)尸檢和組織病理學(xué)檢查臟器稱重和臟器系數(shù)（relativeorganweight）：又稱臟器相對重量，指臟器濕重與單位體重的比值，通常是每100g體重中某臟器所占質(zhì)量，表示為臟器質(zhì)量(g)/體重(100g)。臟器適用于實(shí)質(zhì)性臟器，包括：心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸、卵巢等。臟器系數(shù)增大表示該臟器腫大，病變可能是增生、充血、水腫；臟器系數(shù)減小可能表示臟器發(fā)育不良或萎縮等變化。病理學(xué)檢查：包括肉眼（大體）檢查、病理切片檢查、免疫組織化學(xué)檢查、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)電鏡檢查等，分別從大體、組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞甚至分子水平等多個(gè)方面發(fā)現(xiàn)受試物的毒效應(yīng)。

特異性指標(biāo)指可反映受試物對機(jī)體毒作用本質(zhì)的特征性指標(biāo)，常與毒作用機(jī)制有關(guān)，有時(shí)可作為效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志。雙（3，5-二特丁基-4-羥基芐磷酸單乙酯）鎳鹽，結(jié)構(gòu)可分成三個(gè)部分：

①二個(gè)分子的五價(jià)磷化合物，該部分有抗膽堿酯酶作用；

②2，6-二特丁基酚的結(jié)構(gòu)，可誘導(dǎo)微粒體酶活性；

③作為一種有機(jī)鎳或鎳鹽，可致皮炎及皮膚過敏?？赡嫘杂^察目的：了解毒性反應(yīng)的可逆程度和可能出現(xiàn)的遲緩毒性末次給藥后24小時(shí)，每組活殺部分動(dòng)物，其余動(dòng)物停止染毒，繼續(xù)觀察2～4周，檢測各項(xiàng)指標(biāo)，重點(diǎn)觀察毒反應(yīng)器官。指標(biāo)觀察時(shí)間一般狀況和癥狀，每天觀察一次。飼料消耗和體重，每周記錄一次。試驗(yàn)周期小于3個(gè)月的，末次給藥后24小時(shí)和恢復(fù)期結(jié)束時(shí)各進(jìn)行一次全面檢查。試驗(yàn)周期大于3個(gè)月的，可在試驗(yàn)中期活殺少量動(dòng)物檢測各項(xiàng)指標(biāo)。瀕死或死亡動(dòng)物應(yīng)即時(shí)檢查。觀察指標(biāo)慢性毒性作用

chronictoxicity概念-慢性毒作用指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人長期（甚至終身）反復(fù)接觸外來化合物所出現(xiàn)的毒效應(yīng)時(shí)間:依受試物具體要求和動(dòng)物種類定大鼠1年狗1-2年如果與致癌試驗(yàn)結(jié)合進(jìn)行，染毒期限最好接近或等于動(dòng)物的預(yù)期生命試驗(yàn)?zāi)康挠^察長期接觸受試物的毒性效應(yīng)譜、毒作用特點(diǎn)、靶器官；闡明受試物慢性毒性的劑量－反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，確定其NOAEL和/或LOAEL，預(yù)測人群接觸該受試物后可能發(fā)生慢性毒性的危險(xiǎn)性，為制定人類接觸的安全限量提供依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和要求-慢性試驗(yàn)

※兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：嚙齒類，非嚙齒類

※

要求為初斷乳的動(dòng)物，小鼠出生后3周，體重1012g；大鼠出生后34周，體重5070g

※一般雌雄兩性動(dòng)物同時(shí)分別進(jìn)行，各劑量組兩性動(dòng)物數(shù)相等。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和要求-慢性

※至少應(yīng)設(shè)計(jì)３個(gè)染毒劑量組及１個(gè)正常對照組，必要時(shí)再加一個(gè)受試化合物的溶劑對照組

，小動(dòng)物每組40－60只，大動(dòng)物每組８－12只，分組要隨機(jī)化。如分批處死，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每劑量組每性別的嚙齒類動(dòng)物不少于10只，非嚙齒類動(dòng)物不少于４只；動(dòng)物同性別個(gè)體初始體重相差應(yīng)不超過平均體重的20%。

※盡可能使用高等級(jí)動(dòng)物，在符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求的試驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行

※劑量設(shè)置原則為：足夠高的劑量以能觀察到受試物的毒作用、闡明毒性靶器官同時(shí)試驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行；有明確的劑量－反應(yīng)關(guān)系，得到理想的LOAEL和NOAEL。

參考：亞慢LOAEL、LD50劑量選擇參考以亞慢性閾劑量或其1/5-1/2劑量為慢性毒性試驗(yàn)的最高劑量，以這一閾劑量的1/50-1/10為慢性毒性的預(yù)計(jì)閾劑量，并以其1/100為預(yù)計(jì)的慢性無作用劑量組以LD50為出發(fā)點(diǎn)，高、中、低三組分別為LD50的1/10、1/100、1/1000劑量間距一般為2-4倍（不超過10倍），以利于得到劑量-反應(yīng)關(guān)系，也有利于排除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體敏感性差異一般來說，當(dāng)預(yù)期受試物無明顯毒性時(shí)，亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)最高劑量(不進(jìn)行體重和體表面積換算)設(shè)計(jì)為至少等于人擬用最大劑量的倍數(shù)是：保健食品應(yīng)為100倍，中藥為50倍，純化學(xué)藥品為30倍當(dāng)以不同的劑量依據(jù)設(shè)計(jì)與較長期結(jié)果不一致時(shí)，需要根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)判斷，或增加劑量組以保證得到良好的劑量-反應(yīng)關(guān)系。試驗(yàn)期限-慢性12個(gè)月染毒期12個(gè)月染毒期+恢復(fù)期觀察（28天）：觀察受試物所致毒性的可逆性、持續(xù)性和遲發(fā)