純培養(yǎng)與顯微技術(shù)

純培養(yǎng)與顯微技術(shù)第一頁，共六十二頁，2022年，8月28日第二章純培養(yǎng)與顯微技術(shù)第二頁，共六十二頁，2022年，8月28日微生物的分離和純培養(yǎng)

1.無菌技術(shù)

2.用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

3.用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

4.單細胞（孢子）分離

5.選擇培養(yǎng)分離

6.二元培養(yǎng)物顯微鏡和顯微技術(shù)

1.顯微鏡的種類及原理

2.顯微觀察樣品的制備第三頁，共六十二頁，2022年，8月28日微生物個體：小利用群體研究屬性群體形式繁衍、保存人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)繁殖得到的微生物群體為培養(yǎng)物第四頁，共六十二頁，2022年，8月28日培養(yǎng)物純培養(yǎng)物混合培養(yǎng)物純培養(yǎng)能較好地得到重復結(jié)果，是微生物研究的重要技術(shù)之一第五頁，共六十二頁，2022年，8月28日顯微技術(shù)是微生物研究的另一項重要技術(shù)個體小第六頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)無菌技術(shù)（aseptictechnique)

分離、轉(zhuǎn)接、純化時防止其他微生物污染的技術(shù)第七頁，共六十二頁，2022年，8月28日試管、燒瓶、培養(yǎng)皿等常用器皿滅菌方法有：高壓蒸汽滅菌、高溫干熱、煮沸一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物培養(yǎng)常用器皿及滅菌第八頁，共六十二頁，2022年，8月28日接種針或接種環(huán)分離或?qū)⑽⑸飶囊粋€培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)接到另一個，無菌操作。火焰旁邊、超凈臺或無菌室進行。接種環(huán)采用迅速加熱和冷卻的鎳鉻合金制備液體培養(yǎng)物用無菌移液管或移液器一、微生物的分離和純培養(yǎng)接種操作，最基本技術(shù)第九頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)超凈臺火焰旁無菌區(qū)第十頁，共六十二頁，2022年，8月28日用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)各種菌落一、微生物的分離和純培養(yǎng)菌落(colony)：單個微生物在固體培養(yǎng)基或內(nèi)層）生長繁殖形成肉眼可見的，有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞生長群體。菌落連成片為菌苔（lawn）第十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征（形狀、顏色等），是微生物分類、鑒定的重要依據(jù)。第十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)第十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日同一細菌在不同的培養(yǎng)平板上形成不同的特征菌落一、微生物的分離和純培養(yǎng)第十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日克?。╟lone)：一個單細胞繁殖形成的菌落，即一個純種細胞群或克隆。固體培養(yǎng)基：瓊脂或其他凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基。平板：即培養(yǎng)平板（cultureplate)。融化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿冷卻凝固后即為平板，用于分離、培養(yǎng)微生物。一、微生物的分離和純培養(yǎng)第十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日稀釋平板法（pourplatemethod)

將細菌或其他微生物無菌水梯度稀釋，取少量與冷卻至50℃固體培養(yǎng)基混合，搖勻，倒入培養(yǎng)皿，凝固，倒置培養(yǎng)24小時，就會出現(xiàn)菌落。一、微生物的分離和純培養(yǎng)常用固體分離純培養(yǎng)方法：第十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)稀釋平板法第十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日涂布平板法（spreadplatemethod)

稀釋平板法因為細菌與50℃培養(yǎng)基混合導致某些熱敏感菌死亡，及好氧菌埋在培養(yǎng)基中缺乏氧氣影響生長，所以更常用涂布平板法。一、微生物的分離和純培養(yǎng)常用固體分離純培養(yǎng)方法：第十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)涂布平板法第十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日平板劃線分離法（streakplatemethod）

接種環(huán)沾取少許微生物，在無菌平板扇形、平行等劃線，隨劃線次數(shù)增加而分散開，得到單菌落。平板劃線分離一、微生物的分離和純培養(yǎng)第二十頁，共六十二頁，2022年，8月28日第二十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日稀釋搖管法(dilutionshakeculturemethod）厭氧微生物可用此法進行純培養(yǎng)分離。操作：盛培養(yǎng)基試管加熱融化，冷卻至50℃，待分離材料用這些試管梯度稀釋，搖勻，冷凝，石蠟封口一、微生物的分離和純培養(yǎng)第二十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日厭氧微生物分離裝置：一、微生物的分離和純培養(yǎng)厭氧罐厭氧手套箱第二十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)：一、微生物的分離和純培養(yǎng)有些微生物液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)，原生動物、藻類。方法稀釋法：接種物在液體培養(yǎng)基中順序稀釋，高度稀釋，每個試管中分配不到一個。若稀釋后同一梯度的平行試管中大多數(shù)（>95％）沒有，那么有微生物的可能是純培養(yǎng)，否則可能性下降。第二十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日顯微分離法直接分離單細胞或單個個體培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)一、微生物的分離和純培養(yǎng)單細胞（單孢子）顯微分離：稀釋法缺點分離的優(yōu)勢菌顯微操作儀，專業(yè)程度高第二十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日對某微生物生長需要了解后，設(shè)計適合其生長繁殖的培養(yǎng)基，抑制其他菌生長，即使該微生物在混雜群體中很少也可分離。一、微生物的分離和純培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離方法：第二十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日選擇培養(yǎng)基直接分離一、微生物的分離和純培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離方法：如：耐高溫菌采用高溫篩選；蛋白酶產(chǎn)生菌加牛奶篩選；抗抗生素可采用加抗生素篩選待分離的微生物生長，其它微生物的生長被抑制第二十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離方法：富集培養(yǎng)特定的環(huán)境條件僅適應于該條件的微生物旺盛生長待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加從自然界中分離到所需的特定微生物第二十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日根據(jù)微生物的特殊要求，從自然界分離出特定已知微生物種類分離培養(yǎng)在特定環(huán)境中能生長的微生物富集培養(yǎng)第二十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)二元培養(yǎng)物：培養(yǎng)物只含兩種微生物，并有意識保持兩者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物為二元培養(yǎng)物。如：病毒－－宿主，原生動物－－細小微生物第三十頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：為何保藏如何保藏性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進行。要求：菌種不死，不污染，不變中國微生物菌種保藏委員會（CCCCM)，中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），美國典型菌種保藏中心（ATCC）等第三十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：如何保藏根據(jù)菌種特性和保藏目的不同，給特定環(huán)境使其存活而得以保存連續(xù)移種或改變環(huán)境條件：干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)等第三十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日斜面：可保存數(shù)周至數(shù)年，可用石蠟或橡皮塞封口，低溫延長保存時間液體：菌苔制成菌懸液，低溫（懸液保藏法）缺點：繁瑣、易污染、變異喪生原有特性一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：傳代保藏斜面、半固體瓊脂柱、液體第三十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：冷凍保藏液氮保藏、低溫冰箱等液氮可達－196℃，效果較好注意：速凍，減少冰晶損傷細胞第三十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、微生物的分離和純培養(yǎng)微生物菌種保藏技術(shù)：干燥保藏沙土管保藏、冷凍真空干燥保藏沙土管：產(chǎn)孢子菌。制成孢子懸液，加無菌沙土管，減壓抽干水分，石蠟封口，冰箱保存。冷凍真空干燥：加保護劑樣品預先冷凍，真空冰升華去水，低溫保存，保存數(shù)十年，目前最普遍、最重要的方法，菌種保藏中心多采用此法。菌種保藏時采用不同手段保藏，防止某種方法失敗導致菌種喪失。第三十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)決定顯微觀察效果重要因素：分辨率和反差分辨率：辨別兩點之間最小距離的能力反差：樣品與背景區(qū)別程度普通顯微鏡機械裝置：鏡座、支架、載物臺、調(diào)焦螺旋光學系統(tǒng)：物鏡、目鏡、聚光器

普通顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖顯微鏡種類和原理：第三十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)光學顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)是多少？為什么？目鏡：10~15╳；物鏡：100╳；總放大倍數(shù)1000~1500╳；如何實現(xiàn)光學顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)？其原理？使用油鏡，即在100╳物鏡和載玻片之間滴加香柏油；香柏油與玻璃折射率相近第三十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)

0.5l分辨率（最小可分辨距離）=————nsinq分辨率與所用波長成反比！第三十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)分辨率與所用波長成反比！第三十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日N：玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率空氣（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）顯微觀察時可根據(jù)物鏡的特性而選用不同的介質(zhì)二、顯微鏡和顯微技術(shù)第四十頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)光線在穿過折射率不同的介質(zhì)時發(fā)生折射第四十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)浸沒油與玻璃的折射率相近很多原來由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。第四十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日暗視野顯微鏡二、顯微鏡和顯微技術(shù)活細菌在普通顯微鏡下是透明，觀察不清，采用暗視野顯微鏡，如：黑夜看星星就很清楚。

暗視野顯微鏡結(jié)構(gòu)與照明示意圖第四十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日暗視野顯微鏡二、顯微鏡和顯微技術(shù)特殊聚光器實現(xiàn)斜射照明，給樣品照明的光線不直接穿過物鏡，而經(jīng)樣品反射或折射后進入物鏡，使樣品與背景差別大，可以清楚看到透明微小顆粒。用于：生活細菌運動性觀察。第四十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日相差顯微鏡二、顯微鏡和顯微技術(shù)第四十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日相差顯微鏡二、顯微鏡和顯微技術(shù)光線透過透明標本，波長（顏色）和振幅（亮度）沒有多大變化，用普通顯微鏡觀察透明標本，其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)難以分辨。細胞各部分折射率和厚度不同，當光線通過時，直射光和衍射光光程有差別，而人眼看不到，但是可通過相差顯微鏡看到。相差顯微鏡采用特殊光學裝置：環(huán)狀光闌和相差板，利用光的干涉，將光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢姷恼穹睿靼担?，使能不染色而看到活細胞及細胞?nèi)的某些顯微結(jié)構(gòu)。其發(fā)明人F.Zernike因此獲1953年諾貝爾物理獎。第四十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日熒光顯微鏡二、顯微鏡和顯微技術(shù)熒光素吸收uv放出波長較長的可見光，因此在uv照射下，發(fā)熒光的物體會在黑暗背景顯現(xiàn)為光亮有色物體，為熒光顯微技術(shù)原理。在免疫學和分子生物學應用廣泛。第四十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)熒光顯微鏡第四十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)透射電子顯微鏡（簡寫TEM）用波長短的電磁波取代可見光，使分辨率提高。工作原理類似，因光源不同，有區(qū)別:電子若遇空氣中分子會發(fā)生偏轉(zhuǎn)使物象不清楚，因此鏡筒高真空2)電子帶電荷，電鏡是用電磁圈使之聚焦3)電子像人眼看不到，用熒光屏顯示或感光膠片記錄第四十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日大腸桿菌透射電子顯微鏡圖第五十頁，共六十二頁，2022年，8月28日掃描電子顯微鏡（SEM）掃描電子顯微鏡大腸桿菌掃描電鏡圖二、顯微鏡和顯微技術(shù)工作原理與光學顯微鏡和透射電子顯微鏡不同，是電子束掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，電子產(chǎn)生多少與標本表面立體形貌有關(guān)。電子經(jīng)探測器收集，經(jīng)光電倍增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上。主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu)第五十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日掃描隧道顯微鏡（STM）二、顯微鏡和顯微技術(shù)80年代出現(xiàn)的，原理：利用量子力學中的隧道效應。其橫向分辨率：0.1～0.2nm，縱向分辨率：0.001nm這種分辨率足以對單個原子觀察。利用這種顯微鏡直接觀察蛋白質(zhì)、DNA、RNA等以及CM、virus等結(jié)構(gòu)。第五十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日廚房抹布上的細菌和霉菌棉纖維上的汗垢掃描隧道顯微鏡下的DNA第五十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日顯微樣品制備二、顯微鏡和顯微技術(shù)樣品好壞直接影響觀察結(jié)果?？紤]因素：根據(jù)所用顯微鏡特點采用合適制樣方法，盡可能使樣品生理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，采用各種方法提高反差。第五十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)顯微樣品制備之光學顯微鏡制樣光學顯微鏡制樣活體觀察染色壓滴法懸滴法菌絲埋片法活菌死菌美藍染色簡單染色鑒別染色革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色第五十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)特點：避免染色對細胞結(jié)構(gòu)的破壞，用于運動性、攝食特性、生長繁殖過程中形態(tài)變化等觀察壓滴法：菌懸液滴載玻片，加蓋玻片直接觀察懸滴法：蓋玻片滴一滴菌懸液，反轉(zhuǎn)置于特制凹載玻片直接觀察菌絲埋片法：無菌小玻璃紙鋪平板表面，涂布孢子懸液，培養(yǎng)后，取下玻璃紙置于載玻片，觀察光學顯微鏡樣品制備－－活體觀察第五十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日活體觀察難看到微生物的細致形態(tài)和結(jié)構(gòu)，需染色觀察。染色前需要對樣品固定，目的：殺死細菌使菌體黏附在玻片上；還可增加對染料的親和力。常用：酒精火焰加熱和化學固定兩種方法二、顯微鏡和顯微技術(shù)光學顯微樣品制備－－染色觀察第五十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、顯微鏡和顯微技術(shù)大腸桿菌革蘭氏染色

枯草桿菌革蘭