生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡

生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡第一頁，共二十七頁，2022年，8月28日目錄一、細(xì)胞凋亡的概念三、雄性生殖細(xì)胞凋亡摘要二、細(xì)胞凋亡的途徑四、雌性生殖細(xì)胞凋亡摘要五、生殖細(xì)胞凋亡現(xiàn)象個案展示六、細(xì)胞凋亡中的相關(guān)蛋白七、細(xì)胞凋亡的機(jī)理八、凋亡誘導(dǎo)因子第二頁，共二十七頁，2022年，8月28日一、細(xì)胞凋亡的概念：第三頁，共二十七頁，2022年，8月28日

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是一種由基因控制的細(xì)胞自主性死亡方式,是一種主動的、程序性的、細(xì)胞固有的生物學(xué)過程,又稱細(xì)胞程序性死亡(PCD);是1972年由Kerr教授根據(jù)形態(tài)學(xué)特征首先提出的[1]。細(xì)胞凋亡與組織器官的發(fā)育,機(jī)體正常生理活動的維持,某些疾病的發(fā)生以及細(xì)胞惡變等過程均有關(guān)[2]概念:第四頁，共二十七頁，2022年，8月28日二、細(xì)胞凋亡的途徑（一）、細(xì)胞凋亡的兩條主要途徑1、死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑或外在途徑(deathreceptor-mediatedpathway或extrinsicpathway)2、線粒體凋亡途徑或內(nèi)在途徑(mitochondrialpathway或intrinsicpathway)。雖然兩條凋亡通路的上游事件(up-streamactivation)不同[2],但是它們最終都要激活共同的凋亡效應(yīng)物,即特異的胱冬酶(caspase)。細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控,在正常細(xì)胞中胱冬酶處于非活化的酶原狀態(tài),凋亡程序一旦開始,胱冬酶被活化,隨后發(fā)生凋亡蛋白酶的層疊級聯(lián)反應(yīng),引發(fā)不可逆的凋亡。（二）、細(xì)胞凋亡的其它途徑1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡研究較多的有兩種機(jī)制,為非折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinreaction,UPR)和鈣離子起始信號(caiciumsignallng)第五頁，共二十七頁，2022年，8月28日哺乳動物睪丸內(nèi)精子發(fā)生是一個復(fù)雜而精細(xì)的過程,這一過程需要許多精密的調(diào)節(jié)機(jī)制在其中起調(diào)控作用,凋亡便是其中一種調(diào)節(jié)機(jī)制。正常的精子發(fā)生過程中就存在自發(fā)的生殖細(xì)胞凋亡。睪丸內(nèi)生殖細(xì)胞的凋亡可排除受到損傷或具有畸形染色體的生殖細(xì)胞,以保證遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞;并可將生殖細(xì)胞的數(shù)量控制在支持細(xì)胞能夠承受的范圍內(nèi),以保證這些生殖細(xì)胞得到足夠的營養(yǎng)和支持。然而過度凋亡會造成生殖細(xì)胞數(shù)量減少,使生成的精子數(shù)量降低,機(jī)體生育力下降。三、雄性生殖細(xì)胞凋亡——睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響因素第六頁，共二十七頁，2022年，8月28日在正常精子發(fā)生及成熟過程中,廣泛存在生精細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象,生精細(xì)胞的凋亡對生精過程具有重要的意義。機(jī)體通過凋亡來維持生精小管內(nèi)環(huán)境中精子數(shù)量的平衡,這對于維持成熟精子的數(shù)量,保證精子的正常發(fā)育和成熟,確保睪丸發(fā)揮正常的生理機(jī)能是必需的。但在實際中,生精細(xì)胞的凋亡受許多內(nèi)在和外在因素的影響。在正常精子發(fā)生及成熟過程中,廣泛存在生精細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象,生精細(xì)胞的凋亡對生精過程具有重要的意義。機(jī)體通過凋亡來維持生精小管內(nèi)環(huán)境中精子數(shù)量的平衡,這對于維持成熟精子的數(shù)量,保證精子的正常發(fā)育和成熟,確保睪丸發(fā)揮正常的生理機(jī)能是必需的。但在實際中,生精細(xì)胞的凋亡受許多內(nèi)在和外在因素的影響。1激素影響（卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)）實驗研究表明,激素的變化與生殖細(xì)胞凋亡有關(guān)。睪丸內(nèi)的睪酮主要是由間質(zhì)細(xì)胞合成分泌的,因此間質(zhì)細(xì)胞破壞或損傷時生精細(xì)胞的凋亡增加,且凋亡的發(fā)生與睪酮的分泌有明顯的依賴性,

出現(xiàn)凋亡的主要是粗線期、細(xì)線前期精母細(xì)胞。另有研究表明,睪酮對生精細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用還受到其它激素和物理性因素的影響。FSH對生精細(xì)胞凋亡的調(diào)控可能與支持細(xì)胞和睪酮有關(guān),FSH可通過支持細(xì)胞調(diào)控生殖細(xì)胞的凋亡,FSH被拮抗或其水平下降,都能使生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡,睪酮可增強(qiáng)FSH對生精細(xì)胞的調(diào)控作用。LH水平下降而引起睪酮下降時則凋亡明顯,實驗研究中發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞的凋亡會隨血清中睪酮水平的下降而增加,第七頁，共二十七頁，2022年，8月28日2基因調(diào)控生精細(xì)胞凋亡的主要影響因素是基因調(diào)控。2.1P53P53是一種抑癌基因,與細(xì)胞的生長、分化和死亡密切相關(guān),正常P53基因具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,而突變型P53基因則抑制細(xì)胞凋亡。P53在睪丸中的表達(dá)量很高,特別是在分裂前細(xì)線期到粗線期精母細(xì)胞。有研究表明,缺乏P53表達(dá)的生殖細(xì)胞不易凋亡,是因為缺乏P53的粗線期精母細(xì)胞不能對減數(shù)分裂DNA重組中的錯誤進(jìn)行修復(fù),細(xì)胞不能進(jìn)一步發(fā)展進(jìn)行減數(shù)分裂而阻止了凋亡的發(fā)生。已有研究表明高溫可通過P53途徑誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致精子生成量的減少。2.2Bcl-2Bcl-2為細(xì)胞內(nèi)主要凋亡調(diào)節(jié)因子,Bcl-2存在于動物的多種正常組織內(nèi),Bcl-2對凋亡具有抑制作用,它不能促進(jìn)細(xì)胞增殖,但能延長細(xì)胞的生命期限。哺乳動物細(xì)胞的凋亡涉及內(nèi)在和外在2個途徑,在內(nèi)在途徑中,線粒體依賴的途徑是熱誘導(dǎo)小鼠生精細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵途徑,而Bcl2家族蛋白包括Bax、Bcl2等在此途徑中起著重要的作用。2.3Fas/FasL系統(tǒng)Miura等研究發(fā)現(xiàn)將小鼠睪丸和尾巴浸在43℃恒溫水浴中15min后,生精細(xì)胞的凋亡率明顯增加,主要是由Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的。還有研究發(fā)現(xiàn)具有支持細(xì)胞毒性的物質(zhì)是通過Fas/FasL誘發(fā)睪丸生殖細(xì)胞凋亡的。第八頁，共二十七頁，2022年，8月28日2.4hsp基因族表達(dá)蛋白hsp是一組廣泛存在于原核和真核生物中高度保守的蛋白質(zhì),各類在小鼠等多種哺乳動物正常睪丸組織中有表達(dá),作為生精細(xì)胞或體細(xì)胞的細(xì)胞成分存在,而可通過cmyc、p53、Bcl2等基因抑制或促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。有研究認(rèn)為HSP70-2基因突變可使減數(shù)分裂后精子細(xì)胞缺失并導(dǎo)致不育。2.5C-myc基因在有關(guān)轉(zhuǎn)基因大鼠的研究中發(fā)現(xiàn),C-myc基因的過度表達(dá)可以造成雄性大鼠的不育,而高能微波照射后可引起大鼠生精細(xì)胞C-myc蛋白表達(dá),表明C-myc可能是高能微波照射導(dǎo)致凋亡的誘導(dǎo)因素。C-myc基因可以啟動細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞分化,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及調(diào)控細(xì)胞凋亡,它的表達(dá)既可引起細(xì)胞增殖,又可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這兩種應(yīng)答以何種為主取決于某些關(guān)鍵因子的存在與否。有學(xué)者在轉(zhuǎn)基因大鼠的研究中發(fā)現(xiàn),C-myc的過度表達(dá)可以造成雄性大鼠的不育。此外,CREM基因、線粒體相關(guān)基因、iNOS基因等都與細(xì)胞凋亡有關(guān),腫瘤抑制基因Smad4與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),Narula等發(fā)現(xiàn),Smad4在轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)會導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡,精子發(fā)生停止以及生精小管退化的現(xiàn)象。第九頁，共二十七頁，2022年，8月28日3其它因素影響3.1理化因素某些化學(xué)因素可直接或間接影響生殖細(xì)胞的凋亡。環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C和長春新鹼都是臨床常用抗癌藥,他們均可引起大鼠和小鼠生精細(xì)胞凋亡。睪丸生精細(xì)胞凋亡對電離輻射敏感,很低劑量照射就可引起小鼠生精細(xì)胞凋亡增加。3.2光、熱刺激在對倉鼠的研究中發(fā)現(xiàn),睪丸細(xì)胞凋亡是由于暴露于短白天而引起睪丸退化,而光刺激的睪丸生長又是與睪丸細(xì)胞凋亡的快速停止相聯(lián)系的,盡管光介導(dǎo)的睪丸細(xì)胞增殖也可能發(fā)生,但是目前發(fā)現(xiàn)睪丸退化及恢復(fù)的過程中睪丸細(xì)胞凋亡起重要作用。4展望睪丸生精細(xì)胞的凋亡已經(jīng)引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,當(dāng)前有關(guān)睪丸生精細(xì)胞凋亡的研究尚處于起步階段。有關(guān)生殖細(xì)胞凋亡的多數(shù)研究是建立在動物實驗的基礎(chǔ)上,從細(xì)胞和分子水平闡明動物和人睪丸生殖細(xì)胞凋亡及調(diào)控機(jī)制的研究較少。隨著對生殖細(xì)胞凋亡的深入研究,一方面可為男性生育力降低提供更多的治療和對策,探討男性的避孕方法和機(jī)制,最終在細(xì)胞和分子水平為臨床男性生殖健康提供理論依據(jù)。另一方面,為制定環(huán)境毒物的安全接觸限量提供科學(xué)的依據(jù)。第十頁，共二十七頁，2022年，8月28日四、雌性生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡牛卵子發(fā)生過程中卵母細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)理就雌性生殖系而言,細(xì)胞凋亡是其發(fā)育過程中的一個重要組成部分。在母牛中,超過99.9%的雌性生殖細(xì)胞都會在卵子發(fā)生的不同階段發(fā)生凋亡。本文主要綜述了牛卵子發(fā)生過程中卵母細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象、凋亡的分子機(jī)理等,同時還探討了卵母細(xì)胞凋亡的途徑。有資料表明細(xì)胞凋亡對于卵巢中的生殖細(xì)胞減少、卵泡閉鎖和黃體溶解都起著重要作用。1卵子發(fā)生過程中的卵母細(xì)胞凋亡已有許多試驗證明[2],母牛卵母細(xì)胞在發(fā)生過程中的大量死亡或丟失是屬于細(xì)胞凋亡。目前認(rèn)為,原始卵泡、初級卵泡和腔前卵泡閉鎖主要是由卵細(xì)胞的凋亡引起的,而卵泡發(fā)育后期,除源于卵母細(xì)胞自身凋亡引起的以外,也有由于包圍卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞凋亡引起,如有腔卵泡及排卵前的成熟卵泡的閉鎖即是由卵泡中顆粒細(xì)胞(granulosecells,GCs)的凋亡引起,這是一個由內(nèi)分泌激素控制的凋亡過程。第十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日2卵母細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理目前人們對細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理已掌握得比較清楚,各種不同的調(diào)控蛋白,如caspases(凋亡酶)、Bcl-2家族、線粒體釋放的促凋亡因子和Apaf-21等是如何決定細(xì)胞命運的分子框架都已被研究得很透徹。在胚胎性腺中存在著死亡信號(TNF-2α、Fas配體等)和存活信號(LIF、kit配體等)。在這些信號的作用下,凋亡主要通過caspases、Bcl-2等蛋白質(zhì)家族的相互作用來實現(xiàn)。另外,組織型纖溶酶激活因子(tPA)蛋白介導(dǎo)的蛋白水解作用可能參與了卵母細(xì)胞的自身瓦解和清除過程。在很多中途發(fā)生閉鎖的卵泡中,卵母細(xì)胞中tPA活性很高,而健康卵泡的卵母細(xì)胞則tPA活性很低。tPA與顆粒細(xì)胞中表達(dá)的抑制素α相互作用,可能對卵泡破裂、成熟卵子的釋放和未成熟卵子的閉鎖均起作用。3卵母細(xì)胞凋亡的途徑細(xì)胞凋亡受體內(nèi)外多種因素的影響,但各種因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與否,取決于細(xì)胞本身的遺傳特性。細(xì)胞類型不同,其影響因素亦不相同。類型不同,其影響因素亦不相同。當(dāng)母牛卵母細(xì)胞不能從環(huán)境中得到足夠的存活因子時會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;當(dāng)細(xì)胞減數(shù)分裂時發(fā)生配對錯誤或重組異常的配子時,凋亡能除去有缺陷的配子,而保留能正常進(jìn)行減數(shù)分裂的配子,這是體內(nèi)的質(zhì)量監(jiān)督機(jī)制;在配子發(fā)生期間,細(xì)胞還通過“自我犧牲(利他性)”凋亡來實現(xiàn)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟。激素刺激也是發(fā)生卵母細(xì)胞凋亡的根本因素,不同的激素通過不同的第二信使途徑調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞凋亡。凋亡誘導(dǎo)基因及凋亡抑制基因表達(dá)的產(chǎn)物通過協(xié)同或拮抗作用維持一種動態(tài)平衡,控制卵母細(xì)胞凋亡。第十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日細(xì)胞凋亡的啟動是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號刺激后胞內(nèi)一系列控制開關(guān)的開啟或關(guān)閉,不同的外界因素啟動凋亡的方式不同,所引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同[5]。細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條,一條是通過胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶(caspase);一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解,引起細(xì)胞凋亡。3.1膜受體通路這是一條基本的通過DD和FADD的細(xì)胞凋亡調(diào)控途徑。細(xì)胞表面的與凋亡相關(guān)受體屬于腫瘤壞死因子受體(TNFreceptor,TNFR)超家族,胞外有一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域,胞漿區(qū)有一由同源的氨基酸殘基構(gòu)成的結(jié)構(gòu),有蛋白水解功能,稱“死亡區(qū)域”(deathdomain,DD)。已知的死亡受體有TNFR-1、Fas、DR3、DR4和DR55種。前3種受體相應(yīng)的配體為TNF、FasL和APO-3L,后兩種均為APO-2L即TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNFrelatedapoptosis-inducingligand,TRAIL)。在這些死亡受體中最典型的是Fas和TNFRs。以Fas-FasL死亡通路為例,Fas是一種跨膜蛋白,具有三個富含半胱氨酸的胞外區(qū)和一個DD的胞內(nèi)區(qū),它與FasL結(jié)合可以啟動凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡。FasL與Fas結(jié)合可以導(dǎo)致Fas胞內(nèi)的死亡域形成三聚體而活化,并引起與之結(jié)合的FADD構(gòu)象改變,使caspase-8前體集聚、斷裂和激活,產(chǎn)生有活性的caspase-8,從而激發(fā)一系列下游的caspase級聯(lián)反應(yīng),誘發(fā)細(xì)胞凋亡。第十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日3.2線粒體通路線粒體是細(xì)胞生命活動控制中心,它不僅是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心,而且是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。當(dāng)Fas配體與Fas受體結(jié)合后,可激活caspase-8,引起B(yǎng)cl-2家族中促凋亡成員Bid的裂解,破壞線粒體,釋放細(xì)胞色素C等多種凋亡發(fā)生因子。釋放到細(xì)胞漿的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下與凋亡激活因子1(apoptoticproteaseactivatingfactor1,Apaf-1)結(jié)合,使其形成多聚體,并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體,此時caspase-9被激活。被激活的caspase-9能激活其它的凋亡酶如caspase-3等,引發(fā)凋亡酶級聯(lián)反應(yīng),從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。此外,線粒體還釋放凋亡誘導(dǎo)因子,如AIF等參與激活凋亡酶?？梢?細(xì)胞凋亡小體的相關(guān)組分存在于正常細(xì)胞的不同部位,促凋亡因子能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放和凋亡小體的形成。很顯然,細(xì)胞色素C從線粒體釋放的調(diào)節(jié)是細(xì)胞凋亡分子機(jī)理研究的關(guān)鍵問題[7]。目前普遍認(rèn)為細(xì)胞色素是通過線粒體PT孔或Bcl-2家族成員形成的線粒體跨膜通道釋放到細(xì)胞質(zhì)中的。第十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日五、生殖細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象個案展示有研究表明[1]在精子發(fā)生過程中,機(jī)體通過生殖細(xì)胞凋亡來清除受到損傷或染色體畸形的生精細(xì)胞,嚴(yán)格控制生精細(xì)胞與支持細(xì)胞的最適數(shù)目比,保證正常數(shù)量和質(zhì)量的精子分化成熟。因此,生精細(xì)胞凋亡紊亂將有礙于精子發(fā)生,成為男性原發(fā)不育主要因素之一。本研究采用TUNEL及免疫組化技術(shù)檢測男性原發(fā)不育患者生精細(xì)胞的凋亡指數(shù)及凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá),探討Caspase-3對生精細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。五-1、Caspase-3與生精細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究第十五頁，共二十七頁，2022年，8月28日細(xì)胞凋亡受促凋亡基因和抑凋亡基因的雙重調(diào)控,二者通過死亡受體途徑或線粒體途徑激活Caspase蛋白酶,并作用到下游的酶切底物,進(jìn)而產(chǎn)生一系列的級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在Caspase級聯(lián)反應(yīng)中,半胱氨酸蛋白酶Caspase-3是下游一個重要的公共凋亡效應(yīng)因子,在各種因素啟發(fā)的凋亡程序中起最后的樞紐作用。有學(xué)者[5,6]在分析男性不育的精液時,發(fā)現(xiàn)精子數(shù)量的降低與Caspase-3的活性增加密切相關(guān),并認(rèn)為Caspase-3參與生精上皮的調(diào)控、精子分化和睪丸成熟。本研究通過對睪丸組織的研究發(fā)現(xiàn),男性不育患者生精細(xì)胞Caspase-3的陽性率明顯高于正常對照組(P﹤0.01),進(jìn)一步證實并支持上述觀點。結(jié)合Caspase-3在凋亡調(diào)控中的作用地位,認(rèn)為正確控制Caspase-3的活性可保證正常數(shù)量的精子發(fā)育成熟,并減輕男性原發(fā)不育中生精細(xì)胞數(shù)量過低的異常表現(xiàn)。由于生精細(xì)胞凋亡也是精子正常發(fā)生過程中一種必不可少的調(diào)節(jié)機(jī)制。因此,在機(jī)體發(fā)育成熟的不同階段,選擇恰當(dāng)?shù)臅r機(jī)和適當(dāng)程度是有效控制生精細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵,也是今后研究的方向。第十六頁，共二十七頁，2022年，8月28日五-2、丙烯酰胺致大鼠睪丸生殖細(xì)胞DNA損傷與P53蛋白的表達(dá)

丙烯酰胺(acrylamide,AA)是一種高水溶性的小分子有機(jī)物,可經(jīng)皮迅速吸收。目前,在工業(yè)加工中暴露于AA的工人數(shù)以萬計,分子生物學(xué)實驗室的科研人員也有潛在接觸。最近又在多種食品中發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺的存在[1]。研究表明AA在大、小鼠體內(nèi)通過細(xì)胞色素P4502El(CYP2EI)代謝為環(huán)氧丙酰胺,通過這種高活性的環(huán)氧化物而產(chǎn)生基因毒性[2]。p53蛋白在監(jiān)控基因組完整性上是一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子,參與多種細(xì)胞功能,可減少基因突變積累并具抑制細(xì)胞癌變的能力。p53在DNA切除修復(fù)過程中起重要作用,它在核苷酸和堿基切除修復(fù)過程中起轉(zhuǎn)錄因子和修復(fù)復(fù)合物組分的作用。表明p53蛋白在AA的誘導(dǎo)下表達(dá)增多,參與細(xì)胞凋亡過程。合理的解釋是AA導(dǎo)致的DNA損傷激活了p53的表達(dá),從而引導(dǎo)損傷細(xì)胞進(jìn)入修復(fù)途徑或凋亡。p53主要參與調(diào)控DNA復(fù)制和修復(fù),另外p53蛋白是凋亡通路的組成部分,可修復(fù)DNA加合物等多種DNA損傷,從而減少自發(fā)的和化學(xué)物誘導(dǎo)的DNA損傷[5]。第十七頁，共二十七頁，2022年，8月28日五-3、哺乳動物顆粒細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展

動物卵巢上有許多原始卵泡,但只有少數(shù)卵泡能夠發(fā)育成熟并排卵,大約99%的卵泡發(fā)生閉鎖(follicleatresia)。卵泡閉鎖是卵泡從發(fā)育到排卵前所發(fā)生的退化并最終被清除的生理現(xiàn)象,主要通過細(xì)胞凋亡(apoptosis)而實現(xiàn),它是由基因控制的程序化死亡,對維持卵巢內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要,其中顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的主要機(jī)制。在發(fā)育卵泡中,如果10%以上的顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡,那么該卵泡注定發(fā)生閉鎖[1]細(xì)胞凋亡是雌性生殖系發(fā)育過程中的一個重要組成部分,在哺乳動物中,超過99%的雌性生殖細(xì)胞都會在卵子發(fā)生的不同階段發(fā)生凋亡。目前,在顆粒細(xì)胞凋亡過程中至少發(fā)現(xiàn)5個配體受體系統(tǒng):TNFa和TNF受體系統(tǒng),Fas配體受體系統(tǒng),TRAIL和TRAIL受體系統(tǒng),APO23配體受體系統(tǒng),PFG25配體受體系統(tǒng),而且發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞凋亡屬于依賴于線粒體凋亡信號傳導(dǎo)凋亡途徑。顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié),同其他細(xì)胞凋亡既有相似之處,同時也具有其特有的調(diào)控因素和調(diào)控模式。凋亡可由影響卵泡發(fā)育的其他因素和信號傳導(dǎo)機(jī)制來引發(fā),也受旁分泌和自分泌及死亡基因和腫瘤基因之間的相互影響,這些可能是決定顆粒細(xì)胞命運的主要因素[4]。第十八頁，共二十七頁，2022年，8月28日五-4、生殖細(xì)胞凋亡過程中外源性一氧化氮的參與及其效應(yīng)*一氧化氮是體內(nèi)信息分子、效應(yīng)分子和細(xì)胞毒性因子，它在細(xì)胞信息傳遞、細(xì)胞防御和損害過程中可通過不同的途徑誘導(dǎo)眾多細(xì)胞的凋亡[1-4]。一氧化氮合酶廣泛存在于睪丸、附睪、輸精管、精囊腺等生殖系統(tǒng)中，其合成的一氧化氮在生殖的不同階段對生育進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與精子發(fā)生、成熟、獲能及生殖細(xì)胞凋亡[5-8]。為探討男性不育發(fā)病機(jī)制，本文以可釋放自由基一氧化氮的硝普鈉作為一氧化氮供體觀察其對大鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡的作用，為男性不育的診斷治療提供理論和實驗依據(jù)。一氧化氮是具有生物學(xué)活性的自由基，研究表明在哺乳動物的生殖系統(tǒng)中廣泛存在，對生殖細(xì)胞的發(fā)生、成熟起重要的作用，還可誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的凋亡[5，13，14]。一氧化氮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的毒性作用機(jī)制，可能在于其能和蛋白質(zhì)巰基及鐵硫蛋白相互反應(yīng)或直接損傷細(xì)胞DNA[20]。使核內(nèi)DNA斷成片段，而漿內(nèi)DNA未受破壞，這一過程是由受體介導(dǎo)的第二信號所致。還有體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基能與一氧化氮迅速反應(yīng)，生成細(xì)胞毒性更大的過氧化亞硝基自由基（ONOO-），ONOO-對生殖細(xì)胞具有損傷作用，從而導(dǎo)致睪丸生殖細(xì)胞發(fā)生紊亂，凋亡增加[13，21，22]，提示一氧化氮或其代謝產(chǎn)物可引起睪丸生殖細(xì)胞凋亡增加，從而為男性不育的診治提供了新的途徑。第十九頁，共二十七頁，2022年，8月28日五-K5、雌激素抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)因子雌激素是一種類固醇性激素，主要生理功能是促進(jìn)女性生殖系統(tǒng)各個器官的發(fā)育和維持女性的第二性征。然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素還具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。雌激素抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡與其作用于下列多種因子有關(guān)，如Bcl-2家族、Ca2+、胱天蛋白酶(caspase)家族，以及胰島素樣生長因子-駁取Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因研究中研究得最多的一類蛋白質(zhì)，是內(nèi)源性凋亡途徑的關(guān)鍵性調(diào)控分子。在哺乳動物發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族的成員共有15種[4]，根據(jù)家族成員的結(jié)構(gòu)及其在凋亡中的作用被分成3個亞家族：(1)Bcl-2亞家族，具有抑凋亡的作用，包括Bcl-2、Bclxl、Bcl-w、Mcl-1和A1；(2)Bax亞家族，具有促凋亡的作用，包括Bax、Bak和Bok；(3)BH3亞家族，具有促凋亡的作用，包括Bad、Bid、Bik、Blk、Hrk、BNIP3和BimL。大量研究發(fā)現(xiàn)，雌激素能夠促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl在中樞神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)，從而抑制由腦缺血以及b淀粉樣蛋白(b-amloid，Ab)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。第二十頁，共二十七頁，2022年，8月28日五-K6、低氧對大鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡的影響B(tài)ax和Bcl22在睪丸生殖細(xì)胞凋亡中具有重要作用[527]。以往的研究發(fā)現(xiàn)高原低氧引起精液中精子數(shù)量下降,睪丸內(nèi)精子發(fā)生過程受到抑制[123]。這與精子在其發(fā)生過程中容易受到低氧的脅迫有關(guān),是由睪丸生殖細(xì)胞的高代謝與氧供距離相對較長的特點所決定的。此外,機(jī)體處于低氧狀態(tài)時,往往優(yōu)先保障心腦等重要器官,而睪丸的血供卻顯著下降,從而加重了生殖細(xì)胞缺氧,使生殖細(xì)胞容易受到損傷[11]。Bax和Bcl22是重要的凋亡調(diào)控蛋白。Bax/Bcl22途徑在精子發(fā)生過程中有重要的調(diào)節(jié)作用。Bax是A型精原細(xì)胞在發(fā)育過程中正常死亡所必需的,特別是A2、A3和A4精原細(xì)胞。Bcl22通過與Bax結(jié)合而發(fā)揮抗凋亡作用。兩者的相對水平?jīng)Q定了細(xì)胞的命運。第二十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日五-K7、細(xì)胞凋亡因子survivin與男性不育癥survivin是一種細(xì)胞凋亡抑制蛋白,它在細(xì)胞分裂時調(diào)控細(xì)胞凋亡,不僅在人類腫瘤組織中普遍過度表達(dá),而且表達(dá)于人類的正常睪丸組織中。不斷有研究顯示survivin是精子發(fā)生過程中的一個潛在的分子標(biāo)志物,它的表達(dá)在生精障礙的患者中有明顯改變。

survivin通過干擾caspase活性來阻礙有絲分裂中的細(xì)胞凋亡。caspase是一種半胱氨酸蛋白酶,在細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中作為重要的效應(yīng)子執(zhí)行凋亡。survivin能否與caspase直接連接尚未得到明確證實。第二十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日六、細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白

細(xì)胞凋亡是個體發(fā)育過程中由一系列蛋白調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程。其中,bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞凋亡中相互聯(lián)系,相互作用,從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。caspase家族蛋白caspase是半胱氨酸基天冬氨酸-特異性蛋白酶(cystei-nylaspartatespecificproteinase)即半胱氨酸天冬氨酸酶的縮寫。它們是一組存在于胞漿中的半胱氨酸蛋白酶,其共同特點是特異性斷開天冬氨酸殘基后的肽鍵。到目前為止,在小鼠和人類中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)caspase家族至少有14個成員。細(xì)胞中合成的caspase以無活性的酶原狀態(tài)存在,經(jīng)活化后方能執(zhí)行其功能。Bcl-2家族蛋白Bcl-2被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白家族中最重要的調(diào)控蛋白,和Bcl-2,Bax,Bad,Bak等共同組成了Bcl-2蛋白家族,Bcl-2的功能受其蛋白產(chǎn)物Bax和Bcl-xl蛋白調(diào)節(jié)。第二十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日3、p53蛋白腫瘤抑制蛋白p53在維持蛋白組的完整性中起著重要的作用。p53作為一個轉(zhuǎn)錄因子對DNA損傷做出反應(yīng),并誘導(dǎo)下游蛋白如p21,Mdm2和Bax的表達(dá),這些下游蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡。正常的p53在細(xì)胞里的功能有多種,但目前研究最多的有兩種,一種是抑制細(xì)胞分裂,讓其停留在細(xì)胞周期的Gl期,另一種是使細(xì)胞凋亡,此兩種功能與p53轉(zhuǎn)錄的能力均有一定程度的聯(lián)系。p53介導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能是通過以下幾點:1)在凋亡過程中線粒體膜失去完整性,接著細(xì)胞色素C釋放入胞漿,引起caspase斷裂激活。4、

survivin蛋白凋亡抑制蛋白(IAP)是凋亡抑制蛋白家族之一,survivin