臨床微生物學(xué)-細(xì)菌耐藥性檢測

細(xì)菌耐藥性抗生素的給人類帶來的福與禍福抗生素的使用使全人類的平均壽命增加了10歲。禍細(xì)菌耐藥嚴(yán)重出現(xiàn)超級細(xì)菌合理使用抗生素！?。≈饕獌?nèi)容2抗菌藥物敏感試驗1

臨床常用抗菌藥物種類和作用3

細(xì)菌耐藥機(jī)制

細(xì)菌耐藥檢測43思考題1.beta內(nèi)酰胺類抗生素有哪些？其抗菌機(jī)理是什么？2.氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和氯霉素抗生素抗菌機(jī)理3.抗生素敏感試驗中B組藥物在何種情況下可以選用？4.紙片擴(kuò)散法（K-B)藥敏實(shí)驗的原理和影響因素？5.藥敏實(shí)驗結(jié)果為S、I、R的意義是什么？6.何為MIC?何為E實(shí)驗？7.聯(lián)合藥敏實(shí)驗結(jié)果為拮抗作用、無關(guān)作用、累加作用和協(xié)同作用的意義分別是什么？思考題12.K-B法藥敏試驗所用的培養(yǎng)基是什么？接種的菌液濃度一般為多少？培養(yǎng)基的厚度、pH一般為多少？13.肉湯稀釋法藥敏試驗所用的培養(yǎng)基是什么？接種細(xì)菌的終濃度一般為多少？腸桿菌科細(xì)菌藥敏檢測的質(zhì)控菌株是什么？14.瓊脂稀釋法所用的的培養(yǎng)基是什么？接種的菌液濃度一般為多少？培養(yǎng)基的厚度、pH一般為多少？15.何為MIC50和MIC90？抗菌藥物發(fā)現(xiàn)史上幾個重要的里程碑德國藥物學(xué)家Domagk發(fā)現(xiàn)百浪多息--第一個合成的磺胺類藥物，使現(xiàn)代醫(yī)學(xué)進(jìn)入化療新時代。英國細(xì)菌學(xué)家Fleming發(fā)現(xiàn)微生物的拮抗作用，20世紀(jì)醫(yī)學(xué)界最偉大的創(chuàng)舉。1929年1932年抗生素時代的開創(chuàng)——青霉素的發(fā)現(xiàn)抗菌藥物發(fā)現(xiàn)史上幾個重要的里程碑Chain和Florey接受美國政府的邀請，進(jìn)行青霉素的研究開發(fā)，發(fā)明可供人體注射用的青霉素，開創(chuàng)了化療新時代。美國科學(xué)家Waksman發(fā)現(xiàn)鏈霉素，奠定了從微生物代謝產(chǎn)物中尋找抗生素的基礎(chǔ)，造就了抗生素發(fā)展的黃金時代。1940年1942年臨床常用抗菌藥物抗菌藥物發(fā)現(xiàn)史上幾個重要的里程碑Batchelor和1961年Abraham等分別分離出青霉素母核6-APA（6-氨基青霉烷酸）和頭孢菌素母核7-ACA(7-氨基頭孢烷酸），開創(chuàng)了半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的新時代。應(yīng)用微生物篩選和青霉素結(jié)構(gòu)改造獲得β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，有效地控制了產(chǎn)酶菌引起的感染。1959年1973年臨床常用抗菌藥物臨床常用抗菌藥物β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物

氨基糖甙類抗菌藥物大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物四環(huán)素類抗菌藥物氯霉素類抗菌藥物林可酰胺類抗菌藥物（作用機(jī)制似紅霉素）糖肽類抗生素（萬古霉素等）喹諾酮類抗菌藥物磺胺類抗生素（干擾葉酸合成，核酸合成受抑）呋喃類抗生素(干擾氧化還原酶系統(tǒng)，代謝阻斷）Beta-內(nèi)酰胺類抗菌藥物概念：化學(xué)結(jié)構(gòu)式中具有內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素。臨床常用抗菌藥物抗菌作用靶位存在于所有細(xì)菌細(xì)胞膜的表面，在細(xì)菌細(xì)胞壁合成中主要起各種細(xì)胞壁合成酶(轉(zhuǎn)糖基酶、轉(zhuǎn)肽酶、D-羧肽酶、內(nèi)肽酶等)的作用，均是-內(nèi)酰胺類抗生素潛在的靶標(biāo)。其數(shù)量、分子大小及與-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力隨細(xì)菌種類不同而不同。青霉素結(jié)合蛋白(penicillinsbindingproteins,PBPs)臨床常用抗菌藥物Beta-內(nèi)酰胺類抗菌藥物與青霉素結(jié)合蛋白（penicillinbindingproteins,PBPs)結(jié)合，抑制PBPs（有轉(zhuǎn)肽酶等酶的作用）活性作用，進(jìn)而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。繁殖期殺菌抗菌作用機(jī)制β內(nèi)酰胺類抗菌藥物作用機(jī)制2023/2/1515Beta-內(nèi)酰胺類抗菌藥物青霉素類頭孢菌素類頭霉素類單環(huán)內(nèi)酰胺類(monobactams)碳青霉烯類抗生素(carbapenems)β內(nèi)酰胺酶抑制劑種類青霉素類(Penicillins)抗生素四個原子的

-內(nèi)酰胺環(huán)和五個原子噻唑環(huán)引入不用的基團(tuán)有不同的效應(yīng)有天然青霉素、耐酶青霉素、廣譜（氨基組、羧基組、脲基組）青霉素Penicillins種類和抗菌活性耐青霉素酶青霉素甲氧西林methicillin

苯唑西林oxacillin

氯唑西林cloxacillin等天然青霉素:青霉素G、青霉素V（不穩(wěn)定）作用于不產(chǎn)青霉素酶的革蘭陽性球菌、革蘭陰性菌和厭氧性細(xì)菌。Penicillins種類和抗菌活性氨基組:作用于青霉素敏感菌，大部分大腸埃希菌，奇異變形桿菌，流感嗜血桿菌。包括氨芐西林(ampcillin)、阿莫西林(amoxicillin)。

羧基組：作用于產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科和假單胞菌，對氨芐西林無效的革蘭陰性桿菌，協(xié)同氨基糖苷類抗生素對腸球菌抑菌作用,包括羧芐西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)廣譜青霉素Penicillins種類和抗菌活性脲基組：對銅綠假單胞菌有抑制作用,包括美洛西林(mezlocillin)、阿洛西林(azlocillin)和哌拉西林(piperacillin)。頭孢菌素類(cephalosporins)抗生素是一類廣譜半合成抗生素，具有抗菌作用強(qiáng)、耐青霉素酶、臨床療效好、毒性低、過敏反應(yīng)較青霉素類少見等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)抗菌譜、對β內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性以及發(fā)現(xiàn)時間的先后將其分為五代。

抗菌作用G＋菌G-菌1stgen.cephalosporin＋－2ndgen.cephalosporin3rdgen.cephalosporin－4thgen.Cephalosporin＋＋5thgen.Cephalosporin＋＋

Cephalosporins種類及抗菌活性1stgeneration

對革蘭陽性菌有較強(qiáng)的作用,包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、厭氧鏈球菌,但對耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)、腸球菌、耐青霉素的肺炎鏈球菌耐藥。對革蘭陰性桿菌如大腸埃希菌、克雷伯菌中度敏感,對假單胞菌、變形桿菌、沙雷菌和腸桿菌屬耐藥。作用菌頭孢噻啶(cephaloridine，先鋒2號)頭孢噻吩(cephalothin，先鋒1號)頭孢氨芐(cephalexin，先鋒4號)頭孢唑啉(cefazolin，先鋒5號)頭孢拉啶(cephradine,先鋒6號)頭孢匹林(cephaprin,先鋒8號)頭孢羥氨芐(cefadroxil)藥名Cephalosporins種類及抗菌活性2ndgeneration

對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌（包括耐氨芐西林菌株）活性強(qiáng)。多孢孟多（cefamandole)頭孢呋辛(cefuroxime,zinacef,西力欣)、頭孢尼西(cefonicid)頭孢雷特(ceforanide)頭孢克洛(Cefaclor,頭孢氯氨芐)頭孢丙烯(Cefprozil)作用菌藥名Cephalosporins種類及抗菌活性3rdgeneration

對革蘭陰性腸桿菌科和銅綠假單胞菌具有強(qiáng)大的抗菌活性;對第一、二代頭孢菌素耐藥的革蘭陰性菌敏感;第三代口服頭孢菌素對革蘭陰性及陽性菌具有更廣譜的抗菌活性,但所有口服藥對腸球菌、銅綠假單胞菌及不動桿菌無抗菌活性。注射用:頭孢噻肟(cefotaxime,claforan,凱復(fù)隆)頭孢曲松(ceftriaxone,頭孢三嗪,菌必治)、頭孢唑肟(ceftizoxime,epocelin)頭孢他啶(ceftazidime,fortum,復(fù)達(dá)欣)頭孢哌酮(cefoperazone,Cefobid,先鋒必)口服用:頭孢克肟(cefixime)頭孢布坦(ceftibuten)頭孢迪尼(cefdinir)頭孢泊肟(cefpodoxime)

作用菌藥名Cephalosporins種類及抗菌活性4thgeneration對葡萄球菌抗菌活性強(qiáng)，對產(chǎn)ESBL和AmpC酶的革蘭陰性菌效果好。頭孢匹羅(cefpirome)頭孢匹美(cefepime)（又稱頭孢吡肟）和cefclidin作用菌藥名Cephalosporins種類及抗菌活性5thgeneration對MRSA在內(nèi)的G+具有強(qiáng)大的抗菌作用，同時保持了與最近幾代頭孢菌素相當(dāng)?shù)目笹-的活性頭孢洛林(cefpirome)作用菌藥名

β內(nèi)酰胺酶抑制劑作用：能抑制β內(nèi)酰胺酶的活性，與β內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用能增強(qiáng)后者的抗菌活性。種類：主要有舒巴坦（sulbactam)、克拉維酸(clavulanic)、三（他）唑巴坦(tazobactam)。β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑青霉素+-內(nèi)酰胺抑制劑：作用于產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性和陽性細(xì)菌。包括：①氨芐西林-舒巴坦ampicillin-sulbactam(unasyn);②替卡西林-克拉維酸(即替美丁)ticacillin-clavulanate(Timentin);③阿莫西林-克拉維酸(即安美汀)amoxicillin-clavulanate(Augmentin);④哌拉西林-他唑巴坦piperacillin-tazobactam。氨基糖苷類(aminoglycosides)作用機(jī)制：作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體30S小亞基，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，并破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。對靜止期細(xì)菌的殺滅作用較強(qiáng)，是一靜止期殺菌劑。種類：鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素、丁胺卡那、奈替米星等副作用：腎毒性和耳毒性抗菌譜：主要為革蘭陰性桿菌，鏈球菌和腸球菌對其天然耐藥。大環(huán)內(nèi)酯類（macrolides）作用機(jī)制：作用于細(xì)菌核糖體50S大亞基，通過阻斷轉(zhuǎn)肽作用和mRNA位移而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。種類：紅霉素，乙酰螺旋霉素，羅紅霉素等不良反應(yīng)：主要不良反應(yīng)為胃腸道反應(yīng)。抗菌譜：革蘭陽性菌和少數(shù)革蘭陰性菌，對支原體、衣原體、螺旋體等有良好的作用。四環(huán)素類(tetracyclines)作用機(jī)制：藥物與細(xì)菌體內(nèi)30S核糖體亞單位在A位上特異性結(jié)合，阻止氨基酰-tRNA與mRNA核糖體的受位位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制肽鏈延長和蛋白質(zhì)合成。此外，藥物可引起細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的改變，使胞內(nèi)的核苷酸和其他重要成分外漏，迅速抑制DNA的復(fù)制。種類：四環(huán)素，土霉素，多西環(huán)素，米諾環(huán)素等副作用：胃腸道反應(yīng)，對兒童的牙齒和骨骼的發(fā)育有影響?？咕V：對革蘭陽性菌的作用優(yōu)于革蘭陰性菌，對支原體、衣原體、立克次體、螺旋體等有效。腸球菌耐藥。作用機(jī)制：作用于細(xì)菌70S核糖體的50S亞基，抑制轉(zhuǎn)肽酶，使肽鏈的伸長受阻，從而抑制菌體蛋白的合成。抗菌譜：廣譜抑菌劑，對革蘭陰性菌的作用較革蘭陽性菌強(qiáng)。副作用：骨髓抑制、再生障礙性貧血等等氯霉素類(chloramphenicols)抗菌機(jī)制：拮抗細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，從而阻斷細(xì)菌DNA的復(fù)制而產(chǎn)生快速殺菌作用。種類：臨床上常用的為氟喹諾酮類藥物抗菌譜：革蘭陰性桿菌和革蘭陽性球菌不良反應(yīng)：主要為消化道反應(yīng)，其次是神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)。喹諾酮類(quinolones)臨床常用抗菌藥物臨床常用抗菌藥物β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物

氨基糖甙類抗菌藥物大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物四環(huán)素類抗菌藥物氯霉素類抗菌藥物林可酰胺類抗菌藥物（作用機(jī)制似紅霉素）糖肽類抗生素（萬古霉素等）喹諾酮類抗菌藥物磺胺類抗生素（干擾葉酸合成，核酸合成受抑）呋喃類抗生素(干擾氧化還原酶系統(tǒng)，代謝阻斷）抗菌藥物敏感性實(shí)驗（antimicrobialsusceptibilitytest，AST)目的：1.預(yù)測抗菌治療效果（S、R、I）2.指導(dǎo)抗菌藥物的臨床應(yīng)用3.發(fā)現(xiàn)或提示細(xì)菌耐藥機(jī)制的存在4.監(jiān)測細(xì)菌耐藥性、分析其變遷如何進(jìn)行抗菌藥物選擇？我國根據(jù)美國NCCLS（Nationalcommitteeforclinicallaboratorystandards，NCCLS），2005年后稱CLSI（Clinicalandlaboratorystandardsinstitute)制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。CLSI將抗菌藥物的選擇分成五組：A組：對特定菌群常規(guī)測試并常規(guī)報告的抗菌藥物。B組：對于臨床重要的，特別是針對醫(yī)院感染的藥物，常規(guī)測試但選擇性報告的抗菌藥物?？咕幬锏倪x擇對A組藥物過敏、耐受或無效的菌株。特定標(biāo)本來源的菌種：如腦脊液中腸桿菌科細(xì)菌報告對三代頭孢的敏感性，對泌尿道的分離腸桿菌株報告TMP/SMZ結(jié)果。多種細(xì)菌感染。不同病原菌多部位感染。為流行病學(xué)調(diào)查目的向感染控制組報告。B組藥物報告指征抗菌藥物的選擇C組：替代或補(bǔ)充性抗菌藥物，選擇性報告的藥物。

可以在以下情況下進(jìn)行C組藥物試驗：對基本（A、B組）藥物耐藥或過敏的菌株少見菌的感染為流行病學(xué)目的向感染控制組報告。抗菌藥物的選擇U組：僅用于治療泌尿道感染的抗菌藥物。除泌尿道，其他感染部位分離出的病原菌不用此組藥物。O組（Other）：對檢測菌有臨床指征、但一般不允許常規(guī)試驗和報告的藥物。Inv組（Investigational）：做研究用但尚未得到FDA批準(zhǔn)的藥物?？咕幬锏倪x擇抗菌藥物的選擇2023/2/15432023/2/1544臨床常用抗菌藥物

藥敏結(jié)果的判斷？依據(jù)CLSI的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷藥物常規(guī)用量治療有效即抗菌藥物在患者感染部位通常所能達(dá)到的濃度可抑制分離菌株的生長。藥物常規(guī)用量無效即抗菌藥物在患者感染部位通常所能達(dá)到的濃度不能抑制分離菌株的生長。敏感（Susceptible）耐藥（Resistance）結(jié)果判斷(CLSI的定義)抗菌藥物在生理濃集的部位具有臨床效力藥物生理濃集部位有效(尿-FQ)加大用藥劑量可能有效緩沖區(qū)：防止操作的系統(tǒng)誤差造成重大結(jié)果的判定錯誤中介(Intermediate)結(jié)果判斷(CLSI的定義)藥敏試驗常用的方法紙片擴(kuò)散法（Diskdiffusion）稀釋法（DilutionTest）

肉湯稀釋法（常量法和微量法）

瓊脂稀釋法E試驗將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測試菌的生長被抑制從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度并與該藥對測試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系紙片擴(kuò)散法（K-B法）原理2023/2/15492023/2/15涂布接種細(xì)菌502023/2/1551紙片擴(kuò)散法的步驟水解酪蛋白（MH）培養(yǎng)基，pH7.2～7.4，制備成瓊脂厚度4mm，直徑90mm的平板；挑取孵育16～24小時已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。

紙片擴(kuò)散法的步驟用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液；然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度；最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；平板在室溫下干燥3～5min，用無菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣大于15mm。紙片擴(kuò)散法的步驟35℃孵育16～24小時量取抑菌圈直徑；根據(jù)抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀，報告敏感、中介、耐藥。2023/2/15552023/2/15562023/2/15562023/2/15572023/2/15572023/2/15582023/2/1558紙片擴(kuò)散法影響因素接種菌量紙片抗菌藥物含量、有效性培養(yǎng)基成分、瓊脂的厚度孵育溫度、時間操作因素等紙片擴(kuò)散法材料與判斷抗菌藥物紙片：直徑6.0--6.35mm，吸水量為

20μl的濾紙。培養(yǎng)基：MH瓊脂，pH7.2--7.4，瓊脂厚度4mm菌液濃度和接種：0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?5min內(nèi)接種完畢。結(jié)果判斷與報告：S（敏感）、I（中介）、

R（耐藥）質(zhì)控：采用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行藥敏質(zhì)控。2023/2/15質(zhì)量控制：采用質(zhì)控菌株

腸桿菌科細(xì)菌：大腸埃希菌ATCC25922ATCC35218

銅綠假單胞菌：大腸埃希菌ATCC25922ATCC35218

銅綠假單胞菌ATCC27853

不動桿菌等：大腸埃希菌ATCC25922ATCC35218

銅綠假單胞菌ATCC27853

葡萄球菌屬：金黃色葡萄球菌ATCC25923

大腸埃希菌ATCC35218

腸球菌屬：糞腸球菌ATCC29212

紙片擴(kuò)散法61稀釋法1.肉湯稀釋法用MH肉湯將抗菌藥物作不同濃度的稀釋后,再接種待測菌，定量測定抗菌藥物抑制或殺滅待測細(xì)菌的最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration，

MIC）或最低殺菌濃度（minimalbactericidalconcentration,MBC）。稀釋法—肉湯稀釋法培養(yǎng)基：CLSI推薦調(diào)節(jié)了鈣離子濃度的MH肉湯，pH7.2--7.4藥物稀釋：

藥物原液：用直接購于藥廠的高純度藥粉配置，濃度不低于1000μg/ml或10倍于最高測試濃度，-60℃儲存，不超過6個月

稀釋液：蒸餾水、磷酸鹽緩沖液、NS等

藥物的稀釋：2倍稀釋菌種終濃度：5×105CFU/ml（用0.5麥?zhǔn)蠞岫染合♂專┙Y(jié)果判斷：在試管或小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為最小抑菌濃度（MIC）。2023/2/15抗生素2倍系列稀釋滴加定量菌液642023/2/15

64321684210.50.250.125652023/2/1566稀釋法2.瓊脂稀釋法將不同濃度抗菌藥物分別混勻于瓊脂培養(yǎng)基中，配制出含各種濃度藥物的平板，使用微量多頭接種器接種細(xì)菌，孵育后觀察細(xì)菌在含不同濃度藥物的平板上的生長情況，以抑制細(xì)菌生長的平板所含的藥物濃度測得最低抑菌濃度（MIC)2023/2/1567稀釋法—瓊脂稀釋法培養(yǎng)基：MH瓊脂，pH7.2~7.4含藥瓊脂的配制：藥物溶液與培養(yǎng)基的比為1:9，瓊脂厚度3-4mm菌液濃度：0.5麥?zhǔn)蠞岫染合♂?0倍，多頭接種器接種（每接種點(diǎn)1-2μl）。結(jié)果判斷：MIC，MIC50、MIC902023/2/15被測菌在含定量藥物的瓊脂上生長69了解兩個概念抑制50%試驗菌株的最低藥物濃度。MIC90:MIC50:抑制90%試驗菌株的最低藥物濃度。2023/2/1571

藥物濃度

4 8 163264ug/ml制備含對倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點(diǎn)種菌，104CFU/每個點(diǎn)，孵育，判讀結(jié)果瓊脂稀釋法71瓊脂稀釋法優(yōu)缺點(diǎn)

金標(biāo)準(zhǔn)精確可靠可同時測定多株菌（60株）細(xì)菌生長情況可查優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)測多個藥時勞動強(qiáng)度大制備平皿費(fèi)時費(fèi)力E試驗（Epsilometertest）是一種結(jié)合了稀釋法和擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)測定細(xì)菌對抗菌藥物的敏感度的定量技術(shù)。原理：E試條是一種寬5mm、長50mm的商品化塑料試條，一面固定有干化、穩(wěn)定的、濃度呈連續(xù)指數(shù)分布的抗菌藥物，另一面有藥物的濃度刻度讀數(shù)（μg/ml）?？咕幬锾荻确秶话銥?5-20個自然對數(shù)。2023/2/15E試驗原理(MIC,μg/ml)742023/2/15752023/2/15細(xì)菌的接種和加樣：同K-B法

厚度4mm的MH平板，用0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木和坎冀臃N，直徑9cm的平板可放兩條藥敏試驗條。結(jié)果判斷與報告：76E-test法優(yōu)缺點(diǎn)連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關(guān)性好影響因素少，穩(wěn)定性高操作簡單，省時優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)昂貴用途：快生長菌，苛養(yǎng)菌，厭氧菌，酵母菌，分枝桿菌聯(lián)合藥敏試驗一、棋盤稀釋法聯(lián)合藥敏試驗（定量）二、聯(lián)合藥敏實(shí)驗結(jié)果：1、無關(guān)作用(聯(lián)合活性等于單獨(dú)活性）3、累加作用：聯(lián)合活性等于單獨(dú)活性相加。4、協(xié)同作用：聯(lián)合活性顯著大于單獨(dú)活性的總和2、拮抗作用（聯(lián)合活性低于單獨(dú)活性）自動化儀器檢測細(xì)菌的天然耐藥有些菌屬或者菌種對某些抗菌藥物天然耐藥或者固有耐藥，該耐藥性具有種屬特異性1）腸球菌屬：對除青霉素，氨芐西林外的所有青霉素類，頭孢菌素類抗生素天然耐藥2）嗜麥芽窄食單胞菌：亞胺培南，美羅培南3）肺炎鏈球菌：氨基糖苷類4）產(chǎn)期腸桿菌和陰溝腸桿菌：頭孢西丁5）克柔念珠菌：復(fù)康唑6）肺炎克雷伯菌：氨芐西林7）銅綠假單胞菌：氨芐西林，阿莫西林，復(fù)方新諾明，頭孢一代，頭孢二代細(xì)菌的耐藥性和產(chǎn)生機(jī)制細(xì)菌的耐藥性：天然耐藥、獲得性耐藥細(xì)菌獲得性耐藥產(chǎn)生的機(jī)制：1、產(chǎn)生水解酶、修飾酶

β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生（水解酶）

修飾酶等的產(chǎn)生（氨基糖甙類修飾酶

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、紅霉素酶和其他滅活酶）

2、藥物作用靶位的改變（PBP、核糖體等）

3、抗菌藥物滲透障礙（外膜孔蛋白減少、生物膜的形成）

4、藥物泵出（主動外排泵）臨床上常見的耐藥菌MRSA：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌VRSA：耐萬古霉素金黃色葡萄球菌VRE：耐萬古霉素腸球菌ESBLs：超光譜內(nèi)酰胺酶KPC酶：產(chǎn)碳青烯酶的一種KPC型臨床上常見的耐藥菌臨床上常見的耐藥菌臨床上常見的耐藥菌臨床上常見的耐藥菌及結(jié)果的修正和解讀臨床上常見的耐藥菌及結(jié)果的修正和解讀臨床上常見的耐藥菌及結(jié)果的修正和解讀細(xì)菌的耐藥性和產(chǎn)生機(jī)制細(xì)菌的耐藥性：天然耐藥、獲得性耐藥細(xì)菌獲得性耐藥產(chǎn)生的機(jī)制：1、產(chǎn)生水解酶、修飾酶

β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生（水解酶）

修飾酶等的產(chǎn)生（氨基糖甙類修飾酶

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、紅霉素酶和其他滅活酶）

2、藥物作用靶位的改變（PBP、核糖體等）

3、抗菌藥物滲透障礙（外膜孔蛋白減少、生物膜的形成）

4、藥物泵出（主動外排泵）細(xì)菌的耐藥性的檢測方法一、耐藥性表型檢測1、β-內(nèi)酰胺酶檢測2、超廣譜β內(nèi)酰胺酶(extendedspectrumbeta-lactamases,ESBLs)、AmpC酶、碳青霉烯酶的檢測3、MRS的檢測4、D試驗－可誘導(dǎo)的克林霉素耐藥試驗5、氨基糖苷類高水平耐藥和萬古霉素耐藥腸球菌的檢測二、耐藥基因檢測：PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP、DNA測序等

β-內(nèi)酰胺酶

β內(nèi)酰胺酶是一類水解青霉素、頭孢菌素類抗生素的滅活酶；該酶位于革蘭陽性球菌菌體外，革蘭陰性桿菌間質(zhì)中。常見有廣譜酶、超廣譜β內(nèi)酰胺酶、金屬酶、AmpC酶等。檢測方法有微生物培養(yǎng)法、碘－淀粉法、頭孢硝噻吩紙片法。其中頭孢硝噻吩紙片法因為簡單、方便、快速，應(yīng)用于臨床檢測。（1）頭孢硝基噻吩顯色法（Nitrocefin）：制配紙片→滅菌水濕潤→涂測試菌于紙片上，10min觀察紙片顏色，顯紅色為陽性（葡萄球菌應(yīng)放置1h內(nèi)觀察）。簡單、方便、快速，應(yīng)用于臨床檢測。（2）酸度法：青霉素→β-內(nèi)酰胺酶水解→青霉酸、pH6.8以下→酚紅指示劑由紅色（構(gòu)櫞酸鈉緩沖液pH8.5）變?yōu)辄S色。（3）碘測定法：β-內(nèi)酰胺酶破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)，碘與破壞后的β-內(nèi)酰胺結(jié)合，使蘭色的淀粉—碘復(fù)合物轉(zhuǎn)變成無色。（4）儀器測定法：Vitek、Microscan的藥物測試卡中均帶有檢酶功能。β-內(nèi)酰胺酶的檢測2023/2/1597頭孢硝噻吩紙片法檢測β-內(nèi)酰胺酶(nitrocefintest)（+）超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）ESBLs是指由質(zhì)粒介導(dǎo)的能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)內(nèi)酰胺類氨曲南的一類酶；ESBLs不能水解頭霉素類和碳青霉烯類藥物，能被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦等內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制；ESBLs主要見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也見于腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、沙雷菌屬等其他腸桿菌科細(xì)菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌。（1）紙片擴(kuò)散初篩：頭孢他啶（30μg/片）抑菌圈≤22mm

頭孢噻肟（30μg/片）抑菌圈≤27mm

頭孢曲松（30μg/片）抑菌圈≤25mm

氨曲南（30μg/片）抑菌圈≤27mm（2）雙紙片協(xié)同確認(rèn)試驗：頭孢他啶（30μg/片）與頭孢他啶（30μg）/克位維酸（10μg）頭孢噻肟（30μg/片）與頭孢噻肟（30μg）/克拉維酸（10μg）兩紙片抑菌圈相比≥5mm即為ESBLS。ESBLS的檢測2023/2/15100紙片擴(kuò)散法檢測ESBLS:

項目初步篩選試驗表型確證試驗培養(yǎng)基MH瓊脂MH瓊脂抗生素紙片濃度頭孢泊肟10g頭孢他啶30g

頭孢他啶30g頭孢他啶/棒酸30/10g

氨曲南30g和頭孢噻肟30g頭孢噻肟30g

頭孢曲松30g頭孢噻肟/棒酸30/10g接種按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法的規(guī)定進(jìn)行孵育條件35C,空氣孵育時間16~18h結(jié)果判讀頭孢泊肟17mm對2個中任何一個藥頭孢他啶22mm物,加棒酸后,抑菌環(huán)直氨曲南27mm徑與不加棒酸的抑菌頭孢噻肟27mm環(huán)相比，增大值5mm

頭孢曲松25mm時,判定為ESBL產(chǎn)生

意味著可疑有ESBL

2023/2/15101ESBLs初篩和確證試驗雙紙片協(xié)同試驗初篩ESBLs表型確證試驗檢測ESBLsESBLs初篩試驗超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）（3）稀釋法，出現(xiàn)以下一種情況即可懷疑該菌株產(chǎn)生ESBLs：頭孢他啶或頭孢噻肟或頭孢曲松或氨曲南MIC≥2mg/mL或頭孢泊肟MIC≥8mg/mL

（4）E-test法（濃度梯度法）：由瑞典ABBiodisk公司研究生產(chǎn)，廣洲貝肯公司經(jīng)銷。試條中的三代頭孢菌素或氨曲南的MIC≥2μg/ml即可疑為ESBLS。（5）儀器測定法：Vitek,microscan和BD-PHOEMXTM微生物分析儀均可測試ESBLS。（6）利用分子生物學(xué)技術(shù)（PCR、DNA探針等）及分析酶底物譜及抑制物譜、生物化學(xué)技術(shù)等檢測技術(shù)可對ESBLS做出確診。ESBLS的檢測2023/2/15104檢測ESBLs碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定義為具有水解碳青霉烯類抗生素活性的β-內(nèi)酰胺酶，主要分布于β-內(nèi)酰胺酶A、B、D類中。根據(jù)水解機(jī)制中作用位點(diǎn)的不同可以將碳青霉烯酶分為兩大類：一類稱為金屬碳青霉烯酶，這類酶以金屬鋅離子為活性作用位點(diǎn)，可以被EDTA抑制，屬于B類β-內(nèi)酰胺酶；另一類以絲氨酸（Ser）為酶的活性作用位點(diǎn)，可以被酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦所抑制，屬于A、D類β-內(nèi)酰胺酶。2023/2/15106碳青霉烯酶A類酶B類酶D類酶染色體編碼：SMENMCIMI質(zhì)粒編碼：KPCGES質(zhì)粒編碼OXA-23OXA-24OXA-51OXA-58OXA-55OXA-48OXA-50OXA-60OXA-62金屬酶，位于GMEs上，包括VIM，IMP，GIM，SPM，SIM等可以被酶抑制劑抑制可以被EDTA抑制碳青霉烯酶表型檢測方法-改良hodge試驗ATCC25922，0.5麥?zhǔn)希?:10稀釋涂MH平板平皿中心貼10μg厄他培南或亞胺培南紙片10μl環(huán)挑取3-5個被測菌落從平板中心紙片邊緣向平板邊緣劃線被測菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌環(huán)交匯處大腸埃希菌生長增強(qiáng)，即產(chǎn)碳青霉烯酶。改良hodge試驗的結(jié)果判讀金屬酶表型檢測方法：EDTA協(xié)同試驗用0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇郎y菌懸液涂布MH平板。貼IMP(10μg)紙片．距其1cm處貼EDTA紙片（0.5mol/L4μl）。35℃過夜培養(yǎng)。亞胺培南抑菌圈在靠近加EDTA紙片側(cè)明顯擴(kuò)大者為產(chǎn)金屬酶菌株。

亞胺培南EDTA10mm1.初篩：（1）頭孢西?。?0μg/片）與頭孢西?。?0μg）/鄰氯西林（200μg）。后者比前者的抑菌圈≥5mm即疑為Ampc。（2）5種紙片篩選：馬斯平、泰能、頭孢西汀、頭孢他啶與頭孢他啶/克拉維酸。如頭孢西汀≤18mm，對馬斯平、泰能敏感即疑為產(chǎn)Ampc，如頭孢他啶與其酶抑制劑的抑菌圈≥5mm可能產(chǎn)ESBLS。2.確認(rèn)試驗（頭孢西汀三維水相試驗法）Ampc酶檢測2023/2/15111何為MRS?？2023/2/15112MRS：即對甲氧西林或苯唑西林或頭孢西丁耐藥的葡萄球菌。包括：MRSA（methicillinresistantstaphylococci)MRCNS(methcillinresistantcoagulasenegativestaphylococci)2023/2/15113

特點(diǎn)：MRS對所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，常表現(xiàn)為多重耐藥。MRS耐藥機(jī)制

耐甲氧西林金