實(shí)驗(yàn)七細(xì)胞器的分級分離

實(shí)驗(yàn)七細(xì)胞器的分級分離第一頁，共十七頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)分離細(xì)胞器的一般原理及方法第二頁，共十七頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器的比重和大小都不相同，在均勻密度介質(zhì)中不同離心力下沉降的細(xì)胞器組成不同或在梯度介質(zhì)中離心后分布于不同密度層，根據(jù)這一原理，差速離心法或密度梯度離心法就可將細(xì)胞內(nèi)各種組分分離出來。分離流程：破碎組織（勻漿或研磨）－差速離心或密度梯度離心分離細(xì)胞器－結(jié)果檢驗(yàn)分析第三頁，共十七頁，2022年，8月28日勻漿（Homogenization）低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化鈣)進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。第四頁，共十七頁，2022年，8月28日各種勻漿、研磨器第五頁，共十七頁，2022年，8月28日差速離心分級分離(Fractionation)由低速到高速離心逐漸沉降細(xì)胞器。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速將上清液中的小顆粒沉淀下來。

DifferentialcentrifugationHighspeedLowspeed第六頁，共十七頁，2022年，8月28日密度梯度離心（densitygradientcentrifugationmethod）亦稱平衡密度梯度離心法。用超速離心機(jī)對小分子物質(zhì)溶液，長時(shí)間加一個(gè)離心力場達(dá)到沉降平衡，在沉降池內(nèi)從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內(nèi)比溶劑密度大的部分就產(chǎn)生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。第七頁，共十七頁，2022年，8月28日Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation第八頁，共十七頁，2022年，8月28日分析分級分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。第九頁，共十七頁，2022年，8月28日（一）實(shí)驗(yàn)材料

多葉綠菜第十頁，共十七頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)試劑0.4M蔗糖0.35M氯化鈉（每升19.856g氯化鈉）第十一頁，共十七頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)用品1、普通臺式離心機(jī)：4臺2、研缽：30個(gè)3、40ml小燒杯:30個(gè)4、紗布：5包5、離心管60支6、載玻片及蓋玻片見指導(dǎo)。第十二頁，共十七頁，2022年，8月28日一、葉綠體的分離第十三頁，共十七頁，2022年，8月28日細(xì)胞中及勻漿中的葉綠體第十四頁，共十七頁，2022年，8月28日葉綠體的分離步驟1、采樣、洗滌、去葉脈：最好在晴天上午10時(shí)左右選取生長正常的菠菜葉子（菜心、白菜、豌豆也可）洗干凈，用吸水紙擦干，去柄及粗脈2、預(yù)冷：放入4℃冰箱預(yù)冷1h；3、研磨勻漿：稱2克葉子在玻璃研缽中剪碎，先加1－2m1制備液，快速磨成勻漿，然后再加8m1制備液，磨勻；4、過濾：把勻漿液倒在6層沙布上過濾入小燒杯；第十五頁，共十七頁，2022年，8月28日5、離心去完整細(xì)胞、細(xì)胞核等：上述濾液轉(zhuǎn)入10ml離心管，平衡后在約500rpm（每分鐘的轉(zhuǎn)速）離心2分鐘，上清轉(zhuǎn)入另一離心管；6、離心收集葉綠體：上清液在2600rpm離心5分鐘，棄上清液，沉淀即是葉綠體。7、懸浮葉綠體：沉淀中加入制備液適量，用吸管吹打懸浮、混勻：8、鏡檢分離效果9、葉綠體被膜完整度的測定：鐵氰化鉀光還原的Hill反應(yīng)第十六頁，共十七頁，2022年，8月28日葉綠