南京科捷液相知識講座

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趙紫來(Ohaozilai@gmail.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!HPLC

故障診斷技術(shù)

Troubleshooting南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!I.I.流動相的相關(guān)問題檢測器背景過高,有時引起基線溢出.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!溶劑的級別及處理方法由于除去了有機或無機污染物，所以使用純水對系統(tǒng)是非常理想的.現(xiàn)在的純水系統(tǒng)都可以給出水中總有機碳的值.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!溶劑級別及處理方法如果水的質(zhì)量很差，在梯度洗脫時，有可能出現(xiàn)鬼峰!南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!溶劑級別及處理方法注意HPLC級別的溶劑只允許有低UV吸收的雜質(zhì)存在.使用前，所有流動相都應(yīng)該經(jīng)0.45um濾膜過濾.如果溶劑有背景吸收,-線性范圍會下降-噪音會增加-基線的穩(wěn)定性會受影響。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!溶劑級別及處理方法2.氯仿Chloroform分析級的氯仿包含3%乙醇，以防止產(chǎn)生碳酰氯這樣的有毒氣體.然而，像乙醇，水在正相分離中可以使硅膠去活，從而導致保留時間不穩(wěn)定。HPLC級的氯仿不包含作為穩(wěn)定劑的乙醇.因此，一旦打開蓋子，就應(yīng)放到冷暗的地方保存，以避免產(chǎn)生有毒氣體.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!溶劑級別及處理方法使用緩沖溶液

使用前必先過濾溶液.為了避免結(jié)晶，系統(tǒng)中不能有殘留溶液::對泵的影響–破壞推桿及密封墊:對色譜柱的影響–導致柱塌陷:對流路的影響–腐蝕不銹鋼流路

注意可能長菌:特別是磷酸緩沖液-是細菌，菌類物質(zhì)生長很好的介質(zhì).

理想狀態(tài)，應(yīng)該每天配置新鮮的緩沖液（尤其夏天）.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!流動相可能引出的問題

當流動相由有機溶劑換成緩沖溶液時，經(jīng)常會出現(xiàn)沉淀等問題.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!溶劑級別及處理方法緩沖溶液有機溶劑南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!流動相可能引出的問題不同的操作者配置的流動相，可能保留時間會不同.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!流動相可能引出的問題

溶劑瓶的問題1.容器一般使用玻璃，因為塑料增塑劑有可能會導致基線不穩(wěn)或是污染柱子。當分析高靈敏度無機離子時，應(yīng)避免使用玻璃容器。2.容器開口處應(yīng)盡量小。這樣可以避免由于溶劑的快速揮發(fā)導致的濃度不穩(wěn)定，這樣也可以降低房間中的揮發(fā)物濃度。注意不要將容器完全密封，這樣會導致局部真空，泵不上液體。

南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!溶劑瓶的問題6.通常使用溶劑過濾器，這是一個粗濾，可以保證溶劑中的顆粒不會進入泵頭。要保證這個濾頭清潔，無菌。如果臟了，可以用異丙醇或是1N的硝酸超聲清洗。7.實驗室中好的習慣是在溶劑瓶上貼上標簽，表明內(nèi)部溶劑的名稱，組成甚至制備的日期。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!樣品處理問題1.通常都是將樣品溶解在流動相中，流動相中樣品的溶解度是最好的.-減小溶劑峰，尤其是感興趣的樣品洗脫出來離溶劑峰很近的情況。-保證樣品在流動相中的溶解度，保證在系統(tǒng)，特別是柱子中不出現(xiàn)沉淀凝結(jié)的現(xiàn)象。-保證樣品溶液與流動相之間的可混合性。2.

通常進樣前，我們用0.45um的過濾膜過濾樣品。

如果預(yù)先知道樣品很臟，可以在進樣前用0.2um的過濾膜過濾南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!Rheodyne手動進樣器1.部分充滿定量環(huán)進樣方法。-進樣量要小于定量環(huán)體積的一半。2.全充滿定量環(huán)進樣方法。-進樣量要大于定量環(huán)體積的3倍。(Laminarfloweffect)南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!正確的進樣方法(手動)樣品進樣方法:-先插入進樣針在INJECT

孔處-旋到LOAD位置.上樣

-推入樣品.

-旋轉(zhuǎn)到INJECT位置,進樣

-移走進樣針.

-清洗進樣口.

南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!進樣污染產(chǎn)生交叉污染!當樣品濃度很大，檢測器又在一個靈敏的使用范圍時，交叉污染很容易出現(xiàn)。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!進樣器漏液南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!檢查新柱子1.柱效檢查

柱效的檢查可以在色譜柱使用前，根據(jù)廠家提供的色譜柱報告上的方法及混合樣品來測定。2.壓力檢查

正常分析條件下，初始色譜柱操作壓力應(yīng)該記錄下來，作為今后實驗的參考。3.

保護柱

應(yīng)盡量使用保護柱，但應(yīng)注意不要給系統(tǒng)增加過大的壓力。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!操作中的注意事項使用前，最好過濾流動相及樣品，避免顆粒物產(chǎn)生堵塞。5.樣品最好溶解在流動相中，如果不是，最好也要接近流動相的組成。這樣會減少樣品在流動相中的不溶物沉淀在柱子中。6.日常使用后，可用強溶劑沖洗色譜柱。例如：ODS柱每天使用完后，可用乙腈沖洗色譜柱，以除去柱子中強吸收的樣品。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!色譜柱的問題及解決辦法篩板或色譜柱填料預(yù)先要用0.45um的濾膜過濾樣品和流動相，如果樣品很臟的話，需要用0.25um的濾膜過濾。盡管如此，有時候由于實驗時間有限，流動相或是樣品處理不徹底，還會有臟東西進入系統(tǒng)，造成堵塞。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!吸附樣品&溶劑雜質(zhì)色譜柱的問題及解決辦法雜質(zhì)將會導致峰托尾.可以用強溶劑沖洗色譜柱.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!填料干枯色譜柱的問題及解決辦法一般來講，特別對于聚合物色譜柱，填料膨脹的特性依賴于溶劑。因此，當色譜柱干了的時候，填料有可能發(fā)生變形。特別是GPC色譜柱，溶劑的選擇非常特殊。不僅要避免干枯，而且不能使用錯誤的溶劑，否則整個聚合物色譜柱的特性（形狀及粒徑）都有可能發(fā)生變化。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!廢液瓶務(wù)必保證廢液管沒有深入到廢液中，否則的話，檢測池的壓力很容易升高。檢測器帶來的問題南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!1.系統(tǒng)中大的壓力波動.可能的原因:系統(tǒng)漏液單向閥被污染在線過濾器被污染柱塞密封圈壞/漏解決辦法:1.

檢查連接處或是檢測池是否有漏液。特別是任何新出現(xiàn)的連接處（如：新柱子/檢測器之間）。有時，特別是用PEEK材質(zhì)的管線連接時，如果加過高壓后，連接部分可能會松，也容易漏。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!2.系統(tǒng)壓力增高可能的原因:1.堵塞A.檢測池B.柱壓力慢慢變大C.泵D.混和氣E.管線南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!2.系統(tǒng)壓力增高情況2:系統(tǒng)壓力突然增加-系統(tǒng)突然堵塞;可能在系統(tǒng)的某部分突然堵塞.檢查方法:1.檢查系統(tǒng)堵塞的方法

(從尾到頭)a.從檢測器端斷開色譜柱，壓力如果正常，說明檢測池或從管線到檢測池堵塞。b.如果壓力仍然很高，斷開色譜柱（分析柱）。（1ml/min的流速下）帶保護柱的正常壓力應(yīng)該是不高于5kgfcm-2。如果壓力正常，清洗或是更換色譜柱（分析柱）。c.如果壓力仍然高，除去保護柱。壓力正常，更換保護柱。d.如果壓力仍高，就可能使混和氣或是泵的問題了。如果管線堵了，可以使用IPA或硝酸高流速沖洗，但此時不要連接色譜柱或是檢測器。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!峰形變化--A.不對稱(前伸/拖尾)情況1:方法開發(fā)可能的原因:1.不適當?shù)娜軇┻x擇南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!峰形變化--A.不對稱(前伸/拖尾)情況2:在已存在的方法中，峰形突然扭曲1.色譜柱(Guard/Main)出現(xiàn)問題.–清洗或更換色譜柱.2.高PH(>7)使用硅膠柱時，柱子出現(xiàn)溶解.3.可能是二級封端不完全造成的影響.

4.特殊情況下,死體積增大,引起譜帶加寬.

南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!流動相可能引出的問題梯度洗脫時出現(xiàn)鬼峰!南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!溶劑級別及處理方法不同的分析及HPLC流動相級別南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!溶劑級別及處理方法在配置，處理HPLC級別溶劑的注意事項:1.THF分析級的THF包含butylatedhydroxytoluene(BHT)作為抗氧化抑制劑.因為BHT有很強的紫外吸收,所以在HPLC級別的THF中沒有BHT.因此,HPLC級別的THF必須儲藏在冷暗的地方，盡量避免氧化.積累了大量的有機氧化物可能會引起爆炸.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!流動相可能引出的問題當流動相中使用了緩沖溶液，那么泵壓將會明顯增加.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!溶劑級別及處理方法溶劑過濾裝置南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!溶劑級別及處理方法流動相的改變步驟南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!溶劑級別及處理方法在系統(tǒng)更換全部有機流動相之前，應(yīng)注意以下幾點,系統(tǒng)應(yīng)用水/有機相（1：1）比例混合，來去除曾經(jīng)用過的緩沖溶液。否則，當有機相遇到殘留的緩沖液時，系統(tǒng)會出現(xiàn)結(jié)晶的現(xiàn)象。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!溶劑級別及處理方法溶劑的預(yù)混合對于單元系統(tǒng),分析前我們經(jīng)常要預(yù)先配好混合溶劑.例如：要配置

100ml的50:50甲醇和水的混合溶劑,我們可以:1.各稱量50ml的水和50ml甲醇，再把它們混合到一起.2.稱量50ml水，再用甲醇定容到100ml容器中。3.稱量50ml甲醇，用水定容到100ml容器中.所有這三種方法都將獲得不同的結(jié)果。無論選用哪種，都應(yīng)一直使用這種方法，以獲得較好的重復性。推薦使用種方法。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!溶劑瓶的問題3.當使用不太穩(wěn)定的溶劑時,或者每天制備新的溶劑，或者在溶劑瓶中充入惰性氣體，例如氦氣。4.不要將溶劑直接放在通風口，窗口或是門口；不要直接放在陽光下。這樣會導致溫度的變化，增加揮發(fā)。通常情況下，對RI檢測器影響最大，有時候也會影響到UV檢測器。5.一般情況下，要將溶劑瓶放置在高于溶劑傳輸系統(tǒng)（泵）的位置，這樣可以保證泵有好的虹吸效果，同時避免泵空走。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!II.樣品可能引出的問題進樣后，系統(tǒng)壓力都會迅速增加。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!III.進樣可能引出的問題手動進樣，重現(xiàn)性不好。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!Rheodyne手動進樣器進樣體積和檢測器反映值之間的關(guān)系(峰面積)南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!正確的進樣方式(自動進樣器)1.至少每天都要清洗流路.2.至少每周都要改變清洗液.3.不可以用鹽溶液作為清洗液.4.使用廠家推薦的自動進樣瓶瓶墊.5.瓶墊不可以重復使用.6.不要把瓶子充滿.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!進樣器清洗-使用標準的針清洗接頭清洗–使用后最好清洗南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!IV.色譜柱可能引起的問題當我們擁有了一根新的色譜柱，我們?nèi)绾螜z測它的初始柱效能?南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!操作中的注意事項.作為新色譜柱，最好在使用前，低于分析流速下（0.2-0.3ml/min）過大約30分鐘。色譜柱如果長時間沒有使用，再次投入使用前，也要做相似的工作。2.關(guān)機時，最好逐步降低流速，不要突然降低壓力，這樣對色譜柱以及系統(tǒng)都會有影響。3.當使用緩沖溶液時，切記要先用水沖洗系統(tǒng)，再改用有機溶劑，這樣可以避免結(jié)晶現(xiàn)象出現(xiàn)，堵塞柱子。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!色譜柱的問題及解決辦法柱篩板或柱吸附了樣品或溶劑的雜質(zhì)形成化學結(jié)晶,或者保存包裝不當,使柱子填充材料干燥,會引起下列問題系統(tǒng)壓力增高,峰型不好(拖尾,前伸,分叉),保留時間改變.

南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!色譜柱的問題及解決辦法正常情況下，用強溶劑沖洗色譜柱，可以除去這些顆粒。但有時不溶的顆粒用這種方法很難除去，這時，可以考慮反沖色譜柱。注意：這時不要連接檢測器。最終，如果沖洗不能解決問題的話，可以更換過濾篩板。但是更換時要很小心，不要破壞柱床，否則柱效會降低。不銹鋼篩板是固定在色譜柱上的，所以盡量不要更換。南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!填料的化學腐蝕色譜柱的問題及解決辦法注意：對于基于聚合物的色譜柱，必須要檢查每一項的值南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!V.檢測器有可能引發(fā)的問題基線漂移.南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!VI.其他類型的問題1.系統(tǒng)大的壓力波動.2.系統(tǒng)高壓.3.基線不穩(wěn)

A.漂移B.噪音4.峰形變化A.不對稱(前伸/拖尾)B.分叉南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!2.如果沒有發(fā)現(xiàn)漏液，接下來要檢查泵頭的后面。在泵頭后面，管線連接著洗滌瓶。如果密封墊漏液，液體有時可以流出。如果洗滌瓶的水面看起來上升了，說明泵頭漏液。如果漏液可以觀察到，那么說明柱塞桿受到破壞。需要更換柱塞桿密封墊。

注意：(A)更換泵密封墊時，需要半小時老化新墊，在這個期間，可能會出現(xiàn)壓力波動，這是正常的。

（B）更換柱塞密封墊時，一定要注意觀察柱塞桿，如果出現(xiàn)劃痕，應(yīng)更換柱塞桿，否則密封墊也很容易被損壞。3.如果,沒有發(fā)現(xiàn)泵頭泄露,,就要檢查單向閥或在線過濾器.它們可以移下來先用IPA(異丙醇)后用水超聲波清洗(各15分鐘),對于頑固的污點,可以使用1N的硝酸,如果還不行,更換單向閥.1.系統(tǒng)中大的壓力波動南京科捷液相知識講座共55頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!維護方法:情況1:

壓力逐漸升高(每天或每月)-最大的可能是色譜柱堵了.-色譜柱中積累了顆?；蚴俏搅穗s質(zhì)解決辦法:1.使用在色譜柱介紹說明中提到的方法清洗