高三生物二輪復習講義非選擇題專項突破5：借用實驗設計思路破解生物工程題目

高三生物二輪復習非選擇題專項突破借用實驗設計思路破解生物工程題目【真題剖析】(2022·山東等級考)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā),蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解,藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理,需構建重組載體以獲得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一種短肽,連接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合,但不影響P或PΔ的功能。(1)為構建重組載體,需先設計引物,通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是,

為使PCR產物能被限制酶切割,需在引物上添加相應的限制酶識別序列,該限制酶識別序列應添加在引物的(填“3'端”或“5'端”)。

(2)PCR擴增得到的P基因經酶切連接插入載體后,與編碼FLAG的序列形成一個融合基因,如圖甲所示,其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后,融合基因轉錄出的mRNA序列正確,翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確,但P基因對應的氨基酸序列與P不同。據圖甲分析,出現(xiàn)該問題的原因是

。修改擴增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題,具體修改方案是

。(3)融合蛋白表達成功后,將FLAG-P、FLAG-PΔ、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經含F(xiàn)LAG抗體的介質,分離出與介質結合的物質并用UBC抗體檢測,檢測結果如圖丙所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC,由①②③組結果的差異推測,藥物A的作用是;由②④組或③⑤組的差異推測,PΔ中缺失的特定序列的作用是。

(4)根據以上結果推測,藥物A治療該病的機理是。

[答題模板]以實驗設計的思路,梳理題目信息項目內容目的利用基因工程探索藥物A治療由蛋白P引發(fā)的白血病的機理原理①將P基因或P△基因插入含編碼FLAG的序列的載體中,獲得含融合基因重組載體,將該重組載體導入細胞后使其正確表達,即可獲得融合蛋白。②利用抗原—抗體雜交技術檢測,若樣品中含有FLAG,它們就會被含F(xiàn)LAG抗體的介質滯留;用抗UBC的抗體檢測介質中的UBC含量,若出現(xiàn)UBC的條帶,說明FLAG-P或FLAG-P△能與UBC結合操作步驟(1)設計引物,利用PCR技術擴增P基因。設計的引物需能與P基因模板鏈的一段堿基序列互補配對(2)將P基因插入載體,與編碼FLAG的序列形成融合基因。為了使P基因能與載體連接,需在引物的5'端添加限制酶識別的序列(3)將重組載體導入細胞并使其表達融合蛋白。由圖甲可知,由于EcoRⅠ識別序列的添加,P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸,導致mRNA的密碼子被錯位讀取。因此可在引物中的EcoRⅠ識別序列3'端添加1個堿基解決此問題(4)將FLAG-P、FLAG-P△、藥物A和UBC按照不同組合分成圖乙所示①~⑤五組,分別流經含F(xiàn)LAG抗體的介質,分離出與介質結合的物質并用UBC抗體檢測,以此確定P是否能結合UBC,以及藥物A對P與UBC結合的影響檢測結果分析按照單一變量原則對圖丙結果進行分析:①和②單一變量是有無FLAG,兩組對比可知UBC能與P結合并通過FLAG滯留在介質處;②和③單一變量是有無藥物A,兩組對比可知藥物A能促進UBC與P的結合;②和④或③和⑤的單一變量為是否缺失P中特定氨基酸序列,通過對比可知P中特定氨基酸序列參與P與UBC的結合結論藥物A通過增強P與UBC結合促進P降解模板構建1.題目特點:此類試題往往為“任務驅動型”,圍繞實現(xiàn)某一任務或實驗目的過程中使用的工程技術、原理、以及最終結果分析和應用設置一系列問題。2.答題模板:此類試題中涉及的工程技術和原理一般為達成最終的目的服務,因此可借助實驗設計的思路,梳理并理解題目中涉及的工程技術流程,并結合題目相關信息和工程技術原理進行分析作答。3.關鍵點:明確題目中為答成任務目標而涉及的工程技術、原理以及實驗分析方法答案:(1)能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸5'端(2)P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸,導致mRNA的密碼子被錯位讀取在引物中的EcoRⅠ識別序列3'端添加1個堿基(3)增強FLAG-P與UBC的結合參與P與UBC的結合(4)通過增強P與UBC結合促進P降解[評分細則]規(guī)范答題不失分評分細則答題規(guī)則(1)4分。第一空2分,能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。只答出“短單鏈核酸”得1分;第二空2分,5'端。(2)4分。第一空2分,P基因編碼的第一個堿基(或A)與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基(或TC)編碼一個氨基酸,導致的RNA的密碼子被錯位讀取(其他相同含義的描述也可);第二空2分,在引物的EcoRⅠ識別序列3'端添加1個堿基。(3)2分。第一空1分,增強(或加強、促進)FLAG-P(或P)與UBC結合;第二空1分,參與P與UBC的結合(作用)或P與UBC的結合(作用)位點。(4)2分。藥物A通過增強P與UBC結合(作用)促進P降解,或答成藥物A能促進藥物P降解。其他答案不得分規(guī)則1.盡量使用課本中的語句作答。規(guī)則2.生物學名詞要書寫正確。規(guī)則3.答題要完整、全面。規(guī)則4.理由的得出應根據實驗結果,并且答題符合邏輯【典例訓練】1.某地中海貧血(TDT)是單基因病,嚴重時可能危及生命。人類γ基因啟動子上游的調控序列中含有BCL11A蛋白結合位點,該位點結合BCL11A蛋白后,γ基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列,解除對γ基因表達的抑制,可對TDT患者進行基因治療?？蒲腥藛T擴增了γ基因上游不同長度的片段,將這些片段分別插入表達載體中進行轉化和熒光檢測,以確定BCL11A蛋白結合位點的具體位置。相關信息如圖所示。(1)圖中啟動子是識別和結合位點,且啟動子是具有方向性的,目的基因只有正確插入啟動子和終止子之間才能正確表達。在表達載體中綠色熒光蛋白基因作為,要使綠色熒光蛋白基因表達出來,圖b中還缺啟動子,請判斷即將插入的啟動子方向(填“向左”或“向右”)。

(2)PCR擴增γ基因上游不同DNA片段的原理是,為使PCR反應體系中的模板解鏈為單鏈,需要滿足的條件是。

(3)將擴增后的產物定向插入載體指導綠色熒光蛋白基因表達,需要在引物末端添加限制酶識別序列。據圖可知,在R末端添加的序列所對應的限制酶應為,在F1~F7末端添加的序列所對應的限制酶是。

(4)從產物擴增到載體構建完成的整個過程中,除限制酶外,還必須用到的工具酶有DNA連接酶和,其中前者催化形成的化學鍵是。

(5)將構建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞,成功轉化后,含F(xiàn)1~F6與R擴增產物的載體表達熒光蛋白,受體細胞有熒光,含F(xiàn)7與R擴增產物的受體細胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴增產物的受體細胞無熒光的原因是。

(6)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素,含F(xiàn)1~F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光,而含F(xiàn)5~F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光。若γ基因上游調控序列上與引物序列所對應的位置不含有BCL11A蛋白的結合位點序列,據此結果可推測,BCL11A蛋白結合位點位于

。

【解析】(1)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的位點,用于基因的轉錄。綠色熒光蛋白基因作為表達載體中的標記基因。要使綠色熒光蛋白基因表達出來,圖b中還缺啟動子,即將插入的啟動子方向向左。(2)PCR擴增的原理是DNA雙鏈復制。在體外利用PCR技術擴增目的基因時,利用DNA的高溫變性加熱至90~95℃,破壞雙鏈之間的氫鍵,使DNA解鏈變?yōu)閱捂湣?3)據圖中對限制酶的注釋可知,限制酶MunⅠ識別切割后的黏性末端與限制酶EcoRⅠ識別切割后的黏性末端相同,故R末端添加的序列所對應的限制酶是EcoRⅠ。在F1~F7末端添加的序列所對應的限制酶是SalⅠ。(4)從產物擴增到載體構建完成的整個過程中,除限制酶外,還必須用到的工具酶有DNA連接酶和耐高溫的DNA聚合酶,DNA連接酶作用的對象是磷酸二酯鍵。(5)只有擴增產物中含有完整的啟動子,熒光蛋白基因才能表達,含F(xiàn)7與R擴增產物的受體細胞無熒光的原因是F7與R擴增產物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達。(6)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素,此時重組載體上的BCL11A基因表達,產生BCL11A蛋白,BCL11A蛋白與BCL11A蛋白結合位點結合后,導致熒光蛋白基因被抑制;含F(xiàn)1~F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光,則說明BCL11A蛋白結合位點在引物F4與引物R之間的序列上,含F(xiàn)5~F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光,則說明BCL11A蛋白結合位點在引物F5的上游序列,故據此結果可推測,BCL11A蛋白結合位點位于引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區(qū)段上。答案:(1)RNA聚合酶標記基因向左(2)DNA雙鏈復制加熱至90~95℃(3)EcoRⅠSalⅠ(4)耐高溫的DNA聚合酶磷酸二酯鍵(5)F7與R擴增產物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達(6)引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區(qū)段上2.金黃色葡萄球菌是食源性致病菌,隨著抗生素的大量使用,金黃色葡萄球菌的耐藥性越來越強,給臨床治療帶來了極大的困難。已知金黃色葡萄球菌的耐鹽性高,并能夠利用甘露糖醇產酸,從而使溴麝香草酚藍溶液變黃。某興趣小組對生鮮肉中金黃色葡萄球菌進行了分離、鑒定,過程如圖所示。(1)培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質一般都含有等。高鹽平板2能夠鑒定金黃色葡萄球菌,則該平板與高鹽平板1相比,還需添加,

并選取使培養(yǎng)基呈色的菌株進行保存或進一步實驗。

(2)高鹽平板2的接種方法是,用此方法計數時,所得的菌落數比活菌數目偏少,原因是。

(3)抑菌圈是指利用待測藥物在瓊脂平板中的擴散,使其周圍的細菌生長受到抑制而形成的透明圈。為檢測金黃色葡萄球菌的抗藥性,將浸有不同抗生素且大小相同的紙片分別貼附在涂有金黃色葡萄球菌的平板上,培養(yǎng)一段時間后,結果如圖所示。由圖可知,該菌對抗生素(填序號)的抗性最強。如果隔一段時間后在抑菌圈中又長出少許菌落,分析其原因可能有(至少寫出兩種)。

【解析】(1)培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質一般都含有水、無機鹽、氮源、碳源。結合題意“金黃色葡萄球菌的耐鹽性高,并能夠利用甘露糖醇產酸,從而使溴麝香草酚藍溶液變黃”可知,高鹽平板2能夠鑒定金黃色葡萄球菌,該平板屬于鑒定培養(yǎng)基,故應添加甘露糖醇和溴麝香草酚藍溶液;在該培養(yǎng)基上金黃色葡萄糖球菌可以利用甘露糖醇產酸從而使溴麝香草酚藍溶液變黃,故應選取黃色的菌株進行保存或進一步實驗。(2)據圖可知,高鹽平板2上的菌落均勻分布,該接種方法是稀釋涂布平板法;稀釋涂布平板法計數時,當兩個或多個細胞連在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落,故用此方法計數時,所得的菌落數比活菌數目偏少。(3)據圖可知,接種頭孢唑林的培養(yǎng)基中的抑菌圈最大,即表明頭孢唑林對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強,而④氧氟沙星的抑菌圈最小,說明該菌對其抗性最強。如果隔一段時間后在抑菌圈中又長出少許菌落,原因可能是該菌產生了抗性突變;落入了雜菌;抗生素失效。答案:(1)水、無機鹽、氮源、碳源甘露糖醇和溴麝香草酚藍溶液黃(2)稀釋涂布平板法當兩個或多個細胞連在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落(3)④該菌產生了抗性突變;落入了雜菌;抗生素失效3.研究發(fā)現(xiàn)增強子是基因轉錄的調控序列,它可以位于基因的上游,也可以位于基因的下游。人肺特異性X蛋白基因(LUNX基因)僅在上顎、鼻咽和氣管等呼吸道部位表達,可作為非小細胞肺癌診斷的標志物。為了研究LUNX基因的增強子是否具有促進基因表達的功能,以及其發(fā)揮作用的位置是位于基因的上游還是下游,科研人員首先通過PCR技術擴增了LUNX基因的3個增強子片段(E1~E3),然后分別連接到pGL3質粒中熒光素酶報告基因(Luc+)的上游或下游,最后通過檢測熒光素酶的活性進行判斷。(1)通過PCR擴增LUNX基因的增強子片段時,需要在反應體系中添加引物的原因是。擴增E1片段時,需選用圖1中的引物,為了將E1片段與pGL3質粒相連,應在引物的端添加限制酶切割位點。

(2)構建含LUNX基因增強子的重組載體時,需要對通過(1)獲得的PCR產物和圖2中的pGL3質粒分別進行雙酶切,這樣做的目的是,最終構建出種重組載體。

(3)已知熒光素酶報告基因(Luc+)的表達強度越高,熒光素酶的活性越高,該實驗中各組熒光素酶活性的檢測結果如圖所示。根據實驗結果推測,在E1~E3中促進基因表達的功能最強。E1~E3發(fā)揮作用的位置不同之處在于

。

【解析】(1)通過PCR擴增LUNX基因的增強子片段時,需要在反應體系中添加引物的原因是耐高溫的DNA聚合酶不能從頭開始合成子鏈,只能從引物的3'開始子鏈的延伸。擴增E1片段時,結合子鏈延伸的方向以及目的基因的位置可確定需選用圖1中的引物2和3,為了將E1片段與pGL3質粒相連,應在引物的5'端添加限制酶切割位點,從而為目的基因的切割做準備。(2)構建含LUNX基因增強子的重組載體時,需要對通過(1)獲得的PCR產物和圖2中的pGL3質粒分別進行雙酶切,這樣可以將E1~E3定向連接到Luc+的上游或下游,避免自連和反向連接,最終根據目的基因的種類和連接部位構建出6種重組載體。(3)題圖中顯示E1增強子位于下游時,熒光素酶活性最高,說明此時熒光素酶的表達量最大,因此可以推測,在E1~E3中,E1促進基因表達的功能最強,且在下游效果最好。根據相關數據可以看出,E1~E3發(fā)揮作用的位置不同之處在于E1和E2只在基因的下游時增強基因的表達,E3在基因的上游和下游時都能增強基因的表達。答案:(1)耐高溫的DNA聚合酶不能從頭開始合成子鏈2和35'(2)將E1~E3定向連接到Luc+的上游或下游6(3)E1E1和E2只在基因的下游時增強基因的表達,E3在基因的上游和下游時都能增強基因的表達4.β-1,3葡聚糖酶可以水解許多病原真菌細胞壁外層的β-1,3葡聚糖和幾丁質,降解真菌細胞壁,從而抑制真菌的生長與繁殖。研究人員在植物中克隆到β-1,3葡聚糖酶基因(BG2)并轉入蘋果主栽品種,以減少蘋果真菌病害、實現(xiàn)無公害生產?；卮鹣铝袉栴}:(1)BG2的克隆可利用PCR技術,該過程需要一對特異性引物,引物是指

。

在體外對目的基因進行大量復制后,常采用來鑒定產物。

(2)如圖為利用PATC940(由農桿菌Ti質粒改造獲得)構建BG2抗病質粒的過程。圖中右下處的酶為,人工設計的復合啟動子的作用是。XbaⅠ酶切后片段與SpeⅠ酶切后的片段能進行連接的原因是。

(3)構建BG2抗病質粒完成后,首先將BG2重組抗病質粒導入農桿菌,該過程中需要用CaCl2處理農桿菌,目的是。研究人員將轉入BG2抗病質粒的農桿菌與蘋果外植體共培養(yǎng),以進行遺傳轉化。目的基因BG2將隨著T-DNA轉移到被侵染的細胞而進入細胞,并隨其整合到上。

(4)在完成遺傳轉化后,需要不斷觀察和檢測轉基因蘋果植株在田間的生長狀態(tài),以確定目的基因是否賦予了蘋果植株。【解析】