七章工業(yè)發(fā)酵染菌的防治

七章工業(yè)發(fā)酵染菌的防治第1頁(yè)/共70頁(yè)本章內(nèi)容簡(jiǎn)介染菌的危害染菌的發(fā)現(xiàn)染菌的分析染菌的預(yù)防染菌后的挽救第2頁(yè)/共70頁(yè)1染菌的危害浪費(fèi)原材料，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計(jì)劃影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量第3頁(yè)/共70頁(yè)1.1染菌對(duì)發(fā)酵的影響生產(chǎn)菌種污染微生物的種類和性質(zhì)、污染菌量污染時(shí)間，污染途徑培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件第4頁(yè)/共70頁(yè)感染不同種類和性質(zhì)雜菌對(duì)發(fā)酵的影響不同染菌對(duì)不同產(chǎn)品的影響不同不同染菌時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響不同染菌危害第5頁(yè)/共70頁(yè)一、染菌對(duì)不同產(chǎn)品的影響青霉素：產(chǎn)量降低；疫苗：全部廢棄。檸檬酸：前期染菌嚴(yán)重；氨基酸：噬菌體污染常發(fā)生；核苷酸：易染菌（生產(chǎn)菌常為缺陷型，生長(zhǎng)慢）；鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素：程度不同地降低產(chǎn)量?；尹S霉素、制霉菌素、克念菌素：抑制霉菌，對(duì)細(xì)菌幾乎沒(méi)有抑制和殺滅作用。第6頁(yè)/共70頁(yè)二、不同種類和性質(zhì)的雜菌對(duì)發(fā)酵的影響污染噬菌體噬菌體的感染力強(qiáng)，傳播蔓延迅速，也較防治，故危害極大。污染噬菌體后，可使發(fā)酵產(chǎn)量大幅度下降，嚴(yán)重的造成斷種，被迫停產(chǎn)。

第7頁(yè)/共70頁(yè)污染其它雜菌有些雜菌會(huì)使生產(chǎn)菌自溶產(chǎn)生大量泡沫，即使添加消泡劑也無(wú)法控制逃液，影響發(fā)酵過(guò)程的通氣攪拌。有的雜菌會(huì)使發(fā)酵液發(fā)臭、發(fā)酸，致使pH下降，使不耐酸的產(chǎn)品破壞。

芽孢桿菌耐熱，不易殺死。

第8頁(yè)/共70頁(yè)不同發(fā)酵對(duì)雜菌感染的敏感性不同。(1)青霉素和鏈霉素：細(xì)短桿菌的危害大于粗大桿菌；(2)四環(huán)素：對(duì)雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌污染敏感；(3)檸檬酸：對(duì)青霉菌敏感；(4)核苷酸：對(duì)芽孢桿菌敏感(5)氨基酸：對(duì)噬菌體敏感；第9頁(yè)/共70頁(yè)三、不同染菌時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響污染時(shí)間：無(wú)菌檢測(cè)方法測(cè)出的污染時(shí)間，不是雜菌竄入培養(yǎng)液的時(shí)間。(1)種子染菌：影響最大；(2)前期：滅菌后重新接種；(3)中期：對(duì)生產(chǎn)影響大；(4)后期：一般不嚴(yán)重，若嚴(yán)重時(shí)可放罐；

第10頁(yè)/共70頁(yè)1.4發(fā)酵染菌對(duì)提煉和產(chǎn)品質(zhì)量的影響1）發(fā)酵染菌對(duì)過(guò)濾的影響粘度大過(guò)濾困難拉長(zhǎng)過(guò)濾時(shí)間，影響設(shè)備周轉(zhuǎn)降低過(guò)濾收率影響程度：雜菌種類，污染程度措施：加熱、冷卻、添加助濾劑等第11頁(yè)/共70頁(yè)2）發(fā)酵染菌對(duì)提煉的影響沉淀法：雜質(zhì)污染產(chǎn)物有機(jī)溶劑萃?。喝榛y分離。離子交換：降低離子交換樹(shù)脂的交換容量，雜菌難沖洗干凈，洗脫時(shí)與產(chǎn)物一起進(jìn)入洗脫液。第12頁(yè)/共70頁(yè)2染菌的表現(xiàn)種子：生長(zhǎng)緩慢菌絲結(jié)團(tuán)代謝異常第13頁(yè)/共70頁(yè)發(fā)酵：菌體生長(zhǎng)差pH異常溶氧異常泡沫過(guò)多菌體濃度異常第14頁(yè)/共70頁(yè)3染菌的分析總?cè)揪手敢荒臧l(fā)酵染菌的批（次）數(shù)與總投料批（次）數(shù)之比的百分率。包括染菌后培養(yǎng)基經(jīng)重新滅菌，又再次染菌的批次數(shù)在內(nèi)?？?cè)揪?=第15頁(yè)/共70頁(yè)染菌原因：種子、無(wú)菌空氣、設(shè)備滲漏、滅菌不徹底、操作不當(dāng)、管理不善等。染菌時(shí)間早期：種、氣、設(shè)備、滅菌不徹底、操作不當(dāng)；后期：補(bǔ)料不當(dāng)、滲漏。第16頁(yè)/共70頁(yè)染菌種類耐熱芽孢桿菌：滅菌不徹底；球菌或無(wú)芽孢桿菌：種、滲漏；淺綠色雜菌：冷水管滲漏；霉菌：滅菌不徹底或操作問(wèn)題；染菌幅度各個(gè)或數(shù)個(gè)發(fā)酵罐感染相同雜菌：空氣系統(tǒng)；個(gè)別罐連續(xù)感染雜菌：設(shè)備問(wèn)題；第17頁(yè)/共70頁(yè)日本工業(yè)技術(shù)院發(fā)酵研究所多年來(lái)抗生素發(fā)酵染菌原因分析項(xiàng)目百分率%種子帶菌或懷疑種子帶菌9.64接種時(shí)罐壓跌零0.19培養(yǎng)基滅菌不透0.79總空氣系統(tǒng)有菌19.96泡沫冒頂0.48夾套穿孔12.36盤管穿孔5.89接種管穿孔0.39閥門滲漏1.45攪拌軸密封滲漏2.09罐蓋漏1.54其它設(shè)備滲漏10.13操作原因10.15

原因不明24.94第18頁(yè)/共70頁(yè)上海第三制藥廠染菌原因分析項(xiàng)目百分率%種子帶菌14.15盤管穿孔14.20閥門滲漏23.30空氣系統(tǒng)有菌10.0管理不善25.80其它7.49原因不明5.78

第19頁(yè)/共70頁(yè)管理不善而染菌的有31個(gè)罐批，占25.08％經(jīng)分析有下表所列原因：項(xiàng)目百分率%進(jìn)罐前未做設(shè)備嚴(yán)密度檢查25.8接種違反操作規(guī)程25.8檢修質(zhì)量缺乏驗(yàn)收制度19.35操作不熟練19.35配料違反工藝規(guī)程6.45調(diào)度不當(dāng)3.25第20頁(yè)/共70頁(yè)第四制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析項(xiàng)目百分率%外界帶入雜菌（取樣、補(bǔ)料）8.20設(shè)備穿孔7.60空氣系統(tǒng)有菌26.00停電罐壓跌零1.60接種11.00蒸汽壓力不足或蒸汽量不足0.60管理問(wèn)題7.80操作違反規(guī)程1.60種子帶菌0.60原因不明35.00第21頁(yè)/共70頁(yè)染菌的原因有多種，對(duì)于實(shí)際情況如何分析呢？單罐染菌不是系統(tǒng)問(wèn)題，而是該罐本身的問(wèn)題。如種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、罐有滲漏、分過(guò)濾器失效多罐染菌系統(tǒng)問(wèn)題，如空氣過(guò)濾系統(tǒng)有問(wèn)題，特別是總過(guò)濾器長(zhǎng)期沒(méi)有檢查，可能受潮失效；移種或補(bǔ)料的分配站有滲漏或滅菌不徹底第22頁(yè)/共70頁(yè)前期染菌種子帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底中后期染菌補(bǔ)料的料液滅菌不徹底或補(bǔ)料管道、閥門滲漏，一般不會(huì)是種子問(wèn)題第23頁(yè)/共70頁(yè)檢查與判斷表觀法：溶氧水平排氣中CO2實(shí)驗(yàn)法：鏡檢法平皿劃線或斜面檢查法肉湯培養(yǎng)法第24頁(yè)/共70頁(yè)1）防止種子帶菌4染菌的預(yù)防種子帶菌的原因滅菌不徹底(如假壓)；移種污染；養(yǎng)或保藏過(guò)程中污染；無(wú)菌室管理不善；第25頁(yè)/共70頁(yè)制備壯、純、量足的種子是發(fā)酵成功的關(guān)鍵，為此：強(qiáng)化無(wú)菌室的管理(使用前滅菌)；嚴(yán)格接種、移種的無(wú)菌操作；在擴(kuò)培各階段定時(shí)取樣做無(wú)菌實(shí)驗(yàn)；嚴(yán)格接種管滅菌，并用無(wú)菌空氣保壓；第26頁(yè)/共70頁(yè)無(wú)菌狀況的檢測(cè)環(huán)境無(wú)菌的檢查塵埃粒子檢測(cè)無(wú)菌平板檢測(cè)第27頁(yè)/共70頁(yè)無(wú)菌室要求打開(kāi)紫外燈，照半小時(shí)，關(guān)燈后15分鐘再接種。消毒藥水擦桌子、拖地，開(kāi)啟超凈臺(tái)的通風(fēng)，接種時(shí)必須在超凈臺(tái)上操作，保證無(wú)菌條件。接種人員必須穿好無(wú)菌服，戴好口罩，手用酒精棉球擦干凈。第28頁(yè)/共70頁(yè)第29頁(yè)/共70頁(yè)種子及發(fā)酵液無(wú)菌狀況檢測(cè)梭狀芽孢桿菌雙球菌T4噬菌體細(xì)菌第30頁(yè)/共70頁(yè)2）防止空氣引起的染菌流程或設(shè)備設(shè)計(jì)的合理性；過(guò)慮介質(zhì)選用、裝填；過(guò)慮介質(zhì)的滅菌和管理；從日本工業(yè)技術(shù)院和上海第四制藥廠分析空氣帶菌而造成的染菌分別為19.96％和26%?？諝獬到y(tǒng)復(fù)雜，環(huán)節(jié)多，偶遇不慎便會(huì)導(dǎo)致空氣除菌失敗。第31頁(yè)/共70頁(yè)空氣過(guò)濾除菌設(shè)備流程空壓機(jī)儲(chǔ)罐二級(jí)冷卻加熱器空氣過(guò)濾粗過(guò)濾第32頁(yè)/共70頁(yè)空氣冷卻器的列管穿孔泄露，冷卻水會(huì)滲入到空氣中，造成染菌。棉花-活性炭過(guò)濾器長(zhǎng)期使用后變薄的一邊失效。過(guò)濾介質(zhì)受潮失效：過(guò)濾器滅菌完畢應(yīng)立即緩慢通入壓縮空氣，將水分吹干。超細(xì)纖維紙作過(guò)濾介質(zhì)，滅菌時(shí)必須將管道中冷凝水放干凈，以免介質(zhì)受潮失效。在生產(chǎn)實(shí)踐中，空氣管道大多與其它物料管道相接，要裝上止逆閥防止其它物料竄入空氣管道污染過(guò)濾器，導(dǎo)致過(guò)濾介質(zhì)失效。第33頁(yè)/共70頁(yè)3）防止培養(yǎng)基滅菌不徹底培養(yǎng)基滅菌方法——高壓蒸汽滅菌分批滅菌121℃，30分鐘連續(xù)滅菌罐溫125－130℃，30－45分鐘第34頁(yè)/共70頁(yè)第35頁(yè)/共70頁(yè)空氣凈化系統(tǒng)第36頁(yè)/共70頁(yè)連續(xù)滅菌設(shè)備流程第37頁(yè)/共70頁(yè)連消塔第38頁(yè)/共70頁(yè)滅菌技術(shù)好壞與滅菌質(zhì)量相關(guān)蒸汽通入培養(yǎng)基，升溫快慢、保溫時(shí)間——產(chǎn)生過(guò)多泡沫蒸汽總壓是否達(dá)到要求標(biāo)準(zhǔn)雜菌數(shù)量：季節(jié)、原材料儲(chǔ)存和保管設(shè)備的清洗質(zhì)量、有無(wú)滅菌的死角第39頁(yè)/共70頁(yè)為什么蒸汽滅菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量泡沫呢？培養(yǎng)基和水的傳熱系數(shù)比空氣的傳熱系數(shù)大，如果滅菌時(shí)升溫太快，培養(yǎng)基急劇膨脹，發(fā)酵罐內(nèi)的空氣排出較慢，就會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，泡沫上升到發(fā)酵罐頂，泡沫中的耐熱菌就不能與蒸汽直接接觸，未被殺死。防止方法：緩慢開(kāi)啟蒸汽閥門，或加入消泡劑第40頁(yè)/共70頁(yè)培養(yǎng)基滅菌不徹底原因蒸氣壓力或蒸氣量不足、滅菌時(shí)間不夠；滅菌時(shí)培養(yǎng)基產(chǎn)泡沫或罐內(nèi)有污垢堆積、或基質(zhì)中有不溶解的固體顆粒；蒸汽短路(1)原料性狀：(2)假壓的形成；(3)參數(shù)不穩(wěn)定（連續(xù)滅菌）；(4)設(shè)備死角(下圖)；

第41頁(yè)/共70頁(yè)生產(chǎn)上常把不能徹底滅菌的部位稱為“死角”

不銹鋼襯里破裂造成“死角”第42頁(yè)/共70頁(yè)發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢罐底的加強(qiáng)板第43頁(yè)/共70頁(yè)法蘭的“死角”a—墊圈內(nèi)徑過(guò)小；b—墊圈內(nèi)徑過(guò)大；c—法蘭不平造成的泄漏與“死角”abc第44頁(yè)/共70頁(yè)滅菌時(shí)蒸汽不易通達(dá)的“死角”及其消除方法第45頁(yè)/共70頁(yè)壓力表安裝不合理形成“死角”1,6—發(fā)酵罐；2—緩沖管；3,4—壓力表；5—旋塞第46頁(yè)/共70頁(yè)消滅死角減少擋板和開(kāi)孔；焊接光滑；法蘭、閥門連接正好；減少殘?jiān)练e；嚴(yán)格清洗和檢查；第47頁(yè)/共70頁(yè)定期檢修易壞部件化學(xué)腐蝕電化學(xué)腐蝕磨蝕設(shè)備加工不良4）防止設(shè)備滲漏包括夾套穿孔、盤管穿孔、接種管穿孔、閥門滲漏、攪拌軸滲漏、罐蓋漏和其它設(shè)備漏等。第48頁(yè)/共70頁(yè)防止設(shè)備滲漏肉眼可見(jiàn)——冷卻盤管、夾套穿孔、閥門滲漏……肉眼不可見(jiàn)——試漏水壓試漏法集氣桶來(lái)試漏第49頁(yè)/共70頁(yè)5）加強(qiáng)操作和衛(wèi)生管理嚴(yán)格操作規(guī)程、保持環(huán)境干凈。提高操作人員素質(zhì)溫度壓力的維持培養(yǎng)基、傳感器第50頁(yè)/共70頁(yè)6）噬菌體污染及其防治措施染噬菌體對(duì)發(fā)酵的影響產(chǎn)生噬菌體的原因：自然界中的噬菌體在活菌體中大量生長(zhǎng)。隨著風(fēng)沙塵土和空氣流動(dòng)傳播，以及人們的走動(dòng)、車輛的往來(lái)也攜帶著噬菌體到處傳播，使噬菌體潛入生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)，尤其是通過(guò)空氣系統(tǒng)進(jìn)入種子室、種子罐、發(fā)酵罐。第51頁(yè)/共70頁(yè)染噬菌體表現(xiàn)為：鏡檢pH值發(fā)酵液能力：殘?zhí)?、產(chǎn)物濃度發(fā)酵液性質(zhì)：泡沫、粘度、氣味OD值CO2，O2第52頁(yè)/共70頁(yè)噬菌體的檢測(cè)方法雙層瓊脂法：在培養(yǎng)皿上倒入培養(yǎng)生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基（加瓊脂）作下層。同樣的培養(yǎng)基中加入20％～30％培養(yǎng)好的種子液，再加入懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，搖均勻后，鋪上層。培養(yǎng)過(guò)夜觀察培養(yǎng)皿上是否出現(xiàn)噬菌斑。也可以在上層培養(yǎng)基中不加懷疑染噬菌體的發(fā)酵液，而將發(fā)酵液直接點(diǎn)種在上層培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)過(guò)夜，觀察有無(wú)透明圈出現(xiàn)。噬菌體的防治車間設(shè)計(jì)地面環(huán)境衛(wèi)生嚴(yán)格無(wú)菌操作認(rèn)真進(jìn)行發(fā)酵罐、補(bǔ)料系統(tǒng)的滅菌廢液滅菌排放選育抗噬菌體的菌種，或輪換使用菌種第54頁(yè)/共70頁(yè)T4的感染過(guò)程吸附侵入復(fù)制與聚集成熟與釋放感染T4后的異?，F(xiàn)象：OD值不升反降；耗糖速度降低；氨氮大量釋放；第55頁(yè)/共70頁(yè)T4感染的防治凈化環(huán)境；光潔地面；嚴(yán)禁活排；消除死角；無(wú)菌室少與外界接觸；使用無(wú)T4的菌株；嚴(yán)格種檢；加強(qiáng)管理；第56頁(yè)/共70頁(yè)改變菌株或篩選抗T4的菌株；藥物防治(利用藥物使T4失活)：(1)螯合劑：抑制吸附或阻止注入；(2)抗生素：抑制T4蛋白質(zhì)的合成；(3)表面活性劑：抑制T4的吸附；(4)N-脂酰氨基酸：抑制T4復(fù)制或子代成熟；(5)聚胺類衍生物：與T4DNA結(jié)合，使T4失活；第57頁(yè)/共70頁(yè)5染菌后的挽救措施染菌時(shí)間染菌程度最大效益第58頁(yè)/共70頁(yè)（1）種子培養(yǎng)期染菌染菌的特點(diǎn)：生產(chǎn)菌少，防御雜菌能力低，容易污染雜菌。染菌后的處理：全部廢棄培養(yǎng)液第59頁(yè)/共70頁(yè)（2）發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。染菌措施補(bǔ)救培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補(bǔ)加一些營(yíng)養(yǎng)，重新接種再用。第60頁(yè)/共70頁(yè)（3）發(fā)酵中期染菌

影響干擾產(chǎn)生菌的代謝改變發(fā)酵液環(huán)境措施

降溫培養(yǎng)，減少補(bǔ)料提前放罐串罐第61頁(yè)/共70頁(yè)（4）發(fā)酵后期染菌已積累大量的產(chǎn)物，特別是抗生素，對(duì)雜菌有一定的抑制或殺滅能力。措施：