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文檔簡(jiǎn)介
SDSPAGE聚(Ju)丙烯酰胺凝膠電泳詳解演示文稿第一頁(yè),共六十四頁(yè)。一、什(Shi)么是SDS?十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS)是一種陰離子去污劑。它在水溶液中以單體(monomer)和分子團(tuán)(micellae)的混合形式存在。第二頁(yè),共六十四頁(yè)。SDS的作(Zuo)用
破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵,使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械臉?gòu)象,保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。第三頁(yè),共六十四頁(yè)。二(Er)、SDS的基本原理(一)蛋白質(zhì)分子的解聚
樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后,蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小,而電荷因素可以被忽略。第四頁(yè),共六十四頁(yè)。1、SDS
陰離子去污劑
變性劑
助溶性試劑
斷裂分子內(nèi)和分子間(Jian)的氫鍵
分子去折疊
破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)
第五頁(yè),共六十四頁(yè)。2、強(qiáng)還原劑
巰基乙醇(β-mercaptoethanal)
二硫蘇糖(Tang)醇(dithiothreitol,DTT)
使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。第六頁(yè),共六十四頁(yè)。第七頁(yè),共六十四頁(yè)。SDS和還原劑的作用:
(1)分子被解聚或組(Zu)成它們的多肽鍵
(2)氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)
電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。
(3)蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超
過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,消除
了不同分子之間原有的電荷差異。第八頁(yè),共六十四頁(yè)。蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn)
(1)形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒
(2)短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的。
(3)長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度(Du)則與亞基分子量的大小成正比。第九頁(yè),共六十四頁(yè)。膠束在SDS系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白(Bai)質(zhì)原有電荷的影響,而主要取決于橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度,即蛋白(Bai)質(zhì)或亞基分子量的大小。
當(dāng)?shù)鞍?Bai)質(zhì)的分子量在15KD—200KD之間時(shí),電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系第十頁(yè),共六十四頁(yè)。3、影響SDS電泳的關(guān)鍵因素
(1)溶液中SDS單體濃度(>1mmol/L)
大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4
(2)樣品緩沖液的離子強(qiáng)度(不(Bu)>0.26)
低離子強(qiáng)度的溶液中,SDS單體才具有較高的平衡濃度。
第十一頁(yè),共六十四頁(yè)。(3)二硫鍵是否完全被還原
當(dāng)二硫鍵被徹底還原后(Hou),蛋白質(zhì)分子才能被解聚,SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對(duì)遷移率和分子量對(duì)數(shù)的線性關(guān)系。第十二頁(yè),共六十四頁(yè)。(二)緩沖系統(tǒng)的選擇
一般情況下,在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍,凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用,但緩沖液的選擇對(duì)蛋白質(zhì)的分離(Li)和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。
第十三頁(yè),共六十四頁(yè)。電泳緩沖液的種類(lèi):
1、磷酸緩沖液
2、Tris-醋酸鈉緩沖系統(tǒng)
3、咪唑緩沖液系統(tǒng):
比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電性低,電泳速
度要比后者快一倍。
4、尿素系統(tǒng):
適用分子量低于15KD的蛋白樣品(Pin)。
5、Tris-甘氨酸系統(tǒng):
使用最多的緩沖液
6、Tris-硼酸鹽緩沖液:
測(cè)定糖蛋白的分子量
第十四頁(yè),共六十四頁(yè)。(三)凝膠濃度的選擇
由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度,只取決于分子解聚后(Hou)SDS-蛋白質(zhì)膠束的大小,因此凝膠濃度的選擇會(huì)直接影響分辨率。
不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度.
第十五頁(yè),共六十四頁(yè)。第十六頁(yè),共六十四頁(yè)。第十七頁(yè),共六十四頁(yè)。第十八頁(yè),共六十四頁(yè)。第十九頁(yè),共六十四頁(yè)。(四)分子量測(cè)定
1、相對(duì)遷移率(Rf)
Rf即用每個(gè)帶的(De)遷移距離除以溴酚藍(lán)前沿的(De)遷移距離得到的(De)。
測(cè)量位置應(yīng)在蛋白帶的(De)中央。
蛋白帶遷移距離
Rf=————————
溴酚藍(lán)遷移距離
第二十頁(yè),共六十四頁(yè)。蛋白帶遷移距離固定前的凝膠長(zhǎng)度
Rf=—————————X—————————
干燥(Zao)后的凝膠長(zhǎng)度溴酚藍(lán)遷移距離
第二十一頁(yè),共六十四頁(yè)。2、作圖
以(Yi)已知蛋白質(zhì)分子量的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),Rf為橫坐標(biāo)繪圖第二十二頁(yè),共六十四頁(yè)。第二十三頁(yè),共六十四頁(yè)。3、通過(guò)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的Rf值,便可在標(biāo)
準(zhǔn)曲線上讀(Du)出他的分子量
第二十四頁(yè),共六十四頁(yè)。三、去污(Wu)劑的選擇
無(wú)離子去污(Wu)劑:LubroW;Brij35,Tween
Triton
陽(yáng)離子去污劑:cetyltrimethylammonium
bromide(CTAB)
cetylpyyridinium(CPC)
陰離子去污劑:SDSdeoxycholate
第二十五頁(yè),共六十四頁(yè)。四(Si)、方法
1、分類(lèi)
(1)根據(jù)對(duì)樣品的處理方式的不同
還原SDS電泳
非還原SDS電泳
帶有烷基化作用的還原SDS電泳
第二十六頁(yè),共六十四頁(yè)。(2)根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同(Tong)
連續(xù)電泳
不連續(xù)電泳
(3)根據(jù)電泳的形式
圓盤(pán)電泳
垂直電泳
平板電泳
水平電泳
第二十七頁(yè),共六十四頁(yè)。第二十八頁(yè),共六十四頁(yè)。第二十九頁(yè),共六十四頁(yè)。第三十頁(yè),共六十四頁(yè)。2、操(Cao)作
(1)制備分離膠
(2)制備積層膠(堆積膠)第三十一頁(yè),共六十四頁(yè)。第三十二頁(yè),共六十四頁(yè)。第三十三頁(yè),共六十四頁(yè)。第三十四頁(yè),共六十四頁(yè)。第三十五頁(yè),共六十四頁(yè)。第三十六頁(yè),共六十四頁(yè)。分離膠(Jiao)聚合之后第三十七頁(yè),共六十四頁(yè)。第三十八頁(yè),共六十四頁(yè)。第三十九頁(yè),共六十四頁(yè)。第四十頁(yè),共六十四頁(yè)。第四十一頁(yè),共六十四頁(yè)。第四十二頁(yè),共六十四頁(yè)。第四十三頁(yè),共六十四頁(yè)。(3)加樣品
樣品的處理
在蛋白溶液中加入過(guò)量的SDS后,可引起以(Yi)下的反應(yīng):
蛋白質(zhì)本身的電荷被屏蔽
氫鍵斷裂
疏水相互作用被取消
多肽被去折疊(二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞),并形成橢球形第四十四頁(yè),共六十四頁(yè)。①還原SDS處理
當(dāng)加(Jia)入還原試劑DTT或β-二巰基乙醇后,蛋白質(zhì)被完全去折疊,只根據(jù)分子量分離。第四十五頁(yè),共六十四頁(yè)。②帶有烷基化作用的還原SDS處理
烷基化作用可以(Yi)很好地并經(jīng)久牢固地保護(hù)SH基團(tuán),而得到窄的電泳帶。
第四十六頁(yè),共六十四頁(yè)。③非還原的SDS處理
許多樣品,如生理體液、血清或尿素,一般只需(Xu)用1%SDS在100℃煮沸3分鐘,并不需要加還原劑,此時(shí)二硫鍵不能被斷裂,蛋白并沒(méi)有完全被去折疊。
第四十七頁(yè),共六十四頁(yè)。(4)電泳(5)固(Gu)定
第四十八頁(yè),共六十四頁(yè)。(6)染色
考馬斯亮藍(lán)(coomassiebrilliantblue)
①R-250
三苯基甲烷(Wan),紅藍(lán)色,每個(gè)分子含有兩個(gè)SO3H基團(tuán),偏酸性,和氨基黑一樣也是結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上。
第四十九頁(yè),共六十四頁(yè)。第五十頁(yè),共六十四頁(yè)。②G-250
二甲花青(Qing)亮藍(lán),藍(lán)綠色。第五十一頁(yè),共六十四頁(yè)。第五十二頁(yè),共六十四頁(yè)。銀染色
銀染的機(jī)制是將蛋白帶上的硝酸(Suan)銀(銀離子)還原成金屬銀,以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。
第五十三頁(yè),共六十四頁(yè)。第五十四頁(yè),共六十四頁(yè)。(7)照相,凝膠(Jiao)干燥(8)定量測(cè)定
第五十五頁(yè),共六十四頁(yè)。3、電泳過(guò)程中的不正?,F(xiàn)象
(1)“微笑”現(xiàn)象
指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形,說(shuō)明凝(Ning)膠的不均勻冷卻,中間部分冷卻不好。第五十六頁(yè),共六十四頁(yè)。(2)“皺眉”現(xiàn)象
由于垂直電(Dian)泳槽的裝置不合適引起的,特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。
第五十七頁(yè),共六十四頁(yè)。第五十八頁(yè),共六十四頁(yè)。(3)“拖尾”現(xiàn)象
樣品溶解
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