DNA多態(tài)性及其分析2

DNA多態(tài)性及其分析(Xi)技術(shù)

免疫與分子生物學(xué)技術(shù)研究室

王青廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所第一頁，共五十二頁。第(Di)一節(jié)多態(tài)性概述

一．定義自然界的生物有千百萬種，每一種生物的個體之間存在著許多的差異。一種生物群體內(nèi)，某一性狀方面也存在著不同的個體變異。不同種的生物以及同一種生物的不同個體之間都存在著許多差異，稱為生物的多態(tài)現(xiàn)象，即生物的多態(tài)性。（polymorphism）第二頁，共五十二頁。環(huán)(Huan)境因素遺傳因素營養(yǎng)、氣候、疾病等遺傳多態(tài)性（geneticpolymorphism）不同個體之間，其生化特征、抗原特性都存在著由遺傳造成的變異，形成一系列的多態(tài)性，由相應(yīng)的基因控制。

生物進(jìn)化概念第三頁，共五十二頁。二(Er)．標(biāo)準(zhǔn)

基因座位：基因在染色體上的位置等位基因（alleles)：二倍體個體中，位于一對同源染色體相等位置上（相同座位上），控制著同一性狀的基因，具有兩種或兩種以上的形式。純合子：二倍體中，在一定的座位上帶有兩個相同的等位基因的個體。雜合子：在一定的座位上帶有兩個不同的等位基因的個體。（一般是針對所研究的一對或幾對基因而言。）第四頁，共五十二頁。多態(tài)性：發(fā)生遺傳分離的基因座位（locus）具有兩個以上等位基因時，其最常見的等位基因的頻率不超過0.95或0.99時，這(Zhe)個基因座位就被認(rèn)為具有多態(tài)性。

個人——一對等位基因（如ε1/ε2

，或ε2/ε3）人群——復(fù)等位基因（如ε1

、ε2

、ε3、

ε4）,如

ABO血型基因、人類白細(xì)胞抗原基因二態(tài)性（dimorphism）：在某些時候，一個基因位點上只由一個基因占據(jù)，但有時這個位置上缺乏這一基因，這時就會出現(xiàn)“有”和“無”兩種情況，被稱為二態(tài)性。

第五頁，共五十二頁。遺傳多態(tài)性廣泛存在于生物界。果蠅有著大量的蛋白質(zhì)水平上的遺傳變異哺乳動物的免疫球蛋白有高度的遺傳多態(tài)性即使是純系的小(Xiao)鼠，其免疫球蛋白IgG2a重鏈編碼區(qū)1108個堿基中就有110個（10%）的堿基組成互不相同，其中有18個堿基替換是同義的，其余的變異則編碼不同的氨基酸。

第六頁，共五十二頁。三．分(Fen)類

遺傳表型的多態(tài)性

DNA的多態(tài)性

由遺傳控制表現(xiàn)出來的性狀就是遺傳表型

紅細(xì)胞表面的抗原多態(tài)性系統(tǒng)：有ABO、Rh等20余種

人類白細(xì)胞抗原（HLA）系統(tǒng)

人類的免疫球蛋白

性狀：生物體表現(xiàn)出的形態(tài)特征（如花色）和生理生化特征（如抗病性、合成某種物質(zhì)的能力)。表型：個體所具有的全部或部分性狀。是基因型與環(huán)境作用的結(jié)果。第七頁，共五十二頁。人30億堿(Jian)基（bp)基因及相關(guān)序列20%~30%

編碼序列＜10%——檢測表型多態(tài)性非基因序列70~80%中度或高度重復(fù)序列20-30%單一或低拷貝序列70-80%在所有生物體的基因組中都存在著天然的DNA序列變異由于基因組的大多數(shù)序列不編碼蛋白質(zhì)，因此可容納大量的序列變異估計在人群個體之間每200~400個核苷酸就能檢測到一個核苷酸的變異。某一變異的群體頻率達(dá)到或超過1%即被認(rèn)為屬DNA多態(tài)性。第八頁，共五十二頁。遺傳表型的多態(tài)性只反映出編碼基因的部分變(Bian)異編碼序列只占人基因組總DNA的10～15%，甚至可能不到總DNA序列的5%。DNA序列中的同義突變不會引起表型的改變基因的表達(dá)也會有變異：

——環(huán)境作用

——從基因到基因產(chǎn)物會受到許多因素的影響，而改變最終產(chǎn)物。分析DNA的多態(tài)性才能真正深刻地揭示生物的多態(tài)性第九頁，共五十二頁。第二節(jié)DNA多態(tài)性的分(Fen)類DNA是遺傳信息的物質(zhì)基礎(chǔ)，因而是反映個體間差異的最本質(zhì)東西

進(jìn)化、發(fā)育過程中的遺傳變異

:DNA堿基序列的點突變移碼突變DNA片段的插入或缺失生殖細(xì)胞成熟過程中染色體DNA的交換重組轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用等DNA的序列組成完全是個體特異的第十頁，共五十二頁。一．基因多態(tài)性

二．重(Zhong)復(fù)序列多態(tài)性

三．性染色體多態(tài)性

四．線粒體的DNA多態(tài)性

第十一頁，共五十二頁。一．基因多(Duo)態(tài)性

基因的多態(tài)性遺傳表型的多態(tài)性

在生物群體中，對于某一基因座位來說，屬于這一位點的等位基因越多，這一座位的基因多態(tài)性就越復(fù)雜。

HLA白細(xì)胞抗原系統(tǒng)：僅HLA-DR抗原的編碼位點就有HLA-DRA，-DRB1，B2，B3，B4，B5等10個座位，超過200個等位基因。例如分析限制性內(nèi)切酶消化等位基因特異性的探針第十二頁，共五十二頁。二(Er)．重復(fù)序列多態(tài)性

串聯(lián)重復(fù)序列

——相同的核心序列（coresequence）按首尾相接的方式排列。在重復(fù)序列兩翼，DNA片段的堿基組成相同限制性內(nèi)切酶不同長度的DNA片段GATCGATCGATCGATC12BAssDNA探針大片段小片段第十三頁，共五十二頁。（1）不同個體——核心序列重復(fù)的次數(shù)不同（2）不同的串聯(lián)重復(fù)序列，其核心序列的組成會不同（3）在核心序列之間，有時不同的個體間會存在有無插入小段的DNA序列或插入的片(Pian)段長短不同之差DNA指紋由于不同的個體其核心序列重復(fù)的次數(shù)不同，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切時，形成不同長度的DNA片段，這類多態(tài)性被稱為VNTR（variablenumbersoftandemrepeats，VNTR），可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性。兩個無關(guān)個體之間的VNTR的變異能達(dá)到完全個體特異的程度第十四頁，共五十二頁。小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA）:串聯(lián)重復(fù)序列中有一類(Lei)較短的，稱為～。許多基因的內(nèi)含子部分含有此類序列。

特點：G＋C含量高插入或缺失此類序列的事件發(fā)生頻繁，有時還會發(fā)生跳躍復(fù)制的現(xiàn)象。

1985年，Jeffreys等首先用人肌紅蛋白基因內(nèi)含子中一段高度重復(fù)的小衛(wèi)星DNA為探針，獲得了具有個體特異性的DNA指紋圖譜。應(yīng)用第十五頁，共五十二頁。中度重復(fù)的散在重復(fù)序列：散在重復(fù)序列的某些重復(fù)單位可能是轉(zhuǎn)座子（transposon）。

——一種能夠反復(fù)插入到基因組(Zu)中許多位點的特殊DNA片段。它可以從基因組上一個位點轉(zhuǎn)移到另一個位點，從一個復(fù)制子轉(zhuǎn)移到另一個復(fù)制子。

第十六頁，共五十二頁。三．性(Xing)染色體多態(tài)性(Xing)

X染色體——著絲粒周圍也有一類重復(fù)序列形成X染色體的VNTR類多態(tài)性。Y染色體——在哺乳動物的染色體中Y染色體似乎是最少保守性的。用不同的限制性內(nèi)切酶和DNA探針，可以揭示出Y染色體特異性片段的多態(tài)性。第十七頁，共五十二頁。四．線(Xian)粒體的DNA多態(tài)性

線粒體DNA屬于核外基因，表現(xiàn)為非孟德爾規(guī)律遺傳。人mtDNAD環(huán)一端347bp的序列分析資料證明，兩個無關(guān)個體間，這一段mtDNA序列完全相同的可能性只有0.27%（即1/370）。因此，mtDNA序列組成的多態(tài)性同樣可以用作個體識別。第十八頁，共五十二頁。SNP單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達(dá)300萬(Wan)個甚至更多。

第十九頁，共五十二頁。第三節(jié)

DNA多態(tài)性分析(Xi)技術(shù)

1979年，Jeffreys等人首先用限制性內(nèi)切酶和-珠蛋白基因探針直接觀察到DNA的多態(tài)性。即限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)。1985年，Mullis等發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，簡稱PCR）技術(shù)，對DNA多態(tài)性的分析。第二十頁，共五十二頁。一．RFLP分(Fen)析技術(shù)

（一）基本原理

限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)，簡稱RFLP技術(shù)（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）1.限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）能夠識別DNA雙鏈上特異的堿基序列并能將之切斷。不同的限制性內(nèi)切酶有各自特異的識別序列，一般為4~8個堿基對。2.DNA區(qū)段堿基組成不同。用一種限制性內(nèi)切酶消化，就會產(chǎn)生不同長度的酶切片段。第二十一頁，共五十二頁。A含1,2兩個酶切位點的DNA片段(Duan)B點突變使酶切位點1缺失C點突變產(chǎn)生酶切位點3D序列重排使酶切位點2移位E含有酶切位點2的片段缺失F序列插入，如存在數(shù)量不同的串聯(lián)重復(fù)序列，即VNTR12122312112第二十二頁，共五十二頁。采用合適的限制性內(nèi)切酶切出一系列長度的DNA片段根據(jù)片段是否長度一致來推測其DNA序列是否相同用標(biāo)記好的相應(yīng)的DNA探針與這些片段進(jìn)行雜交圖譜反映出基因組DNA堿基序列組成是否存在(Zai)差異。RFLP——通過核酸的限制性酶切片段長度多態(tài)性來揭示DNA堿基序列組成的不同，因而稱為限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)。第二十三頁，共五十二頁。（二）RFLP技術(shù)的基本(Ben)步驟抽提DNA（從血或組織）培養(yǎng)細(xì)菌人工合成探針

限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒純化純化探針瓊脂糖凝膠電泳標(biāo)記探針（同位素或非同位素）Southern轉(zhuǎn)移、固定

預(yù)雜交

雜交

洗膜

放射自顯影或顯色后分析結(jié)果RFLP技術(shù)的基本步驟靶DNA的準(zhǔn)備

核酸探針的標(biāo)記雜交顯示第二十四頁，共五十二頁。正常人染色體DNA含有4個完全一樣的α-珠蛋白基因，而α-地中海貧血患者則缺失一個或數(shù)個α-珠蛋白基因用(Yong)α-珠蛋白基因探針對患者或產(chǎn)婦進(jìn)行RFLP分析：當(dāng)用EcoRI和HpaI酶切后，正常人標(biāo)本出現(xiàn)4.8、4.1kb兩條雜交帶；患者僅出現(xiàn)5.6kb雜交帶用EcoRI和HindIII酶切后，正常出現(xiàn)2.1、3.1、16kb雜交帶；患者出現(xiàn)2.1、16kb雜交帶。遺傳性疾病的基因診斷和產(chǎn)前診斷α-地中海貧血例如5.6kb4.8kb4.1kb16kb3.1kb2.1kb第二十五頁，共五十二頁。（三）RFLP技術(shù)可選擇(Ze)的幾個因素

1．限制性內(nèi)切酶是影響RFLP圖譜的一個重要因素。已分離500種，常見的100多種

①識別序列：多數(shù)為4至6個堿基識別4個堿基對的限制性內(nèi)切酶能把人基因組DNA切出較短的小片段，而識別6個或更多堿基對的限制性內(nèi)切酶，酶解出的較長的DNA片段。

如Sao3AI識別GATC如EcoRI位點為GAATTC

②反應(yīng)條件：包括反應(yīng)液的pH，內(nèi)含乙醇、甘油的量，反應(yīng)溫度和時間等，以及DNA的質(zhì)量和濃度。星號*活性，即非特異性酶解活性

第二十六頁，共五十二頁。

限制性核酸內(nèi)切酶——能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。

識別位點(Dian)：回文序列

反轉(zhuǎn)重復(fù)序列，即旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)一般為4~8個堿基對例如EcoRI的識別序列：

5＇-GAATTC-3＇

3＇-CTTAAG-5’BamHI識別序列：5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’第二十七頁，共五十二頁。2．核酸探針(Zhen)

由于人基因組DNA鏈很長，用某一限制性內(nèi)切酶消化后，酶解出來的各種不同長度的片段往往數(shù)量巨大，電泳后幾乎是連續(xù)排列的，無法進(jìn)行分析比較。

選取某種特定的DNA片段作為探針，標(biāo)上一定的標(biāo)記物（如同位素、生物素等），利用堿基互補(bǔ)的兩條DNA單鏈能結(jié)合（雜交）的原理，就可以在連續(xù)排列的一系列DNA片段中顯示出與探針有同源序列的某些DNA片段。不同的DNA探針會顯示出不同類型的RFLP圖譜。

第二十八頁，共五十二頁。探針分(Fen)類：（1）基因探針大多數(shù)取自人基因組中某一基因的一個片段。人類基因組中，最早確定有多態(tài)性的是α珠蛋白基因位點和胰島素基因位點。cDNA探針——用mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，探測的是此基因中的外顯子部分。人工合成——可以隨研究者的設(shè)計而合成

第二十九頁，共五十二頁。（2）隨機(jī)(Ji)探針

隨意挑選出的DNA片段

要能夠揭示出人基因組DNA的酶切片段長度多態(tài)性就行。特點：能比較快地了解該染色體的某些限制性片段多態(tài)性與研究對象（如某種疾病基因）的相關(guān)性。片段較大的隨機(jī)DNA探針比片段較小的更易檢測出RFLP來

第三十頁，共五十二頁。（3）重復(fù)序列探針

如α小衛(wèi)星DNA，其重復(fù)單位群集在基因組的(De)某一特定區(qū)域。重復(fù)序列探針能檢測出基因組中多處具有此類重復(fù)序列的DNA片段。特點：能一次性檢測出多個位點的DNA片段多態(tài)性

第三十一頁，共五十二頁。Jeffreys等從第22號染色體上肌紅蛋白基因的內(nèi)含子中分離出來的高度可變的“小衛(wèi)星DNA”探(Tan)針。

并證明兩個無關(guān)個體之間，這類多態(tài)性相同的機(jī)會極微（只有3×10－11），因而他稱這種RFLP圖譜為DNA“指紋”。應(yīng)用：親子鑒定法醫(yī)學(xué)個人認(rèn)定人類學(xué)研究遺傳病相關(guān)性分析第三十二頁，共五十二頁。

將總DNA用限制性內(nèi)切酶完全酶解以后，用放射性的探針進(jìn)行Southern印跡，每個人的DNA所產(chǎn)生的陽性雜交條帶都是特異性的，而且子女的陽性雜交帶中，有一半與父親的DNA陽性雜交帶相同，另一半是與母親的陽性雜交帶相同。用這種重復(fù)序列作為探針，對不同的人的DNA進(jìn)行指紋分析，產(chǎn)生完全相同的圖譜的機(jī)會小于60億分之一?？捎糜诜ㄡt(yī)鑒定、血緣關(guān)系的識別等。這一實驗方法所提供的證據(jù)已(Yi)于1988年得到英國法庭的認(rèn)可。第三十三頁，共五十二頁。人的DNA指紋分析示意圖子女DNA指紋圖中(Zhong)分別與其父、母的DNA指紋中相應(yīng)的分子雜交條帶相對應(yīng)第三十四頁，共五十二頁。（4）人工合成的寡核苷酸探針

1986年，Ali等以AluI和MboI酶消化人基因組DNA后，用人工合成的（GATA）的寡核苷酸作探針進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其RFLP圖譜同樣具有個體特異性。這類探針檢測的對象主要是人基因組中的散在重復(fù)序列DNA。提示：根據(jù)自己研究的主要對象來設(shè)計各種各樣的探針（包括各種長度的以及各種堿基組成的）。人基因組DNA用合適的探針和限制性內(nèi)切酶酶切，一般都能(Neng)揭示出人基因組中的RFLP。

第三十五頁，共五十二頁。在其它動物的研究中：在動物基因組中任選一段DNA片段作為探針再用此探針去檢查該動物基因組的限制性酶切片段長度(Du)多態(tài)性。許多昆蟲類動物可以用此方法進(jìn)行種、群分類。

第三十六頁，共五十二頁。1.檢測對象的DNA分子必須保持大分子。在抽提DNA過程中避(Bi)免人為地將DNA分子機(jī)械性切割成小片段的DNA，否則最終的結(jié)果可能是一種假象。2.在用限制性內(nèi)切酶消化大分子DNA時，要使DNA被完全消化，否則也會出假結(jié)果。3.被消化的DNA濃度不能太高。4.電泳時要低電壓電泳。5.雜交前探針必須充分變性。6.要根據(jù)探針標(biāo)記的情況以及探針與靶DNA間序列互補(bǔ)的程度和GC含量來掌握洗膜的條件。7.作放射自顯影時，要根據(jù)探針標(biāo)記的放射比活性以及靶DNA的量等因素決定曝光的時間。

注意第三十七頁，共五十二頁。二．PCR分析(Xi)DNA多態(tài)性

PCR（polymerasechainreaction）是一種在試管里擴(kuò)增特定的DNA片段的技術(shù)。設(shè)計引物：按照所研究的DNA（稱靶DNA）片段的特點，設(shè)計出與此DNA片段二翼的DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸。變性：通過加熱（92~95℃）使靶DNA（又稱DNA模板）變性成為兩條單鏈DNA。退火（復(fù)性）：然后將溫度降至37℃~55℃，引物就會結(jié)合在模板DNA中與其堿基互補(bǔ)的序列上。延伸：將溫度升至70℃~72℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，引物就會按5’→3’的方向，嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)的原則，逐步延伸。

第三十八頁，共五十二頁。1．分析基因多態(tài)(Tai)性

方法：特異性引物

擴(kuò)增特異性基因片段與此位點上所有的等位基因探針都雜交確定屬哪個等位基因

等位基因間的差異一般表現(xiàn)為幾個堿基或十幾個堿基組成的不同，因而區(qū)分這些不同的等位基因多采用等位基因特異性探針（allele-specificoligonucleotideprobe，ASO）與擴(kuò)增出來的DNA片段進(jìn)行雜交，根據(jù)能與哪一個探針進(jìn)行雜交來確定該DNA片段屬哪一個等位基因。人類HLA系統(tǒng)——已知有30多個位點，超過500個等位基因。其中的某一位點，往往有多個、甚至幾十個等位基因。

難以實現(xiàn)多態(tài)性的分析第三十九頁，共五十二頁。2．分析擴(kuò)增DNA的限(Xian)制性片段長度多態(tài)性

擴(kuò)增DNA的限制性酶切片段長度多態(tài)性（Amplificationrestrictionfragmentlengthpolymorphism,簡稱Am-RFLP）技術(shù)

概括為：PCR+酶切應(yīng)用舉例：串聯(lián)重復(fù)序列的核心很短（只有4～5bp），重復(fù)次數(shù)的差異又不大時，其擴(kuò)增產(chǎn)物的長短較為接近，用普通瓊脂糖凝膠電泳難以區(qū)分開來。這時可以根據(jù)擴(kuò)增片段堿基組成的規(guī)律，選擇某種限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增片段酶切。這種酶切片段的長度差異往往較大，可以用瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分出不同的等位基因。

第四十頁，共五十二頁。載脂蛋白E（apoE）基因多態(tài)性與心腦血管疾病和老年癡呆密切相關(guān)，確定個體apoE基因?qū)εR床應(yīng)用研究及診斷治療十分必要。ApoE三種常見的等位基因是ε2、ε3、ε4，對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，以CfoI內(nèi)切酶消化，結(jié)果：一般在擴(kuò)增的片段較長時常用此方法(Fa)。較為簡便，無需測序和雜交，適于大范圍人口檢測和臨床實驗室開展。也稱為PCR-RFLP。第四十一頁，共五十二頁。3.隨機(jī)引物PCR法分析DNA的(De)多態(tài)性

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)1990年，Willian和Weles等創(chuàng)建方法：由于DNA組成完全是個體特異的，隨意設(shè)計單個很短的引物去擴(kuò)增不同人的DNA模板結(jié)果：擴(kuò)增出來的DNA片段的數(shù)量和大小會因人而異，通過電泳可以把不同個體的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開來。第四十二頁，共五十二頁。引物：長10個堿基左右，G和C的含量(Liang)在50~80%之間，不含回文結(jié)構(gòu)，而且單條引物即可。特點：可以在完全不知道特定DNA順序的情況下分析其多態(tài)性，方法簡便，能檢出的遺傳信息量大。第四十三頁，共五十二頁。西紅花及其偽冒品的RAPD指紋圖1.Marker2.西班牙紅花3.印度紅花4.川(Chuan)紅花5.蓮須6.玉米須7.黃花菜不同來源同種藥材的RAPD指紋圖1.新鮮西洋參2.干品西洋參3.西洋參組織培養(yǎng)物4.新鮮人參5.生曬參1（干品）6.生曬參2（干品）

第四十四頁，共五十二頁。應(yīng)用：不僅可用于個人識別、疾病的相關(guān)性分析，還可用于其它(Ta)各種遺傳學(xué)研究（中藥鑒定）。優(yōu)點：①可以用一系列的通用引物分析不同種類的生物。②可用于制備探針和分析未知的DNA順序。③由于每一個RAPD標(biāo)記對應(yīng)一種DNA順序，可大大簡化多種相關(guān)研究。（通過隨意引物擴(kuò)增的DNA順序，稱為RAPD標(biāo)記）

第四十五頁，共五十二頁。4.簡單重復(fù)序列間區(qū)（inter-simplesequencerepeats,ISSR）簡單重復(fù)序列（simplesequencerepeats，SSR）又叫微衛(wèi)星序列（microsatellite）：主要是以l~4個核苷酸為基本單位的串聯(lián)重復(fù)序列其長度大多在100~