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文檔簡介
重亞硫酸鹽測序操作方案一、樣品收集1、配制2%低熔點(diǎn)瓊脂糖稱取0.02g低熔點(diǎn)瓊脂糖,倒入1.5mL離心管中,隨后加入1mLmPBS溶液,置于100℃金屬浴中反復(fù)加熱并顛倒混勻至完全溶解,取出4℃保存待用。2、收集細(xì)胞樣品80℃以上熱水浴使低熔點(diǎn)瓊脂糖溶化。向1.5mL離心管底部加入8μL低熔點(diǎn)瓊脂糖,避免產(chǎn)生氣泡。迅速吸取細(xì)胞樣品吹入瓊脂糖中,冷卻后加入500μL礦物質(zhì)油覆蓋。最后將離心管在熱水浴中短暫浸泡使瓊脂糖小球成型,取出-20℃保存待用。二、亞硫酸氫鹽修飾3、配制DNA細(xì)胞裂解液:向20mLTE緩沖液中加入100μL的20mg/ml蛋白酶K。4、向含樣品的離心管內(nèi)加入500μLDNA細(xì)胞裂解液,50℃金屬浴8h以上,以消化樣品。5、在上一步消化進(jìn)行的同時(shí)配制轉(zhuǎn)化液,注意避光亞硫酸氫鈉4.75g雙蒸水4.5mL2MNaOH3.5mL對苯二酚0.138g共計(jì)10mL6、消化完成后,將離心管取出,換液清洗使小球變性:0.3MNaOH,500μL,15min,2次;0.1MNaOH,1mL,5min,1次。7、換液加入500μL轉(zhuǎn)化液,50℃金屬浴8h以上,以轉(zhuǎn)化樣品,注意避光。8、用TE緩沖液中止轉(zhuǎn)化,1mL,15min,6次。9、用0.2MNaOH脫磺化,500μL,15min,2次。10、用TE緩沖液中止脫磺化,1mL,15min,3次。11、用雙蒸水清洗,1mL,10min,2次。12、清洗完成,用槍頭吸取瓊脂糖小球轉(zhuǎn)移至200μL離心管中,-20℃保存待用。三、甲基化基因的PCR13、使用設(shè)計(jì)好的兩對甲基化特異性引物對轉(zhuǎn)化后的DNA樣品進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。步驟預(yù)變性變性退火延伸終延伸降溫溫度94℃94℃55~65℃72℃72℃4℃時(shí)間2min30s30s30s2min∞第一輪反應(yīng)體系25μL,轉(zhuǎn)化后瓊脂糖小球計(jì)為2μLDNA。第二輪反應(yīng)體系擴(kuò)大為50μL。試劑25μL反應(yīng)體系50μL反應(yīng)體系2×TaqMasterMix12.525RNase-FreeWater8.519ForwardPrimer,10μM12ReversePrimer,10μM12TemplateDNA2214、將第二輪反應(yīng)產(chǎn)物全量加入膠孔中,跑膠時(shí)盡量跑完全程以分離雜帶。在紫外燈下找到目的條帶,快速精確切取,將膠塊放入1.5mL離心管內(nèi)。四、膠回收15、對膠塊稱重,向離心管內(nèi)加入3倍膠體積(0.1g=100μL)QGBuffer,50℃金屬浴至膠融化,同批樣品可統(tǒng)一為450μL,以便于離心。16、加入1倍膠體積(150μL)異丙醇,顛倒混勻后將液體移入離心柱離心,13000g,1min。17、倒掉收集管內(nèi)液體,向離心柱內(nèi)加入500μLQGBuffer,再次離心,13000g,1min。18、倒掉收集管內(nèi)液體,加入750μLPEBuffer,靜置2min,再次離心,13000g,1min。19、更換收集管再次離心,13000g,1min,倒置離心柱在濾紙上晾干2min,再插入新收集管。20、將25μLEBBuffer精確加至離心柱中心內(nèi)膜,靜置3min后離心,18000g,10min。21、取少量收集管內(nèi)DNA溶液檢測樣品濃度(分光光度計(jì)或跑膠檢測),余下-20℃保存待用。微量分光光度計(jì):測定DNA濃度并記錄,連接T載體時(shí)稀釋各組至合適的統(tǒng)一濃度。跑膠:取5μLDNA樣品與1μL6×loadingbuffer混合,點(diǎn)樣跑膠檢測目的條帶,依據(jù)目的條帶亮度決定連接T載體時(shí)的DNA上樣量。(亮1μL;中等2μL;弱3μL)五、克隆測序22、預(yù)先制冰,將pMD18-TVectorCloningKit冰上解凍,依次向200μL離心管內(nèi)添加:高DNA濃度中DNA濃度低DNA濃度T載體1μL1μL1μLDNA樣品1μL2μL3μL雙蒸水3μL2μL1μL共計(jì)5μL混勻后,加入5μLSolutionI;再次混勻,放入PCR儀中16℃連接8h。23、在上一步連接進(jìn)行的同時(shí),配制LB/AMP培養(yǎng)基(1)配制LB液體培養(yǎng)基(200mL)1%(w/v)Tryptone2g0.5%(w/v)YeastExtract1g1%(w/v)NaCl2g定容后,加入200μL2MNaOH將pH值調(diào)至7.0,混勻后移入玻璃瓶內(nèi)。(2)配制LB固體培養(yǎng)基(200mL)再配制200mLLB液體培養(yǎng)基,隨后倒入含3g瓊脂粉的燒杯中,(3)將兩種培養(yǎng)基與玻璃棒、涂板小桿等一同高壓滅菌。(4)高壓后冷卻至40~50℃時(shí),向200mLLB固體培養(yǎng)基內(nèi)加入200μL100mg/mLAmpicillin,向150mLLB液體培養(yǎng)基內(nèi)加入150μL100mg/mLAmpicillin,剩余50mL不加Ampicillin。(5)搖勻LB固體培養(yǎng)基,取90mm培養(yǎng)皿分裝,每盤內(nèi)倒入約20mL。(6)待培養(yǎng)基凝固后,進(jìn)行涂板。每板加入50μL20mg/mLX-Gal與20μL50mg/mLIPTG,混合后涂抹均勻,避光晾干備用。24、轉(zhuǎn)化感受肽(1)連接完成后,將10μL樣品全量加入含100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞的1.5mL離心管內(nèi)。(2)輕輕混勻后冰上放置30min,42℃金屬浴激發(fā)90s,冰上冷卻2min,操作時(shí)避免劇烈晃動(dòng)。(3)加入900μL不含Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基,放入搖床,37℃,150g,培養(yǎng)1h以上。25、養(yǎng)菌待搖床上離心管內(nèi)菌液長好(充滿液體),取100μL菌液滴入凝固的培養(yǎng)基并涂抹均勻。將涂板倒置在搖床內(nèi),37℃,避光,保濕,避風(fēng),培養(yǎng)12h以上,待菌斑長至直徑1mm左右。此時(shí)培養(yǎng)基上白斑可用,藍(lán)斑淘汰。可將培養(yǎng)基直接封口,送樣測序,也可進(jìn)一步挑菌培養(yǎng)。26、挑菌用槍頭挑取單個(gè)陽性克隆菌落混入加有1mL含Ampicillin的LB液
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