第六章層析分離

食品生物技術(shù)精品課程主講：劉常金層析分離法層析分離法（第一講）第一講概述特點(diǎn)：（1）純化倍數(shù)高（2）操作規(guī)模小，放大困難（3）

終產(chǎn)品純化（4）適用于價格昂貴的產(chǎn)品層析分離分類（1）層析分離法第一講按溶質(zhì)分子與固定相相互作用機(jī)理吸附層析（范德華力，氫鍵，靜電力，共價力）分配層析（溶質(zhì)在兩液相間分配系數(shù)不同）凝膠過濾（分子大小與形狀）實(shí)驗(yàn)技術(shù)分類低壓（小于0.5Mpa)中壓(0.5-5Mpa)高壓(5-40Mpa)電泳(溶質(zhì)在電場中移動）層析分離分類（2）層析分離法第一講根據(jù)固定相形狀分類柱層析紙層析薄層層析根據(jù)流動相分類氣相層析液相層析超臨界流體層析按操作方式分類迎頭法（frontalanalysis)頂替法（displacementanalysis)洗脫分析（elutionanalysis)基本概念層析分離法第一講（1）分配系數(shù)溶質(zhì)在固定相與流動相濃度比值（2）解離常數(shù)吸附質(zhì)濃度與吸附劑濃度乘積與吸附復(fù)合物濃度比值（3）分離因素某一瞬間被吸附溶質(zhì)量占總量的分?jǐn)?shù)

(4)

阻滯因子分配層析溶質(zhì)移動速度與理想流動相移動速度（距離）比值

(5)

溶出體積在柱色層分離中，使溶質(zhì)從柱中流出時所通過的流動相體積

(6)

分辨率兩峰之間的距離與兩峰寬的平均什之比

(7)理論塔板流動相與固定相平均濃度達(dá)傳質(zhì)平衡時的一段柱高（8）溶量因子固定相中溶質(zhì)總量與流動相中溶質(zhì)總之比第一講層析分離法分配系數(shù)層析分離法第一講

Kd=C1/C1Kd為分配系數(shù)C1，C2為兩液相中的溶質(zhì)濃度。應(yīng)用條件：溫度一定低濃度分離度層析分離法第一講第一講層析分離法

Rf=

第一講層析分離法洗脫容積層析分離法第一講第一講層析分離法理論塔板第一講r＝nE/(E+1)時rmax＝nE/(E+1)最大濃度塔板rmax＝nE/(E+1)層析分離法第一講層析分離法思考題層析分離法第一講1想解概念：解離常數(shù)，分離因素，阻滯因子，理論塔板高度，洗膠體積，分辨率2不同的層析分類方法各有何意義？層析分離法（第二講）第二講層析分離法層析介質(zhì)層析分離法第二講要求：（1）不溶于流動相（2）化學(xué)穩(wěn)定（3）機(jī)械強(qiáng)度（4）大的表面積（5）粒度均勻?qū)游鼋橘|(zhì)種類無機(jī)（氧化鋁，硅膠，活性碳）有機(jī)（瓊脂糖，纖維素，聚丙烯酰胺）常用層析介質(zhì)層析分離法第二講氧化鋁：（活性氧化鋁）它是一種多孔性、高分散度固體（1）有很大的比表面積，其微孔表面具有吸附性能。（2）分子式AI2O3簡單，空間形態(tài)復(fù)雜，8種以上的形態(tài)（3）同一形態(tài)宏觀結(jié)構(gòu)性質(zhì)如密度、孔隙率、孔徑分布、比表面積等存在差異（4）吸附量與含水量關(guān)系很大制備：由氫氧化鋁加熱脫水得到的。吸附基團(tuán)：鋁離子種類：堿性：由氫氧化鋁高溫脫水，用于堿性穩(wěn)定的溶質(zhì)酸性：堿性氧化鋁經(jīng)鹽酸洗滌，用于在酸性穩(wěn)定的溶質(zhì)中性：堿性氧化鋁經(jīng)水洗后活化制得應(yīng)用：有機(jī)溶劑中分離天然成分第二講層析分離法硅膠層析分離法第二講硅膠是由多聚硅酸經(jīng)分子間脫水而形成的一種多孔性物質(zhì)（1）化學(xué)組成SiO2.XH20，（2）屬于無定形結(jié)構(gòu)，基本結(jié)構(gòu)質(zhì)點(diǎn)為Si一O四面體，相互堆積形成硅膠的骨架。質(zhì)點(diǎn)間的空間即為硅膠的孔隙。（3）硅膠中的水以羥基的形式和硅原子相連而覆蓋于硅膠表面。硅膠的分類（常以孔徑大小來分），(1)特細(xì)孔硅膠(0.8nm以下)。

(2)細(xì)孔硅膠（1.5—2.0nm)(3)中孔硅膠(4.0一5.0nm)(4)粗孔硅膠(10.nm以上)應(yīng)用：吸附層析劑與分配層析劑優(yōu)先吸附極性分子及不飽和的碳?xì)浠衔?，用于天然產(chǎn)物分離，可用在水溶液中或有機(jī)溶劑中瓊脂糖層析分離法第二講由海洋生物瓊脂提取得到的主要成分（1）中性不帶電（2）水溶性線狀多糖（3）高親水性，含大量羥基（4）能制成多孔性凝膠，分離大分子制備：（1）去除帶電瓊膠成分（2）將溶化的瓊脂糖采用懸浮,乳化或噴珠的方法制得珠狀介質(zhì)。（3）采用交聯(lián)劑增加介質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度

瓊脂糖的基本結(jié)構(gòu)單位和親水性凝膠結(jié)構(gòu)a瓊脂糖結(jié)構(gòu)b親水性凝膠結(jié)構(gòu)第二講層析分離法瓊脂糖（2）層析分離法第二講介質(zhì)商品種類Sepharose2B,Sepharose4B,Sepharose6B。經(jīng)過交聯(lián)而增加機(jī)械強(qiáng)度的瓊脂糖SepharoseCL-2B,SepharoseCL-4B,SepharoseCL-6B應(yīng)用水溶液中分離蛋白質(zhì)葡聚糖層析分離法第二講α-1,6相連的葡萄糖聚合物，由環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)得到珠粒性質(zhì)：（1）親水性比瓊脂糖高（羥基數(shù)多）（2）化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性好（3）孔度與機(jī)械強(qiáng)度與交聯(lián)度有關(guān)（4）用于凝膠過濾分子篩應(yīng)用：水溶液中分離蛋白質(zhì)等纖維素層析分離法第二講β-1,4相連的D-葡萄糖（偶而有1，6鍵合）線性天然高聚物（1）親水（2）微晶與無定型兩部分組成，缺乏孔度大孔珠狀纖維素（1）高孔度（2）高機(jī)械強(qiáng)度（3)親水性強(qiáng)應(yīng)用：離子交換分離蛋白質(zhì)介質(zhì)聚丙烯酰胺層析分離法第二講性質(zhì)：（1）丙烯酰胺與交聯(lián)劑N,N’-甲叉雙丙烯酰胺共聚（2）烷烴骨架與酰胺側(cè)鏈（3）控制交聯(lián)劑比例可控制網(wǎng)格孔度（4）親水好，但不如多糖介質(zhì)

(5)機(jī)械強(qiáng)度差應(yīng)用：（1）凝膠過濾（2）電泳介質(zhì)親和層析層析分離法第二講親和層析(AffinityChromatography)是利用生物體內(nèi)存在的特異性相互作用的分子對而設(shè)計(jì)的層析方法。生物體內(nèi)相互作用的分子對：(1)酶—底物或抑制劑(2)抗原—抗體。(3)激素—受體。(4)糖蛋白與凝集素,(5)生物素—生物素結(jié)合蛋白等基質(zhì)活化方法與配基偶聯(lián)層析分離法第二講活化(activation):

基質(zhì)（matrix）上的化學(xué)基團(tuán)是不活潑的,無法與配基直接偶聯(lián),通過化學(xué)反應(yīng)使介質(zhì)上化學(xué)基團(tuán)處于活化狀態(tài)。(1)大分子配基如蛋白質(zhì)等可與活化基質(zhì)直接偶聯(lián)。(2)小分子配基,在基質(zhì)與配基之間插入若干碳原子手臂(spacer),然后再與配基偶聯(lián)。(3)環(huán)氧氯丙烷,1,4－丁二醇縮水甘油醚本身是活化劑亦具有手臂作用。活化方法（1）層析分離法第二講A溴化氰法溴化氰在堿性條件下與多糖上的羥基反應(yīng)導(dǎo)入氰酯鍵或亞氨碳酸酯到基質(zhì)上,進(jìn)而與配基偶聯(lián)優(yōu)點(diǎn):（1）適用于含羥基多糖及含羥基的合成基質(zhì)（2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶聯(lián)（3）操作步驟簡單,重現(xiàn)性好。（4）偶聯(lián)條件溫和,特別適用于偶聯(lián)敏感性生物大分子。缺點(diǎn)：（1）形成的異脲鍵易產(chǎn)生非特異性吸附,（2）共價鍵不穩(wěn)定,配基容易脫落,（3）活化操作危險性大，反應(yīng)后的殘余液需經(jīng)處理再排放溴化氰活化與配基偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)式第二講層析分離法活化方法（2）層析分離法第二講B環(huán)氧氯丙烷活化（1）所形成的共價鍵穩(wěn)定,配基不易落脫（2）自動引入手臂,（3）有更小的非特異性吸附,（4）活化操作簡單易行,危險性相對較小缺點(diǎn)：在強(qiáng)堿性條件反應(yīng)，不適用于堿敏感物質(zhì)。環(huán)氧氯丙烷活化反應(yīng)式第二講層析分離法環(huán)氧基的氨化及偶聯(lián)配基反應(yīng)第二講層析分離法思考題層析分離法第二講1常用的層析介質(zhì)有哪些？各適用于何種狀況下的分離？2親和層析的機(jī)理是什么？層析法（第三講）第三講層析分離法活化方法（3）層析分離法第三講C對甲苯磺酰氯活化（1）用于活化含羥基基質(zhì),將羥基轉(zhuǎn)化為磺?；?在配基偶聯(lián)后容易脫落,不引入電荷。（2）配基與羥基間形成穩(wěn)定化學(xué)鍵。（3）活化操作需在無水丙酮環(huán)境中進(jìn)行。偶聯(lián)配基根據(jù)情況,既可在有機(jī)相中進(jìn)行,亦可在水相中進(jìn)行對甲苯磺酰氯活化反應(yīng)式第三講層析分離法手臂（spacer)層析分離法第三講作用：減少親和作用空間位阻連接：通過化學(xué)反應(yīng)與活化基團(tuán)連接手臂化合物：乙二胺NH2-CH2-CH2-NH2已二胺NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH26-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH環(huán)氧氯丙烷1，4-丁二醇縮水甘油醚D殘余電荷的掩蔽層析分離法第三講目的：防止產(chǎn)生非特異性吸附原理：通過化學(xué)反應(yīng)消除基團(tuán)上的電荷方法：（1）自發(fā)水解（2）氨基：醋酸酐（3）羧基：水溶性碳二亞胺手臂氨末端的掩蔽第三講層析分離法殘留羧基掩蔽反應(yīng)第三講層析分離法E活化基團(tuán)與配基密度測定層析分離法第三講方法：（1）氨基或羧基可用酸堿滴定。（2）有紫外吸收特征的,可用紫外分光法測定。（3）通過測定反應(yīng)余液中配基殘留量推算（偶聯(lián)率較高的情況）（4）某些情況下需將親和膠樣品分解破壞測定F親和介質(zhì)吸附容量測定層析分離法第三講方法：（1）流出曲線法：流出液中目標(biāo)蛋白濃度達(dá)到進(jìn)口濃度的90%（2）Langmiur吸附等溫線法層析裝置與操作層析分離法第三講裝置1

普通2高級柱操作（1）裝柱：均勻，無氣泡（2）平衡（equilibrium)：緩沖液,pH,鹽濃度（3）上樣(loading)：蛋白濃度，pH,鹽濃度，緩沖液（4）洗滌(washing)：pH,鹽濃度，洗滌劑，緩沖液（5）洗脫(elution)：條件與吸附相反（6）清洗(cleaning)：弱酸，弱堿，蛋白質(zhì)變性劑（尿素，鹽酸胍，硫氰酸鹽（7）再生：與平衡條件相同柱層析分離法的有關(guān)裝置第三講層析分離法

Pharmacia?KTA層析系統(tǒng)第三講層析分離法裝置層析分離法第三講泵混合器層析柱檢測器記錄儀分部收集器裝柱層析分離法第三講調(diào)糊：50%一次連續(xù)加入懸膠液打開出口閥：層析劑沉降排除空氣檢查均勻度上樣層析分離法第三講樣品處理：(1）溶解A調(diào)整濃度B鹽CpH(2)過濾：除去不溶物流速：根據(jù)樣品濃度與吸附速度而定上樣量：80%吸附容量淋洗層析分離法第三講鹽濃度pH表面活性劑（0.1-0.5%)淋洗體積：根據(jù)流出液雜蛋白濃度而定防止產(chǎn)物丟失又要除去雜質(zhì)洗脫方法層析分離法第三講按操作方式a恒定洗脫(isocraticelution)b分步洗脫(stageelution)c梯度洗脫(gradientelution)按洗脫機(jī)理專一性洗脫（specificelution）非專一性洗脫（nonspecificelution）添加劑：乙二醇,NaCNS、脲素、鹽酸胍洗脫體積：5倍床體積怛定洗脫第三講層析分離法分步洗脫第三講層析分離法

(c)梯度洗脫第三講層析分離法清洗與再生層析分離法第三講弱酸：HAC堿：氨水促溶劑：1-3MKCNS，6-8M尿素，6M鹽酸胍極性溶劑：20%乙醇表面活性劑：吐溫-80緩沖液平衡思考題層析分離法第三講1配基偶聯(lián)后殘留電荷對分離有何影響？如何消除？2小分子配基為何需插入手臂？3層析柱洗脫方式有幾種？各適用于何種情況？層析分離法（第四講）第四講層析分離法無機(jī)吸附劑層析分離法第四講羥基磷轔石(hydroxyapatite,Ca10(PO4)6(OH)2)（1）純化蛋白質(zhì)的無機(jī)介質(zhì)。（2）廉價，易于大規(guī)模應(yīng)用，（3）使用后易于清潔吸附機(jī)理與規(guī)律：偶極離子作用而不是離子交換作用(1)每一個正電荷區(qū)周圍都有負(fù)電荷區(qū)，反之亦然.

（2）蛋白質(zhì)在中性pH范圍具有最大的形成毗鄰正負(fù)離子的可能性。第四講層析分離法工藝條件層析分離法第四講吸附：(1)pH在6—9之間（2）低濃度緩沖液離子（通常是磷酸鹽）（3）低鹽濃度洗脫：（1）增加緩沖液濃度（2）高鹽濃度中進(jìn)行（3）鹽可以采用恒定或梯度形式應(yīng)用。層析分離法第四講

(1)光合作用中重要的輔助色素(2)可作為熒光探針(3)天然色素(4)調(diào)節(jié)和激活免疫反應(yīng)吸附：1mm,PH6.8磷酸緩沖液(I.8cm×4cm)層析柱上樣量:2mL洗脫：磷酸鹽緩沖液1、5、50、l00、200mm，PH6.8，+0.1MNaCl溶液洗脫速度:18mL/h分步收集洗脫液(每管約4mL)第四講層析分離法疏水層析層析分離法第四講將疏水性基團(tuán)如丁烷、辛烷、苯固定化到介質(zhì)上,這些基團(tuán)會與蛋白質(zhì)生物大分子上的疏水區(qū)親和介質(zhì)制備：瓊脂糖在有機(jī)溶劑中用CDI(羰基二咪唑)活化后再與芳胺或烷胺形成酰胺鍵得到疏水層析介質(zhì)介質(zhì)配基密度:40—80μmol/ml膠,吸附容量：牛血清蛋白(BSA)大于40mg/ml疏水層析介質(zhì)制備過程示意圖第四講層析分離法工藝條件層析分離法第四講吸附：(1)鹽濃度：高鹽，1—2M(NH4)2SO4

或NaCl(2)pH:中性或偏酸性淋洗：0.5—2%表面活性劑洗脫:(1)低鹽，0.1—0.5MNaCl,再配合pH變化。(2)低濃度促溶劑,0.1—0.5%NaSCN,或20—40%乙二醇疏水層析實(shí)驗(yàn)方案：第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法第四講層析分離法固定化金屬離子親和層析（ImmobilizedMetalIonAffinityChromatography）層析分離法第四講亞氨二醋酸鹽與環(huán)氧活化的瓊脂糖偶合,可以形成一種帶有雙羧甲基氨基瓊脂糖,進(jìn)而與過渡金屬離子(Cu2+,Zn2+Ni2+)牢固螯合,形成穩(wěn)定的吸附活性中心吸附機(jī)理：金屬螯合介質(zhì)能與蛋白質(zhì)中的組氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巰基結(jié)合工藝條件層析分離法第四講吸附：(1)pH中性(2)低鹽(3)金屬離子洗脫：(1)降低pH(2)提高鹽濃度(3)緩沖液中加入螯合劑EDTA基因蛋白質(zhì)的組氨酸插入第四講層析分離法第四講層析分離法層析分離法第四講吸附：Ni2+親和pH:7.5洗脫：7.5-4.0梯度第四講層析分離法共價層析層析分離法第四講共價層析是根據(jù)巰基化合物與層析劑上二硫鍵的共價化學(xué)反應(yīng)而設(shè)計(jì)的谷胱甘肽型二硫鍵層析劑與巰丙基型二硫鍵層析劑(a)谷胱甘肽二硫鍵層析劑（b）巰丙基型二二硫鍵層析劑第四講層析分離法靠巰基二硫鍵作用的共價層析分離過程吸附過程（b）洗脫過程（c）再生過程第四講層析分離法苯基硼酸鹽與1，2順二元醇化合物的反應(yīng)第四講層析分離法層析分離（第五講）第五講層析分離法谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）共價層析層析分離法第五講（1）將GST基因結(jié)合到目標(biāo)蛋白基因上制成表達(dá)融合蛋白（2）用谷胱甘肽親和介質(zhì)吸附GST目標(biāo)蛋白（3）用酶切除GST，得到純化目標(biāo)蛋白第五講層析分離法苯硼酸共價層析層析分離法第五講利用硼原子與鄰二羥基結(jié)構(gòu)的糖形成共價五元環(huán)結(jié)構(gòu)吸附：（1）pH8-9（2）高鹽促進(jìn)苯基吸附洗脫：pH3-4,Tris緩沖液，甘露醇應(yīng)用：糖蛋白，核苷酸，多糖苯基硼酸鹽與1，2順二元醇化合物的反應(yīng)第五講層析分離法蛋白質(zhì)的離子交換層析層析分離法第五講層析介質(zhì)：DEAE-纖維素，CM-纖維素吸附條件：

(1)緩沖液pH(2)蛋白濃度控制（5mg/ml)（3）離子強(qiáng)度

(4)道南效應(yīng)(Donnaneffect)介質(zhì)內(nèi)外鹽濃度及

pH不同

(5)上樣量：1-5%BV，高徑比20:1,L：100cm(恒定洗膠）；5-10%qm,柱長度20-40cm,高徑比5：1（分步或梯度）洗脫：恒定，分步，梯度pH梯度：a緩沖量大；b離子強(qiáng)度變化；cpH變化大層析分離法第五講第五講層析分離法第五講層析分離法第五講層析分離法染料親和層析層析分離法第五講活性染料常有蒽醌或萘衍生物,含有一個或多個氨基或磺酸基。其結(jié)構(gòu)類似某些酶的底物（NAD中ADP—核酸的結(jié)構(gòu)類似物）特點(diǎn):(1)蛋白結(jié)合容量大,是天然配基的10—100倍(2)廉價易得。(3)具有普遍適用性。(4)配基的偶聯(lián)方法簡單,易于操作,可大規(guī)模應(yīng)用。(5)染料的光譜特征可用來檢測柱中染料濃度。(6)蛋白質(zhì)洗脫容易，(7)染料配基在使用中有可能水解從基質(zhì)上脫落而殘留到產(chǎn)品中。機(jī)理層析分離法第五講（1）NAD中ADP—核酸的結(jié)構(gòu)類似物（2）離子交換（磺酸基，氨基）（3）疏水作用（芳香基團(tuán)）（4）金屬離子，染料和蛋白質(zhì)之間形成三元絡(luò)合物工藝條件層析分離法第五講吸附：（1）低的PH時結(jié)合更為牢固（2）配體濃度調(diào)整染料配體的濃度可以改變純化因子洗脫

（1）洗脫方式：可用脈沖、分段、梯度．（2）洗脫劑的選擇：磷酸鹽、輔酶和核苷酸、底物、多元醇、表面活性劑及pH等第五講層析分離法第五講層析分離法應(yīng)用層析分離法第五講染料的選擇CibacronB1ueF3G—A(CB)染料可用來純化NAD依賴的脫氫酶:a核苷酸依賴的脫氫酶，b·各種激酶，包括水解酶，乙酰基轉(zhuǎn)移酶，磷酸水解轉(zhuǎn)移酶，RNA和DNA核酸酶和限制性核酸內(nèi)切酶等，c．肌球蛋白，各種血蛋白及干擾素等．ProcionRedHE—3B，適于純化對NADP依賴的脫氫酶則更有親和性層析分離法第五講吸附20mM,PH7.0磷酸緩沖液洗脫：含鹽緩沖液、洗脫液進(jìn)一步用凝膠層析回收率45%凝膠層析法（GelFiltrationChromatography）層析分離法第五講又稱凝膠排阻層析,分子篩層析法,凝膠過濾法等。是根據(jù)溶質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離的方法特點(diǎn)：（1）操作方便,不會使物質(zhì)變性。（2）層析介質(zhì)不需再生,可反復(fù)便用（3）容量比較低（4）一般在最后的處理中被使用。原理：不同大小分子在多孔凝膠中阻滯力不同第五講層析分離法第五講層析分離法葡聚糖凝膠(Sephadex)的理化性質(zhì)層析分離法第五講(1)排阻極限

(exclusionlimit)是指不能擴(kuò)散到凝膠基質(zhì)內(nèi)部中去的最小分子的分子量(2)分級范圍

(Fractionationrange)它指出了當(dāng)溶液通過凝膠柱時,能夠?yàn)榻橘|(zhì)阻滯并且分離的溶質(zhì)分子量范圍(SephadexG—50,它的分級范圍為1500—30000)(3)吸水量

(Waterregains)1g干凝膠所吸收的水分稱為吸水量G-50的吸水量為5.0±0.3g(4)凝膠粒徑凝膠顆粒一般為球形100-200目(50-150μm)(5)床體積

(Bedvolume)表示1g干膠在溶脹后所具有的最后體積(SephadexG-50的床體積為9—11ml/g干凝膠)(6)空隙體積

(Voidvolume)表示填充柱中凝膠粒子周圍的總空間(藍(lán)色葡聚糖測出)凝膠層析操作層析分離法第五講A凝膠選擇：

選型：脫鹽：G-10,G-15,G25，分級：G-50，G-100，G-150

粒度：分粗(相當(dāng)于50目),中(100目),細(xì)(200目),極細(xì)(300目)四種粗,中用于生產(chǎn)上層析,細(xì)者用于科研溶脹:干燥凝膠加水或緩沖液在燒杯浸泡吸水,靜置，篩選。層析分離法第五講B裝柱(1)柱長選擇：細(xì)長柱，脫鹽：柱高50cm；分級:100cm。(2)裝柱:均勻性:a藍(lán)色葡聚糖－T2000溶液過柱，觀察色帶均勻下降。a對光檢查C加樣(1)除去不溶物(2)樣品濃度：濃度大些為好(3)上樣體積：分析1-2%床體積;制備20-30%(4)樣品自然流進(jìn)凝膠后，加洗脫液，防止返混層析分離法第五講D洗脫(1)洗脫液：洗脫液成份應(yīng)與膨脹膠所用的液體相同(2)操作壓：SephadexG-100，2.4—9.4kPa,而G－200凝膠則為0.4—0.6kPa。(3)洗脫液分步收集E凝膠再生和保養(yǎng)(1)多次使用后重新填裝。(2)短期不用,加0.02%疊氮化鈉(NaN3)(3)長期不用,酒精浸泡脫水需然后60—80℃烘干。(4)離子交換葡聚糖凝膠：陰離子凝膠0.5mol/LHCl溶液水洗0.5mol/LNaOH水洗。陽離子凝膠處理次序相反。應(yīng)用層析分離法第五講（1）脫鹽（2）分級分離（3）分子量測定lgMW與Ve

成線性關(guān)系思考題層析分離法第五講1苯硼酸親和介質(zhì)用于分離哪些目標(biāo)物？原理是什么?2道南效應(yīng)對離子交換樹脂產(chǎn)生怎樣的影響?3凝膠層析分離機(jī)理是什么?4染料親和層析的分子機(jī)制是什么?電泳(electrophoresis)層析分離法第五講特點(diǎn)：（1）分辯率高（2）電場作用（3）多用于分析雙電層的形成第五講層析分離法電泳與電滲層析分離法第五講電滲（electroosmosis）:在電場作用下，液體對毛細(xì)管表面電荷作相對運(yùn)動。電泳(electrophoresis):

在電場作用下，帶電顆粒在溶液中的運(yùn)動。電滲示意圖第五講層析分離法離子在毛細(xì)管周圍的分布運(yùn)動第五講層析分離法電泳理論基礎(chǔ)層析分離法第五講遷移率：單位電場